一重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明“一重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用”涉及一種新的重組α-淀粉酶抑制劑的制備方法、基因序列及應(yīng)用。該重組α-淀粉酶抑制劑對哺乳動物α-淀粉酶有很好的特異性抑制作用，能有效地抑制消化道內(nèi)淀粉酶的活性，減少糖分和能量的攝取，從而降低血糖和減肥，因此該α-淀粉酶抑制劑具有防治糖尿病等的藥用潛力，該α-淀粉酶抑制劑對昆蟲淀粉酶亦有一定的抑制作用，可以應(yīng)用于害蟲防治，所以本發(fā)明將在醫(yī)藥保健和害蟲治理領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的氨基酸和基因序列及其制備和應(yīng)用。屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。發(fā)明涉及微生物源α-淀粉酶抑制劑的氨基酸序列、表達(dá)該抑制劑的基因核苷酸序列；發(fā)明也涉及重組的α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在醫(yī)藥、蛋白質(zhì)農(nóng)藥和害蟲治理中的應(yīng)用；本發(fā)明的應(yīng)用還涉及該α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在減肥、保健食品和飲料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]α-淀粉酶抑制劑是一類可以抑制α-淀粉酶的糖苷水解酶抑制劑，它對哺乳動物和昆蟲α-淀粉酶活性有特異性抑制作用。生物源α-淀粉酶抑制劑大致分4種類型:(I)微生物產(chǎn)含氮碳水化合物；(2)微生物產(chǎn)多肽，如從鏈霉菌S.tendae中分離得到的Tendamistat蛋白質(zhì)；(3)谷類、豆類以及其它較高等植物中發(fā)現(xiàn)的大分子蛋白質(zhì)類α-淀粉酶抑制劑；(4)利用生物技術(shù)制備的工程菌株表達(dá)得到的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)。用工程菌提取的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)方法提取的天然α-淀粉酶抑制劑純度高，來源穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，因此重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在農(nóng)、林業(yè)、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域、食品和飲料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用前景十分廣闊。
[0003]該發(fā)明在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝或裝飾植物害蟲治理中的應(yīng)用:α -淀粉酶抑制劑對某些害蟲的α -淀粉酶 具有抑制作用，將它作為抗蟲基因用于轉(zhuǎn)基因植物來提高植物的抗蟲性；也可將α-淀粉酶抑制劑制成生物農(nóng)藥，其抗蟲性比較穩(wěn)定，在農(nóng)產(chǎn)品中無殘留，有較高的開發(fā)利用價值。
[0004]該發(fā)明在醫(yī)藥上的應(yīng)用:近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人長時間高血糖水平是導(dǎo)致病人多系統(tǒng)和多臟器損害的主要原因，因此，減少淀粉分解為單糖從而降低餐后血糖水平對糖尿病人就顯得十分重要。α-淀粉酶抑制劑能有效地抑制消化道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，從而降低血糖，因此α-淀粉酶抑制劑具有重要的藥用價值潛力，它可用于防治高血糖和糖尿病以及能量過甚引起的高血脂等。同時，大多數(shù)α-淀粉酶抑制劑具有對哺乳動物無毒，在低濃度即可發(fā)揮很高的生物活性等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]該發(fā)明另一個重要應(yīng)用方面是減肥和保健方面。能量攝入過多是引起肥胖的主要原因。α-淀粉酶抑制劑能夠在生物體內(nèi)抑制所攝入食物向能量轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對哺乳動物的α -淀粉酶具有很強(qiáng)的抑制作用，可以特異性的抑制哺乳動物源α-淀粉酶，因此α-淀粉酶抑制劑可以使消費(fèi)者在消費(fèi)含α-淀粉酶活性抑制劑的食品和飲料時減少能量的攝入，從而產(chǎn)生一種有效的減肥、保健方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明包括以下內(nèi)容:
[0007]1.本發(fā)明提供一種編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸分子SEQ ID N0.1，所述的多核苷酸分子包括與SEQ ID N0.1基本相符合的核苷酸序列以及與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片斷。
[0008]2.本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0.2氣基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。及該蛋白質(zhì)的制備方法。該方法包括:
[0009](I)、α-淀粉酶抑制劑基因的克隆:以提取的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增α-淀粉酶抑制劑基因，回收PCR產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定；
[0010](2)、α -淀粉酶抑制劑基因的表達(dá):以鑒定過的陽性克隆為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出α -淀粉酶抑制劑基因全長，與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌種，37°C振蕩培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；
[0011](3)、重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的純化:將含重組質(zhì)粒的工程菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，并將重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)變性，然后利用親和樹脂柱純化α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；
[0012](4)、純化重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)復(fù)性。
[0013]3.本發(fā)明提供 一種表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，其特征在于它含有基本及部分相符合的SEQ ID N0.1多核苷酸分子序列。
[0014]4.一種重組微生物或工程菌株，該重組微生物的特征在于它含有以上I所述的基本及部分相符合的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化得到并表達(dá)該多核苷酸分子，或根據(jù)以上2-3所述的重組微生物,該重組微生物的特征在于它表達(dá)的蛋白質(zhì)含有與SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
[0015]5.一種藥物組合物，其特征在于它含有以上1-4所述的重組微生物或工程菌株的發(fā)酵液或產(chǎn)物。該組合物被用于制備α-淀粉酶抑制劑類的生物農(nóng)藥劑或應(yīng)用于醫(yī)藥和生化領(lǐng)域。
[0016]6.一種生產(chǎn)α -淀粉酶抑制劑的方法，包括在適合于編碼α _淀粉酶抑制劑的多核苷酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)一種以上1-5所述的微生物以及回收和提純重組微生物表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。
[0017]7.一種治理有害昆蟲的方法，所述的方法包括將SEQ ID N0.l作為目的基因?qū)朐吮磉_(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有殺蟲功能的工程菌株，將有效劑量的以上1-6所述的重組微生物及其表達(dá)產(chǎn)物與一種可接受的農(nóng)用載體混合的方式應(yīng)用到害蟲治理中。
[0018]8.一種以上1-3的任何一個的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并表達(dá)該多核苷酸分子的植物，所述的植物可以是易受有害昆蟲攝食而造成損害的任何具有農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝或裝飾價值的植物。該基因可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗蟲性，進(jìn)行植物品種改良。
[0019]9.本發(fā)明得到的基因及其編碼抑制劑蛋白質(zhì)也可以應(yīng)用于醫(yī)藥、蛋白質(zhì)工程，生產(chǎn)含該α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的藥品等，或生產(chǎn)含有以上1-4所述方法任一項制備的重組α -淀粉酶抑制劑的減肥食品、飲料和功能性保健食品產(chǎn)品。
[0020]文中涉及核苷酸序列的地方使用“基本相符”這一術(shù)語是想包含那些不會造成編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變的核苷酸序列的變化。此外，使用這一術(shù)語還想包含那些在特殊體系中需用來增加編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，但這些變化不會導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)生物活性降低的序列上的其它變化。文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”這一術(shù)語是想包含那些不會導(dǎo)致α -淀粉酶抑制劑生物活性降低的氨基酸序列上的變化，這些變化可能包括保守的氨基酸替代等。
[0021]有益效果
[0022]1.本發(fā)明公開了一種α-淀粉酶抑制劑基因(sail基因)及其所編碼的蛋白質(zhì)。該α-淀粉酶抑制劑基因?qū)棣?淀粉酶抑制劑的應(yīng)用如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物以及環(huán)境友好型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供新基因。該基因可作為目的基因?qū)朐吮磉_(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有殺蟲功能的工程菌株用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)農(nóng)藥或用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的開發(fā)。
[0023]2.該發(fā)明有望應(yīng)用于生物途徑生產(chǎn)含該重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的產(chǎn)品。該基因及其編碼的α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)也可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域中α-淀粉酶抑制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用，如本發(fā)明提供的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)可以很好的抑制哺乳動物源α-淀粉酶，可用于制備治療糖尿病 、肥胖癥等的藥物。sail基因及其編碼產(chǎn)物也可用于蛋白質(zhì)工程，生產(chǎn)重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)。
[0024]3.本發(fā)明的重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)能應(yīng)用于減肥食品和飲料、功能性食品和保健食品等產(chǎn)品中，從而產(chǎn)生一種有效、經(jīng)濟(jì)的減肥和保健方法。
[0025]下面將引用非限定性實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)例1:重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備方法
[0027]I)、α -淀粉酶抑制劑基因的克隆:以提取的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增α -淀粉酶抑制劑基因，回收PCR產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定；
[0028]2)、α -淀粉酶抑制劑基因的表達(dá):以鑒定過的陽性克隆為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出α -淀粉酶抑制劑基因全長，與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌種，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，并用SDS-PAGE檢測重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；
[0029]3)、重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的純化:將含重組質(zhì)粒的工程菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)的變性處理，超聲破碎細(xì)胞，離心收集的上清中含有變性的重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)。上清經(jīng)微孔濾膜過濾后，用親和樹脂柱純化α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；
[0030]4)、將變性的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的復(fù)性。
[0031]實(shí)例2:重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在害蟲防治中的應(yīng)用
[0032]重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對棉鈴蟲幼蟲生長的影響:用系列濃度的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)與人工飼料混合，飼喂2齡棉鈴蟲幼蟲。試驗(yàn)設(shè)5個處理(包括I個PBS陰性對照CK)，其中重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)濃度按照倍比稀釋:其濃度分別為5 μ g/g(抑制劑/人工飼料)、10 μ g/g、20 μ g/g、40 μ g/g。不同處理(包括對照CK)分別與人工飼料以1: 10 (v/w)混合均勻，平均分成20等份添于養(yǎng)蟲板中。每孔挑入I頭試蟲，每個處理20頭，重復(fù)3次。96小時后，分別稱量不同處理的棉鈴蟲體重，計算平均單體體重。結(jié)果表明，重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育有較大的影響。經(jīng)方差分析檢測，不同濃度的重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育在0.05水平上有顯著性差異(P < 0.05)。重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)濃度在5~40 μ g/g (抑制劑/人工飼料)時，棉鈴蟲幼蟲平均體重隨濃度的增加而減小，即在此濃度范圍內(nèi)，幼蟲蟲重與重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)濃度為5 μ g/g、10 μ g/g時和濃度為20 μ g/g、40 μ g/g時，差異顯著。
[0033]表1不同濃度重組α -淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對棉鈴蟲幼蟲體重的影響(單位:毫克)
【權(quán)利要求】
1.一種編碼α-淀粉酶抑制劑的多核苷酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所述。
2.如權(quán)利要求1所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述 多核苷酸的表達(dá)載體。
4.一種表達(dá)權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的重組微生物。
5.一種生產(chǎn)權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:包括在適合于權(quán)利要求1所述多核苷酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的重組微生物，以及回收、提純權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)。
6.一種用于防治害蟲的藥物組合物及其在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝或裝飾植物害蟲治理中應(yīng)用的方法，其特征在于該藥物組合含有如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求4所述重組微生物的發(fā)酵液，可抑制某些昆蟲的α-淀粉酶活性和幼蟲生長。所述的方法包括權(quán)利要求4所述的重組微生物及其表達(dá)產(chǎn)物的有效劑量與一種可接受的農(nóng)用載體混合的方式應(yīng)用到害蟲治理中；或?qū)?quán)利要求1基因作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗蟲性等。所述的植物可以是易受有害昆蟲攝食而造成損害的任何具有農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝或裝飾價值的植物。
7.—種藥物組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求4所述重組微生物的發(fā)酵液，該重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)特異性的抑制哺乳動物源淀粉酶，降低小鼠餐后血糖。因此重組α-淀粉酶抑制劑具有很大的潛能用于制備治療糖尿病和肥胖癥的醫(yī)藥藥品等。
8.—種權(quán)利要求3-4中任一項所述方法制備的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在減肥和保健食品以及飲料制備中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求2-4所述任一項方法制備的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征是:該重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)作為添加劑用于面包、餅干等功能性食品和其他保健食品等廣品中。
【文檔編號】C12N15/63GK103966206SQ201310027150
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月25日
【發(fā)明者】曾凡榮, 王曉婧 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所