基于基因沉默技術的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因及dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)酶5基因的基因片段及其dsRNA的應用，通過對舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的克隆和測序，得到核苷酸序列為SEQIDNO：1的全長幾丁質(zhì)酶5基因，從中選出序列為SEQIDNO：2的幾丁質(zhì)酶5基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入舞毒蛾的體腔后，舞毒蛾因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
【專利說明】基于基因沉默技術的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因及dsRNA

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及基于基因沉默技術的舞毒蛾致死基因片段Chitinase5及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應用。

【背景技術】
[0002]在我國，化學藥劑連續(xù)單一長期使用已導致昆蟲對多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，例如，對于害蟲舞毒蛾需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外，舞毒蛾還會影響人類健康，當人們直接接觸舞毒蛾時，常會發(fā)生紅腫發(fā)癢現(xiàn)象，嚴重者甚至產(chǎn)生皮疹。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，急需化學農(nóng)藥之外的替代防治手段。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi )是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工成大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學與生理獎。
[0004]在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達進行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。
[0005]幾丁質(zhì)降解和代謝是昆蟲等節(jié)肢動物體內(nèi)特有的生物學現(xiàn)象，由于人類和其他高等動物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質(zhì)酶在昆蟲幾丁質(zhì)的降解過程中起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質(zhì)酶dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的提供一種昆蟲舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因和其致死基因片段，由該基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用。
[0007]本發(fā)明是采用如下技術方案實現(xiàn)的:
一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；是通過設計昆蟲幾丁質(zhì)酶的簡并引物后，PCR擴增獲得其保守區(qū)，通過RACE-PCR擴增獲得全長，命名為LdCHT5。其全長為1895bp，其中可讀框1737bp，編碼578個氨基酸，5丨-UTR和3丨-UTR的長度分別為42bp和116bp。
[0008]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，是根據(jù)SEQ ID NO:1設計上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4，經(jīng)PCR擴增獲得。
[0009]進一步利用相關試劑盒，根據(jù)舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成dsRNA。
[0010]dsRNA在致死害蟲中的應用:注射dsRNA到舞毒蛾的預蛹期幼蟲體腔，結(jié)果表明:在昆蟲體內(nèi)，dsRNA可以特異性的沉默幾丁質(zhì)酶5基因的mRNA表達，致使舞毒蛾因蛻皮困難死亡。
[0011]本發(fā)明設計合理，獲得了舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的致死基因片段，及由該基因片段合成的dsRNA，提供了針對害蟲舞毒蛾的一種生物學防治方法，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟收益，具有市場應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1表示預蛹期舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后對其生長發(fā)育的影響。注射dsRNA的實驗組(圖中A、B)出現(xiàn)蛻皮困難無法化為成蟲而死亡的表型，注射DEPC處理水的對照組(圖中C、D)發(fā)育正常。

【具體實施方式】
[0013]實施例1
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因全長的獲得方法如下:
(1)、PCR引物的設計
根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶5的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物如下:
上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’，
下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ；
(2)、舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因RACE引物的設計基于上述得到的片段設計引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’
所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0014](3)舞毒蛾總RNA的獲得
選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取總RNA，提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒。
[0015](4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成
cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒。
[0016](5)、PCR 擴增
以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶(TIANGEN)說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序。
[0017](6)序列分析
利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因。
[0018]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0019]實施例2
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的獲得方法如下: 根據(jù)實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列,采用primerpremier5.0軟件設計特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO:3，下游引物序列為SEQ ID N0:4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成；其中，上游引物和下游引物需要針對實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列進行設計， 申請人:經(jīng)過對多個上下游引物設計和多個基因片段的認真篩選后，才最終確定了具有實際應用效果的致死基因片段。
[0020]將成功連接實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴增獲得舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，使用MicroElute Cycle Pure Kit(OMEGA)試劑盒進行純化。
[0021]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0022]實施例3
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的dsRNA的獲得
用實施例2獲得的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，按照T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其單一性，用酶標儀(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific,USA)檢測其濃度，并濃縮至終濃度Ιμ8/μ?保存至-80°c備用。
[0023]實施例4
dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用如下:
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的dsRNA的致死舞毒蛾實驗
(I)舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因片段的dsRNA注射
選取預蛹期幼蟲用于注射上述合成的dsRNA。5ul規(guī)格的微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，側(cè)腹部作為注射點，注意避開氣門。注射dsRNA的量為5Pg，并設置注射等量的DEPC處理的水的對照組，實驗組和對照組各20頭。注射完畢后，將幼蟲放置于生化培養(yǎng)箱中用購自中國林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所進行飼養(yǎng)(光照:黑暗時間=16h:8h，溫度 26±1°C，濕度 70%)。
[0024](2)、注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察
幼蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時地觀察。注射dsRNA舞毒蛾的實驗組有部分幼蟲因無法蛻蛹化為成蟲而死亡。
[0025](3)、注入dsRNA后舞毒蛾死亡情況的觀察
注射dsRNA的舞毒蛾實驗組死亡率為25%，這與注射DEPC處理的對照組(死亡率為
1.67%)相比，致死效果明顯。
【權利要求】
1.一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種權利要求1所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)、PCR引物的設計 根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶5的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物如下: 上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’， 下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ； (2)、舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因RACE引物的設計 基于上述得到的片段設計引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG (C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’ (3)、舞毒蛾總RNA的獲得 提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒； (4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成 cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒； (5)、PCR擴增 以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序； (6)、序列分析 利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.一種權利要求2所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: 根據(jù)權利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列，設計上游引物序列為SEQID NO:3，下游引物序列為SEQ ID NO:4 ;將成功連接權利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴增獲得幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，使用MicroElute Cycle Pure Kit試劑盒進行純化。
5.一種根據(jù)權利要求2所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成的dsRNA。
6.權利要求5所述的利用舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成的dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK104293810SQ201410439310
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權日:2014年9月1日
【發(fā)明者】范曉軍, 張建棟, 趙秋勇, 張常, 劉建紅, 糜艷霞 申請人:太原理工大學