豌豆細(xì)菌性疫病菌熒光pcr快速檢測(cè)引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豌豆細(xì)菌性疫病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)引物及試劑盒，所述的引物包括序列為SEQ?ID?NO：1的上游引物和序列為SEQ?ID?NO：2的下游引物。本發(fā)明根據(jù)豌豆細(xì)菌性疫病菌的PSS-EFE基因序列，利用分子生物學(xué)分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為不同豌豆細(xì)菌性疫病菌株系所共有，以保證從種的水平上檢測(cè)不同來源的PSS-EFE基因的可靠性。另外，本發(fā)明的引物采用熒光標(biāo)記，與普通PCR技術(shù)相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)流程一體化封閉檢測(cè)。
【專利說明】豌豆細(xì)菌性疫病菌熒光PCR快速檢測(cè)引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物檢疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豌豆細(xì)菌性疫病菌熒光PCR快速檢測(cè)引物及包含該引物的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豌豆細(xì)菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)是《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中規(guī)定的檢疫性有害生物，在世界各地分布較為廣泛。寄主包括豌豆屬、扁豆屬、香豌豆屬、野豌豆屬、豇豆屬、天藍(lán)苜蓿等植物，可引起葉片、莖、花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導(dǎo)致植株猝倒，對(duì)產(chǎn)量影響較大，是各國(guó)嚴(yán)格限制入境的有害生物之一，也是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性病原細(xì)菌的一種，是進(jìn)出境植物產(chǎn)品特別是豌豆源性產(chǎn)品的重要檢疫對(duì)象。該病害由種子帶菌，即使只有0.01%種子被感染也可導(dǎo)致嚴(yán)重的病發(fā)。
[0003]豌豆細(xì)菌性疫病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)與鑒定方法主要為病菌分離及致病性測(cè)定、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)、脂肪酸甲酯分析及核酸檢測(cè)。分離及致病性測(cè)定一般需要3d以上的時(shí)間才能觀察到有效癥狀。在脂肪酸甲酯分析中，提取細(xì)菌脂肪酸甲酯，用氣相色譜法分析其成份比例，鑒定結(jié)果的敏感度與 致病性測(cè)定方法結(jié)果相同。缺點(diǎn)是檢測(cè)無癥帶菌植株的靈敏度不如選擇性培養(yǎng)基。綜上所述，這些傳統(tǒng)方法方法費(fèi)時(shí)，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；
[0004]乙烯合成酶基因(ethylene-forming enzyme (efe) gene)基因是指作為豌豆細(xì)菌性疫病菌保守程度較高的序列，可被用來進(jìn)行該菌的分子生物學(xué)檢測(cè)和鑒定?，F(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)越來越傾向于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)等分子檢測(cè)手段，該方法較傳統(tǒng)方法快速、靈敏，目前我國(guó)尚未見用熒光PCR方法檢測(cè)豌豆細(xì)菌性疫病菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供豌豆細(xì)菌性疫病菌熒光PCR快速檢測(cè)，即一種能夠通過檢測(cè)豌豆細(xì)菌性疫病菌基因(PSS-EFE)來判斷檢測(cè)樣品中是否存在豌豆細(xì)菌性疫病菌的熒光引物。
[0006]本發(fā)明的熒光引物，包括:
[0007]I)序列為SEQ ID NO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物；
[0008]2)對(duì)I)中的引物對(duì)通過轉(zhuǎn)換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對(duì)，且引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與I)的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生雜交；
[0009]3)在I)或2)所描述的擴(kuò)增片段上設(shè)計(jì)得到的引物對(duì)
[0010]本發(fā)明的豌豆細(xì)菌性疫病菌的熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，包括如下組分
[0011]1)2倍濃度的PCR體系預(yù)混合物；
[0012]2)上游引物和下游引物，濃度分別為lOymol/L ；
[0013]3) 20倍濃度的熒光染料；
[0014]4)DNA 樣品 / 報(bào)告質(zhì)粒，10 μ g/μ L ;[0015]5)雙蒸水。
[0016] 本發(fā)明根據(jù)PSS-EFE基因保守序列，通過分子生物學(xué)分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為具有EFE基因的不同豌豆細(xì)菌性疫病菌株系所共有，以保證從種的水平上檢測(cè)不同來源的PSS-EFE基因的可靠性。另外，本發(fā)明的引物采用熒光標(biāo)記，與普通PCR技術(shù)相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)流程一體化封閉檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]1、本發(fā)明根據(jù)PSS-EFE基因保守序列，通過分子生物學(xué)分析獲得了特異性引物，該引物包括:
[0018]I)序列為SEQ ID NO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物；
[0019]2)對(duì)I)中的引物對(duì)通過轉(zhuǎn)換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對(duì)，且引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與I)的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生雜交；
[0020]3)在I)或2)所描述的擴(kuò)增片段上設(shè)計(jì)得到的引物對(duì)
[0021]2、對(duì)于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了內(nèi)切酶識(shí)別標(biāo)識(shí)片段所形成的長(zhǎng)度不同引物，以及堿基替換、插入、刪除所形成的變異引物。這些由序列為SEQ ID N0:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物所衍生出的引物也能用來檢測(cè)豌豆細(xì)菌性疫病菌，即2)中所描述的衍生引物所擴(kuò)增出的核苷酸片段能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與I)的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生雜交；所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件參照Roche公司的DIG高效DNA標(biāo)記及檢測(cè)StarterKitl手冊(cè)中的雜交條件。
[0022]本發(fā)明的引物用于熒光PCR檢測(cè)PSS-EFE基因，PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下:
【權(quán)利要求】
1.一種豌豆細(xì)菌性疫病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)引物，其特征在于，所述的引物包括序列為SEQ IDNO:1的上游引物和序列為SEQ ID NO:2的下游引物。
2.豌豆細(xì)菌性疫病菌的熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，包括如下組分: 1)2倍濃度的PCR體系預(yù)混合物； 2)上游引物和下游引物，濃度分別為lOymol/L; 3)20倍濃度的熒光染料； 4)DNA樣品/報(bào)告質(zhì)粒，10 yg/μ L 5)雙蒸水。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于上述的DNA樣品/報(bào)告質(zhì)粒中包括序列為SEQ ID NO:3 的 片段。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103966305SQ201310027540
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月25日
【發(fā)明者】鄭媛, 王曼霞 申請(qǐng)人:鄭媛