一種鹽地堿蓬蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹽地堿蓬蛋白及其編碼基因和應(yīng)用，所述鹽地堿蓬蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼基因的堿基序列如SEQ?ID?No.2所示。所述應(yīng)用包括：提取鹽地堿蓬總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用引物擴(kuò)增所述鹽地堿蓬基因；利用該鹽地堿蓬基因構(gòu)建重組載體，并將該重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入目標(biāo)植物中，獲得轉(zhuǎn)化植物；從轉(zhuǎn)化植物中篩選獲得耐逆性植物。在目標(biāo)植物中高表達(dá)該鹽地堿蓬蛋白，能顯著提高目標(biāo)植物的耐逆性。
【專利說明】—種鹽地堿蓬蛋白及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因組學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鹽地堿蓬蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤鹽潰化對(duì)農(nóng)業(yè)的威脅是一個(gè)全球性的問題。全世界共有10億公頃的鹽堿地，約占世界陸地面積7.6%，我國(guó)鹽堿地近I億多公頃，農(nóng)業(yè)耕地因鹽潰化引起的減產(chǎn)、棄耕地就近333.5萬公頃。近年來，我國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，特別是蔬菜和花卉大棚生產(chǎn)面積不斷擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005年全國(guó)蔬菜、花卉、瓜果等作物設(shè)施栽培面積達(dá)210萬公頃。設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益發(fā)揮了重要作用，但是隨著設(shè)施栽培時(shí)間延長(zhǎng)，土壤次生鹽潰化的問題日益加劇，嚴(yán)重影響了設(shè)施栽培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，效益也隨之下降，從而影響設(shè)施農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。
[0003]解決設(shè)施栽培土壤鹽潰化一般采取以下兩種措施:一是用石膏和硫磺等化學(xué)方法或用排水和灌溉洗鹽等物理方法改良土壤；二是通過常規(guī)育種或生物技術(shù)手段培育耐鹽作物品種，而前者投入成本高。通過培育適宜在鹽堿地區(qū)栽培和設(shè)施栽培的農(nóng)作物抗鹽新品種將不僅能有效解決設(shè)施栽培土壤鹽潰化問題，而且還能通過有效利用部分鹽潰化土地而大大地緩解我國(guó)土地資源匱乏的問題。
[0004]近年來，隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測(cè)序完成，植物基因組學(xué)研究已轉(zhuǎn)入到功能基因組學(xué)。目前一些研究功能基因組學(xué)的新方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系如cDNA微陣列、基因芯片、基因表達(dá)系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、基因敲除(gene knock out)和RNAi分析均能有效分析大量基因的表達(dá)和功能模式,并在耐鹽性相關(guān)功能基因資源發(fā)掘上取得了一定進(jìn)展。一些與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因已從不同植物種類中被成功克隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用， 如脯氨酸合成相關(guān)基因P5CS (KishorPBK, Hong Z, Miao G H，HuCAA, Verma DPS.0verexpression of P5CSincreases proline production and confersosmotolerance in transgenic plants.Plant Physiol, 1995，108:1387-1394)和甜菜喊脫氫酶BADH基因(肖崗，張耕耘，劉鳳華等，山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究，科學(xué)通報(bào)，1995,40(8):741-745)。
[0005]植物體內(nèi)Na+離子平衡是植物自身耐鹽調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。朱健康研究小組發(fā)現(xiàn)擬南芥SOS基因系列的調(diào)控信號(hào)是植物自身調(diào)節(jié)Na+離子平衡的重要途徑之一。2005年，林鴻宣研究小組與美國(guó)欒升教授合作，成功克隆了水稻耐鹽相關(guān)的數(shù)量性狀基因SKC1。該基因能控制水稻植株地上部鈉離子和鉀離子的含量，維持鈉和鉀離子平衡，使過量鈉離子不在莖葉等部位積累，并使鈉離子回流到根部，減輕鈉離子毒害，同時(shí)增加營(yíng)養(yǎng)元素鉀離子，從而增加水稻耐鹽性。
[0006]鹽地堿蓬(Suaeda salsa(L.)Pal1.)是一年生藜科堿蓬屬草本植物，是一種生長(zhǎng)于鹽堿地和海濱沙灘的真鹽生植物。目前，鹽地堿蓬基因組未被測(cè)序，雖有一些基因如SsAPX, SsGST, SsNPS, SsPSI等被克隆，但是大部分基因的序列及功能未知。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種鹽地堿蓬蛋白，在目標(biāo)植物中高表達(dá)該鹽地堿蓬蛋白，能顯著提高目標(biāo)植物的耐逆性。
[0008]一種鹽地堿蓬蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]該鹽地堿蓬蛋白能夠上調(diào)超氧物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶活性，清除因高鹽或低溫脅迫產(chǎn)生過多的活性氧(超氧離子或過氧化氫)，維持細(xì)胞體內(nèi)活性氧水平在正常范圍內(nèi)，保護(hù)幼苗、植株免遭因高鹽或低溫引發(fā)的氧化損傷，提高植物抗逆能力。
[0010]本發(fā)明還提供了所述鹽地堿蓬蛋白的編碼基因，及含有所述編碼基因的表達(dá)單元、重組質(zhì)粒或轉(zhuǎn)化子；所述編碼基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]本發(fā)明還提供了所述鹽地堿蓬基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。
[0012]基于該鹽地堿蓬蛋白的性能，本發(fā)明中所述植物耐逆性為耐高鹽性、和耐旱性中至少一種；所述的植物為雙子葉植物，如擬南芥、草莓、辣椒、茄子、番茄等。本發(fā)明以雙子葉模式植物擬南芥為例對(duì)該鹽地堿蓬基因在提高植物耐逆性中的作用進(jìn)行了檢驗(yàn)，表明該鹽地堿蓬蛋白確實(shí)能顯著提高植物耐高鹽性及耐旱性。
[0013]具體地，所述鹽地堿蓬基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用，包括:
[0014](1)提取鹽地堿蓬總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用引物擴(kuò)增所述鹽地喊蓬基因；
[0015]所述引物的堿基序列為:
[0016]上游引物:5’-TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3’ ；
[0017] 下游引物:5’-GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’ ；
[0018](2)利用該鹽地堿蓬基因構(gòu)建重組載體，并將該重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入目標(biāo)植物中，獲得轉(zhuǎn)化植物；
[0019]所述重組載體的原始載體可選用Super 1300或pCAMBIA1300 ；
[0020](3 )從轉(zhuǎn)化植物中篩選獲得耐逆性植物；
[0021]將轉(zhuǎn)化植物的Tl代種子播種于潮霉素B篩選平板，取陽性植株多代繁殖，獲得穩(wěn)定遺傳的耐逆性植物；優(yōu)選地，所述篩選平板中潮霉素B的濃度為80~100 μ g/mL。
[0022]與野生擬南芥相比，本發(fā)明獲得的T3代穩(wěn)定株系擬南芥能在含200mM氯化鈉的MS固體培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而野生擬南芥則全部白化死亡；對(duì)兩種植株進(jìn)行失水-復(fù)水試驗(yàn)時(shí)，本發(fā)明獲得的T3代穩(wěn)定株系復(fù)水能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而野生擬南芥復(fù)水后無法恢復(fù)正常生長(zhǎng)，且不久后即死亡。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0024]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SEQ ID N0.1所示的鹽地堿蓬蛋白是使鹽地堿蓬具有耐高鹽性的功能蛋白，并將編碼該鹽地堿蓬蛋白的基因(SEQ ID N0.2)轉(zhuǎn)化擬南芥，顯著提高了擬南芥的耐高鹽性和耐旱性；將該鹽地堿蓬基因轉(zhuǎn)化如其他雙子葉植物中，一方面可以增加作物在鹽堿地上的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)我國(guó)濱海地區(qū)鹽堿地的有效利用；另一方面可以克服設(shè)施條件下蔬菜、花卉等植物因土壤返鹽和季節(jié)變化降溫(冬季和早春)引起的生育障礙，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，增加農(nóng)民收入?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]一種鹽地堿蓬基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用，包括:
[0026]I目標(biāo)基因獲取
[0027](I)樣品準(zhǔn)備
[0028]以3周的鹽地堿蓬幼苗為材料，在25°C下水培I周，然后在含400mMNaCl水培液處理24h，收集鹽地堿蓬幼苗的葉片。
[0029](2)蛋白提取 [0030]用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法(參見:Salekdeh G H, Siopongco J, Wade LJjGhareyazie B，Bennett J.A proteomic approach to analyzing drought-andsalt-responsiveness in rice.Field Crop Res，2002，76 (2-3): 199-219)快速提取葉總蛋白，具體操作如下:
[0031]①取Ig潔凈的鹽地堿蓬葉片用液氮研磨成細(xì)粉，分裝入1.5mL離心管中，加入ImL蛋白提取液I (含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液)在-20°c沉淀粗蛋白lh，在4°C、13000r/min下離心20min,取沉淀,棄上清；
[0032]②往沉淀中加入ImL蛋白提取液II (含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液)，在_20°C懸浮粗蛋白Ih,在4°C、13000r/min下離心20min,取沉淀,棄上清,再重復(fù)用蛋白提取液II,在相同條件下懸浮提取3次后，真空抽干沉淀；
[0033]③用裂解液(含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%Chaps (Ameresco公司，美國(guó))、50mmol/L DTT (Promega公司，美國(guó))和0.5%pH3_10的40%兩性電解質(zhì))溶解沉淀，裂解液用量為25 μ L裂解液/mg沉淀，然后在室溫下放置lh，裂解期間不斷渦旋5-6次；
[0034]④根據(jù)Bradford 法(參見:Bradford M M.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal Biochemj 1976，72:248-54)用考馬斯亮蘭 G-250 (Sigma 公司)測(cè)定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用shotgun proteomics方法鑒定；
[0035](3)蛋白分析
[0036]①酶解及肽段提取:用lyg/yL胰酶(Trypsin)對(duì)提取的葉總蛋白進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間20h，于40°C下用50%ACN提取上述酶切肽段I小時(shí)(第一次)，再用相同體積的50%ACN和2.5%TFA (Merk公司，德國(guó))溶液于30°C提取I小時(shí)(第二次)，最后用25 μ I ACN(Fischer公司，美國(guó))超聲提取5min (第三次)，合并3次提取液凍干后，加入0.1%甲酸溶液10 μ L，混勻溶解，轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，備用；②色譜分析:對(duì)步驟①制備的樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，其中，A液為含0.1%甲酸的水溶液，B液為含0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為80%);色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣(上樣量5 μ L);洗脫液為:O~15分鐘，95%Α液；15~45分鐘，B液線性梯度從5%到60% ；45分鐘~50分鐘，B液線性梯度從60%到100% ；50~55分鐘，B液維持在100% ；55~60分鐘，B液線性梯度從100%到5% ；
[0037]③質(zhì)譜分析:對(duì)步驟①制備的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描(full scan)后采集十個(gè)碎片圖譜(MS2Scan),得到的原始文件(raw file)用B10W0RKERS軟件搜索相應(yīng)的庫(kù)，過濾參數(shù)為=Xcorr(1+ ≥ 1.9，2+ ≥ 2.2，3+ ≥ 3.75)并且 DelCn (≥ 0.1)；
[0038]根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)到鹽地堿蓬SsMBTFI蛋白，匹配序列占總氨基酸序列30%。根據(jù)SsMBTFI蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0.1)，通過基因克隆獲得編碼基因(詳見步驟(3) “目標(biāo)基因獲取”，堿基序列如SEQ ID N0.2)。該基因的開放閱讀框(ORF)為399bp，mRNA長(zhǎng)度為1192bp (堿基序列如 SEQ ID N0.3)。
[0039](3)目標(biāo)基因猶取
[0040]以鹽地堿蓬幼苗(播后3周)總RNA (用Trizol試劑提取)為模板，利用RT-PCR法擴(kuò)增SsMBTFI基因，具體操作如下:
[0041 ] ①將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司的HighFidelity PrimerScript? RT-PCR Kit ;反應(yīng)體系為 20 μ L:依次加入 I μ L20M 隨機(jī)引物(Random6mers)、l μ LlOmM dNTP、2 μ L 總 RNA 和 DEPC 水至 10 μ L ;在 65°C 變性 5 分鐘，迅速在冰上冷卻2分鐘,稍微離心,然后依次加入4 μ L5XPrimerScript RT buffer>0.5 μ LRNase inhibitor、。.5 μ L PrimerScript RTase 和 5 μ L DEPC 水；輕微混合均勻，30°C反應(yīng)10分鐘，42°C反應(yīng)30分鐘，95°C 5分鐘使酶失活；
[0042] ②為了去掉與cDNA互補(bǔ)的RNA鏈，加入I μ L RNase H在37°C溫育20min，-20°C
保存；
[0043]③然后以第一鏈cDNA為摸板擴(kuò)增目的基因SsMBTFI，所用引物為:
[0044]SsMBTF1-F:5’ -TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3’ ；
[0045]SsMBTF1-R:5’ -GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’ ；
[0046]PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L:依次加入 2XPCR buffer25 μ L、2.5mM dNTPs4y L、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μ L、20yM 正向引物(SsMBTFl-F)l μ L、20 μ M 反向引物(SsMBTFl-R) I μ L、2.5U/μ LTag DNA聚合酶0.5 μ L，最后加水至50 μ L ;
[0047]PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 940C 3min,變性 98°C 10s，退火 55°C 15s,延伸 72°C 30s, 30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C 10min，4°C保存；
[0048]④擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收純化；
[0049]⑤將回收純化的DNA片段與pMD19-T載體(購(gòu)自TakaRa公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為 10μ L，包括:(λ 5μ L pMD19-T 載體、4.5yL DNA 片段、5 μ L Solution I ;在14°C -16°C下連接8-12小時(shí)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，送測(cè)序;
[0050]⑥經(jīng)測(cè)序正確，用Xba I和Kpn I (購(gòu)自TakaRa公司)進(jìn)行雙酶切，酶切體系為4(^1^，包括4 4 1^10父1311打61'、8 4 1^連接產(chǎn)物、14 1^ Xba IUu LKpn I)和 26 μ L 水，在 37°C水浴中溫育6h ；
[0051]⑦用Agarose Gel Extraction Kit (購(gòu)自TakaRa公司)回收基因片段,操作如下:上述混合DNA經(jīng)凝膠電泳以后，從凝膠上切下所需DNA片段,放在1.5mL的Eppendorf管中；加入3倍體積的Buffer QG-A, 55°C水浴5_10min,期間輕搖Eppendorf管幾次使膠完全溶化，加入2/3回收膠體積的Buffer QG-B ;在空的DNA純化柱中加入250 μ L Buffer BL,1000Og離心lmin，倒掉殘液；將溶解后的DNA膠液倒入DNA純化柱，1000Og離心lmin，倒掉殘液；在純化柱中加入500 μ L Buffer W2, 1000Og離心lmin,倒掉殘液；再在純化柱中加入700 μ L Buffer W2, 100g離心lmin,倒掉殘液；將空的純化柱在15000g下離心2min使其干燥后加入10-15μ L70°C預(yù)熱的無菌水溶解DNA，1000Og離心lmin，所得的溶液即為純化的基因 SsMBTFI。[0052]2構(gòu)建重組載體
[0053]將基因SsMBTFI連入Superl300載體中，連接體系10 μ L，包括:2 μ LSuperl300載體、6 μ L純化的基因SsMBTF、lyL10XT4連接酶buffer和IyL T4連接酶，在4_10°C下連接12h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定為陽性的質(zhì)粒，備用。
[0054]3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0055]①取200 μ I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入5-10 μ I重組陽性質(zhì)粒，30°C冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，然后加入ImL YEB培養(yǎng)基(I升YEB培養(yǎng)基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖和0.5g MgSO4.7%0，？!17.0)，281:培養(yǎng)411 ；
[0056]②1000Og離心30s，棄上清，加入0.1mL YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100 μ g/mL卡那霉素和125 μ g/mL利福平的YEB平板(I升YEB培養(yǎng)基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖、0.5g MgSO4.7H20和12g瓊脂，ρΗ7.0)上，28°C培養(yǎng)約48h ；
[0057]③挑取陽性克隆作為模板，用菌落PCR方法進(jìn)行鑒定；
[0058]④經(jīng)鑒定正確后，將含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落于IOmL YEB培養(yǎng)基(含0.1%酵母提取物、0.5% 牛肉浸膏、0.5% 蛋白胨、0.5% 蔗糖、0.05%MgS04.7Η20、1.2% 瓊脂、100 μ g/mL卡那霉素和125 μ g/mL利福平)中，28°C、200r/min震蕩培養(yǎng)過夜；
[0059]⑤轉(zhuǎn)化前一天按1:50接種于200mL含相同抗生素的YEB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8 ;取菌液，按1%~2%的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，6小時(shí)后，菌液0D_為0.2~0.5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化植物。
[0060]4轉(zhuǎn)化植物
[0061]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，操作如下:
[0062]①取200mL步驟3獲得的OD6tltl為0.2~0.5的農(nóng)桿菌菌液，1000Og離心3min，取沉淀用200mL滲透緩沖液重懸；轉(zhuǎn)化所用滲透緩沖液含有:0.5XMS大量元素、0.5XMS微量元素、0.5mg/L VB5、5% 蔗糖、44nM6-BA (Sigma 公司，美國(guó))和 0.03%Silwet L-77 (LEHLESEEDS公司，美國(guó))；
[0063]②將200mL含目的農(nóng)桿菌的滲透緩沖液置于一容器中，翻轉(zhuǎn)種有擬南芥的花盆，使植株浸入含有待轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的滲透緩沖液中，浸5分鐘，緩慢取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑塑料布避光24小時(shí)，第二天取下塑料布，直立放置花盆；
[0064]③制備MS篩選平板(MS培養(yǎng)基外加80 μ g/mL潮霉素和50 μ g/mL氨芐青霉素)，轉(zhuǎn)化收獲的Tl代種子經(jīng)消毒后播種于MS篩選平板，每個(gè)直徑15cm的平板上可以播種100 μ g左右的擬南芥種子；
[0065]④將MS篩選平板置于4 0C春化3天后，平放在生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)(22 °C恒溫，24h光照)，7-10天后挑選在MS篩選平板上根系和地上部生長(zhǎng)正常的陽性植株，移入正常MS培養(yǎng)基緩苗3-5天后移植入土壤，單株收獲T2代種子；繁種并鑒定至T3代，獲得純合的48個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。
[0066]5功能鑒定
[0067](1)耐鹽功能鑒定[0068]取T3代轉(zhuǎn)基因株系和野生型(ecotype Columbia)擬南芥種子分別用1%次氯酸鈉消毒，在4°C冰箱中春化3天，然后置于溫度22°C、濕度50%、連續(xù)24h光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7d后，觀察幼苗生長(zhǎng)情況；
[0069]待幼苗子葉完全展開后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗移入含200mMNaCl和正常的MS固體培養(yǎng)基(含IX大量元素、I X微量元素、I X鐵鹽、3%蔗糖和0.8%瓊脂)上，然后置于相同光溫條件(22°C、濕度50%、連續(xù)24h光照)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)12-15d后，觀察轉(zhuǎn)基因株系與野生型幼苗在高鹽脅迫下的表型。
[0070]結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，轉(zhuǎn)基因株系幼苗葉片仍保持綠色，說明SsMBTFI基因超量表達(dá)可以緩解擬南芥鹽害，顯著提高擬南芥的耐高鹽性。
[0071](2)耐旱功能鑒定
[0072]從培養(yǎng)皿中挑取播后8-10天的T3代轉(zhuǎn)基因株系和野生型的正常幼苗栽種在預(yù)先裝有80_100g花卉土 (土與蛭石的比例1:1)的小盆中，每小盆種4顆苗；
[0073]然后將小盆置于長(zhǎng)方形的淺盤中，每個(gè)淺盤放12個(gè)小盆，在淺盤中加入一定量的清水，再在12個(gè)小盆上蓋上透明塑料薄膜，置于溫度20°C、光照16h/黑暗8h的溫室中培養(yǎng);
[0074]5-6天后揭膜，根據(jù)土壤干濕情況適當(dāng)補(bǔ)水；以后每天觀察幼苗生長(zhǎng)及病蟲害發(fā)生情況，并進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)水和打藥防止土壤過干和病蟲害的流行；
[0075]生長(zhǎng)3-4周后，此時(shí)擬南芥植株尚未抽苔開花，停止?jié)菜?，讓其土壤自然失水，一周后擬南芥植株葉片開始出現(xiàn)萎蔫失水，然后3天后復(fù)水，讓其恢復(fù)生長(zhǎng)。
[0076]結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型植株葉片萎蔫失水嚴(yán)重，復(fù)水后不能恢復(fù)直至死亡，而轉(zhuǎn)SsMBTFI基因株系葉片表現(xiàn)出暫時(shí)失水，復(fù)水后能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，說明SsMBTFI基因超量表達(dá)可以提聞擬南芥耐旱能力。
【權(quán)利要求】
1.一種鹽地堿蓬蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述鹽地堿蓬蛋白的編碼基因，其特征在于，堿基序列如SEQID N0.2所示。
3.含有如權(quán)利要求2所述編碼基因的表達(dá)單元、重組質(zhì)粒或轉(zhuǎn)化子。
4.如權(quán)利要求2所述鹽地堿蓬基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述耐逆性為耐高鹽性和耐旱性中至少一種。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為雙子葉植物。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括: (1)提取鹽地堿蓬總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用引物擴(kuò)增所述鹽地堿逢基因； (2)利用該鹽地堿蓬基因構(gòu)建重組載體，并將該重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入目標(biāo)植物中，獲得轉(zhuǎn)化植物； (3)從轉(zhuǎn)化植物中篩選獲得耐逆性植物； 所述引物的喊基序列為: 上游引物:5 ’-TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3，； 下游引物:5’-GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中，所述重組載體的原始載體為Superl300 或 pCAMBIA1300。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中，將轉(zhuǎn)化植物的Tl代種子播種于含潮霉素B的篩選平板中，取陽性植株多代繁殖，獲得穩(wěn)定遺傳的耐逆性植物。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述篩選平板中潮霉素B的濃度為80~100 μ g/mL。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103626859SQ201310518684
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】阮松林, 馬華升, 王世恒, 陳文岳, 肖文斐, 裘劼人, 忻雅, 童建新, 王淑珍, 方獻(xiàn)平, 余紅, 張清禹, 來文國(guó), 鄭桂珍 申請(qǐng)人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院