大草蛉卵黃原蛋白新基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重要天敵昆蟲大草蛉(Chrysopa?septempunctata)卵黃原蛋白基因DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，填補了脈翅目昆蟲卵黃原蛋白基因分子信息的缺乏，為研究卵黃原蛋白基因在大草蛉生殖發(fā)育調(diào)控中的作用機制、卵黃原蛋白基因功能提供了新基因。該發(fā)明將為大草蛉大量繁育和有效利用提供理論基礎(chǔ)，在害蟲生物防治領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】大草蛉卵黃原蛋白新基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種卵黃原蛋白新基因DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黃原蛋白新基因的克隆及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]卵黃原蛋白(Vitellogenin，Vg)是特異地存在于非哺乳類性成熟的卵生雌性動物血液中的一種蛋白， 是幾乎所有卵生動物卵黃蛋白的前體。1969年首次在惜古比天蠶娥(Hyalophora cecropia)中鑒定該蛋白，并將其命名為Vg。昆蟲Vg來源于6_7kb的mRNA編碼而形成的200KD的前體蛋白，經(jīng)修飾后成為由幾個亞基組成的天然的卵黃原蛋白，為正在發(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素、磷、硫及微量元素等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)。
[0003]昆蟲卵黃原蛋白的研究是近年來昆蟲生理學(xué)和生物化學(xué)研究的熱點。到目前為止，已有多種昆蟲的Vg基因被克隆和鑒定，主要包括網(wǎng)翅目、半翅目、鱗翅目及膜翅目等昆蟲，但在脈翅目昆蟲中還沒有Vg基因被克隆。大草蛉是一種重要的脈翅目天敵昆蟲，能夠有效地控制蚜蟲、蚧蟲、粉虱等農(nóng)林害蟲，由于它的取食范圍廣、食量大、分布廣、數(shù)量多而深受國內(nèi)外生防工作者的重視。大草蛉卵黃原蛋白與該天敵昆蟲營養(yǎng)生理和生殖特性緊密相關(guān)，因此，研究大草蛉卵黃原蛋白具有重要意義和應(yīng)用價值。本發(fā)明首先在脈翅目天敵昆蟲大草蛉中發(fā)現(xiàn)、克隆了卵黃原蛋白基因，并對其編碼的氨基酸序列、同源性及進化地位進行了分析，為Vg基因功能及大分子生物進化研究提供了新基因，為該重要天敵昆蟲大量繁育和有效利用提供了理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明包括以下內(nèi)容:
[0005]1.本發(fā)明提供了一種編碼大草蛉卵黃原蛋白的多核苷酸分子SEQ ID N0.1，所述的多核苷酸分子包括與SEQ ID N0.1相符合的核苷酸序列以及與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片斷。
[0006]2.本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
[0007]3.一種卵黃原蛋白基因應(yīng)用的方法，包括通過監(jiān)測卵黃原蛋白基因表達量，來研究卵黃原蛋白含量，從而研究卵黃原蛋白對昆蟲營養(yǎng)和生殖如產(chǎn)卵量影響的方法。
[0008]文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”這一術(shù)語是想包含那些不會導(dǎo)致卵黃原蛋白質(zhì)生物活性降低的氨基酸序列上的變化.這些變化可能包括保守的氨基酸替代
坐寸ο
[0009]有益效果
[0010]1.本發(fā)明公開了一種編碼大草蛉卵黃原蛋白基因(csvg)及其所編碼的蛋白質(zhì)。該基因為大草蛉(Chrysopa septempunctata)中的首次報道,為進一步研究大草蛉卵黃原蛋白基因的表達、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)；為研究卵黃原蛋白基因參與大草蛉生殖發(fā)育、為該重要天敵昆蟲大量繁育和有效利用提供了理論指導(dǎo)；同時該基因功能及其編碼產(chǎn)物研究結(jié)果也可應(yīng)用于其他天敵昆蟲營養(yǎng)和生殖方面的研究，為天敵昆蟲在生物防治以及害蟲的綜合防治中的利用提供理論基礎(chǔ)。
[0011]2.本發(fā)明提供了大草蛉卵黃原蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，該卵黃原蛋白基因為脈翅目昆蟲中首個被克隆的卵黃原蛋白基因，填補了脈翅目昆蟲卵黃原蛋白基因克隆的空白，也為研究大分子進化提供了有用的材料。
[0012]下面將引用非限定性實例對本發(fā)明作進一步的說明。
【具體實施方式】
[0013]實例I
[0014]大草蛉卵黃原蛋白Vg基因cDNA的克隆，通過以下步驟進行:從大草蛉羽化雌性成蟲中提取總RNA ;然后按clontechS' -RACE試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄進行cDNA第一鏈的合成；用簡并引物SI和試劑盒引物擴增大草蛉卵黃原蛋白基因3'-末端片段；純化以上步驟所得PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pMD19-T simple載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細 胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，以M13通用引物對陽性克隆子進行PCR檢測鑒定；根據(jù)克隆測序的結(jié)果，設(shè)計5' -RACE特異性引物，按照clontech5' -RACE試劑盒操作步驟進行5'-末端序列擴增；純化步驟所得PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pMD19-T simple載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，以M13通用引物對陽性克隆子進行PCR檢測鑒定；根據(jù)以上步驟所得的陽性克隆序列測定結(jié)果，將所測得基因序列拼接，得到大草蛉卵黃原蛋白基因全長序列。本發(fā)明大草蛉卵黃原蛋白基因(csvg)DNA序列SEQ ID N0.1，為脈翅目昆蟲中首個被克隆的卵黃原蛋白基因，該基因的序列完整，填補了脈翅目昆蟲卵黃原蛋白基因克隆的空白，也為研究大分子進化提供了有用的材料。BLAST的結(jié)果證明:該卵黃原蛋白基因為一新基因。本發(fā)明提供的大草蛉卵黃原蛋白基因及其所編碼的產(chǎn)物可應(yīng)用于昆蟲營養(yǎng)和生殖方面的研究，同時該發(fā)明也可以應(yīng)用于天敵昆蟲大量擴繁和工廠化生產(chǎn)。
[0015]實例2
[0016]上述獲得的大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黃原蛋白基因csvg的DNA序列SEQ ID NO:1，其編碼的蛋白質(zhì)含有1810個氨基酸，其序列見SEQ ID NO:2。在數(shù)據(jù)庫中比較，卵黃原蛋白基因CSVg編碼的蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫中Lethocerus deyrollei>NiIaparvatalugens、Anopheles gambiae 的相似性分別為 49 %>42 %>40 %,與 Pimpla nipponica、Tribolium castaneum 均在 40%之下。
[0017]實例3
[0018]本發(fā)明如權(quán)利要求1和2所述的應(yīng)用，利用RNAi干擾研究技術(shù)結(jié)果表明，干擾大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黃原蛋白基因后，卵黃原蛋白的表達量(表1),產(chǎn)卵總量以及卵孵化率(表2)都受到較大的影響，因此該發(fā)明對研究卵黃原蛋白基因在大草蛉中的生理功能具有重大意義。
[0019]表1, RNAi干擾Vg后對轉(zhuǎn)錄情況的影響
【權(quán)利要求】
1.一種大草蛉卵黃原蛋白基因Vg的CDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所述。
2.如權(quán)利要求1所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述的大草蛉卵黃原蛋白基因cDNA克隆方法，包括以下步驟: (1)從大草蛉中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA； (2)根據(jù)全變態(tài)昆蟲Vg基因保守序列設(shè)計簡并引物； (3)以步驟⑴得到的cDNA為模板，用步驟⑵所述的引物進行PCR擴增，得到擴增片段； (4)根據(jù)3'末端序列的結(jié)果，設(shè)計5'-RACE特異性引物； (5)按clontechS'-RACE試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄進行cDNA的合成； (6)以cDNA為模板，PCR擴增大草蛉Vg基因的5'-末端序列； (7)將所述基因的3’和5’端片段拼接，得到權(quán)利要求1所述的cDNA。
4.如權(quán)利要求1和2所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用的材料中包含權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列或權(quán)利要求 2所述的蛋白質(zhì)，例如利用RNAI干擾研究技術(shù)研究卵黃原蛋白基因的生理功能。
【文檔編號】C12N15/10GK103966225SQ201310027144
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月25日
【發(fā)明者】曾凡榮, 劉昌燕, 毛建軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所