藥物遞送蛋白質(zhì)的增強(qiáng)運(yùn)輸?shù)耐蛔凅w的分離的制作方法
【專利說(shuō)明】藥物遞送蛋白質(zhì)的増強(qiáng)運(yùn)輸?shù)耐蛔凅w的分離
[0001]政府權(quán)利
[0002]本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研宄院(Nat1nal Institutes of Health)頒發(fā)的資助編號(hào)CA129822和CA140995的政府支持下完成。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明提供了用于細(xì)胞滲透功能以改善藥物向特定細(xì)胞器的遞送的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0004]定向進(jìn)化已經(jīng)被用于產(chǎn)生具有新趨性、減少的非特異性遞送以及免疫逃逸的假型腺聯(lián)病毒(AAV)衣殼(Kwon和Schaffer，2008 ；Maheshri等，2006)。不同選擇壓力下的體外和體內(nèi)的噬菌體展示和全病毒文庫(kù)的生物淘選產(chǎn)生了具有期望特性的蛋白，比如具有增強(qiáng)的配體結(jié)合和攝入、免疫相互作用或酶活性(Yuan等，2005)。因此，對(duì)于用于產(chǎn)生具有改善特征的新蛋白質(zhì)變體的合理突變來(lái)說(shuō)，該方法可能是有力的和更有效的替代方案。該方法的最新開發(fā)的方式采用易錯(cuò)PCR和交錯(cuò)延伸來(lái)產(chǎn)生變體文庫(kù)，該變體文庫(kù)可針對(duì)不同的細(xì)胞類型進(jìn)行篩選，以挑選出細(xì)胞特異性靶向的載體(Zhao等，1998)。迄今為止，尚未開發(fā)出分離具有增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸功能的蛋白質(zhì)變體的方法。本發(fā)明提出了一種新程序，以及從該程序產(chǎn)生的具有增強(qiáng)的用于藥物遞送的細(xì)胞滲透功能的新蛋白質(zhì)分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]各種實(shí)施方式包括一種增強(qiáng)運(yùn)輸至細(xì)胞的方法，包括:提供組合物，該組合物包括具有增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)突變的五鄰體基質(zhì)(PB)蛋白；以及將有效劑量的組合物施用至細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)突變是IllC和/或333F。在另一實(shí)施方式中，組合物靶向至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核。在另一實(shí)施方式中，組合物進(jìn)一步包括治療性藥物。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)突變是SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18, SEQID NO: 19 和 / 或 SEQ ID NO:20。
[0006]其他實(shí)施方式包括生產(chǎn)靶向至細(xì)胞器的藥物遞送分子的方法。該方法包括下述步驟:a)獲得編碼五鄰體基質(zhì)(PB)基因的多核苷酸，并產(chǎn)生多核苷酸的突變體；b)將突變的多核苷酸克隆至噬菌體載體，并產(chǎn)生包括噬菌體載體的噬菌體文庫(kù)；c)用噬菌體文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞；d)分級(jí)分離前述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞收獲細(xì)胞器；e)擴(kuò)增來(lái)自前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體；f)用擴(kuò)增后的來(lái)自前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；g)重復(fù)步驟(d)、(e)、⑴和(g) ;h)滴定來(lái)自每輪的前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體；i)選擇具有最高滴度的噬菌體，并從噬菌體獲得突變的多核苷酸的序列；以及j)產(chǎn)生由前述序列編碼的多肽，其中該多肽是靶向至細(xì)胞器的藥物遞送分子。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞器選自由線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、核糖體、質(zhì)膜和胞質(zhì)溶膠所組合的組。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，使用下述的任何一種或多種產(chǎn)生突變體:基于PCR的方法、化學(xué)誘變、紫外線誘導(dǎo)的誘變或其組合。在另一實(shí)施方式中，藥物遞送分子包括靶向結(jié)構(gòu)域、核內(nèi)體裂解配體結(jié)構(gòu)域和帶正電荷的結(jié)構(gòu)域。
[0007]其他實(shí)施方式包括一種用于將治療劑遞送至細(xì)胞器的載體，所述載體包括由增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)五鄰體基質(zhì)(PB)突變編碼的多肽。在另一實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)五鄰體基質(zhì)(PB)突變包括IllC和/或333F。在另一實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包括聚賴氨酸模體。在另一實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包括調(diào)蛋白的靶向結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)PB突變包括C-末端缺失。
[0008]其他實(shí)施方式包括一種治療劑，該治療劑包括載體和治療性藥物，所述載體用于將治療劑遞送至細(xì)胞器，所述載體包括由增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)五鄰體基質(zhì)(PB)突變編碼的多肽。在另一實(shí)施方式中，治療性藥物是化學(xué)治療劑。
[0009]各種其他實(shí)施方式包括生產(chǎn)不具有增殖活性的載體的方法，包括:a)獲得編碼調(diào)蛋白(Her)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，并在該多核苷酸中產(chǎn)生突變體；b)將突變的Her多核苷酸克隆至噬菌體載體，并產(chǎn)生包括噬菌體載體的噬菌體文庫(kù)；c)在存在有絲分裂抑制劑的情況下，用噬菌體文庫(kù)轉(zhuǎn)化MDA-MB-435細(xì)胞；d)分級(jí)分離前述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并提取MDA-MB-435細(xì)胞的膜級(jí)分；e)從膜級(jí)分收獲膜噬菌體；f)在存在有絲分裂抑制劑的情況下，將膜噬菌體轉(zhuǎn)化為MDA-MB-435細(xì)胞；g)重復(fù)步驟(d)、(e)和(f) ；h)監(jiān)測(cè)每輪的MDA-MB-435細(xì)胞增殖，并選擇具有最低MDA-MB-435細(xì)胞增殖的膜噬菌體；i)在所選擇的膜噬菌體中獲得Her多核苷酸的突變體的序列；以及j)產(chǎn)生由Her序列和五鄰體基質(zhì)基因編碼的多肽，其中該多肽是不具有增殖活性的載體。
[0010]其他實(shí)施方式包括用于將治療劑遞送至細(xì)胞核的載體，其包括由突變的Her序列編碼的多肽。在另一實(shí)施方式中，該載體進(jìn)一步包括編碼五鄰體基質(zhì)(PB)蛋白的多肽，以及聚賴氨酸模體。在另一實(shí)施方式中，PB蛋白是突變體五鄰體基質(zhì)蛋白。
[0011]其他實(shí)施方式包括一種治療劑，其包括載體和治療性藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1表示根據(jù)本文的實(shí)施方式的生物淘選策略；
[0013]圖2表示根據(jù)本文的實(shí)施方式的五鄰體基質(zhì)基因基于PCR的隨機(jī)誘變。基于密度測(cè)定法分析，PCR產(chǎn)物(剛好在1600bp條帶之上)包含10ng DNA，得到約4800ng的總產(chǎn)量。因?yàn)槌跏几颎 DNA是97ng，因此產(chǎn)量/初始量之比是約50并且復(fù)制數(shù)(duplicat1nnumber)是約 5.6，用制造商的規(guī)程(Genemorph II，Strategene, La Jolla, CA，USA)中提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推時(shí)，對(duì)應(yīng)的突變率為?8/kb ；
[0014]圖3表示根據(jù)本文的實(shí)施方式的表達(dá)五鄰體基質(zhì)變體的噬菌體的分離，所述五鄰體基質(zhì)變體向細(xì)胞核區(qū)室的劃分被增強(qiáng)。按照細(xì)胞結(jié)合和攝入部分描述的條件，以lxl0~8pfu將表達(dá)隨機(jī)誘變的PB的T7噬菌體文庫(kù)添加至1χ10~6的HeLa細(xì)胞。通過(guò)胰酶消化去除任何表面結(jié)合的噬菌體來(lái)收獲細(xì)胞，然后使用市售分級(jí)分離試劑盒(QproteomeCell Compartment Kit (細(xì)胞區(qū)室試劑盒)；Qiagen Inc.，Valencia, CA, USA)進(jìn)行分級(jí)分離。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行PEG-沉淀過(guò)夜從而從每個(gè)級(jí)分使噬菌體沉淀，然后再懸浮于TB細(xì)菌培養(yǎng)基中，并且添加至BLT5403細(xì)菌中以擴(kuò)增分離的噬菌體。通過(guò)噬菌斑測(cè)定法來(lái)滴定擴(kuò)增的噬菌體，然后在HeLa上使用如之前描述的相同滴定和條件進(jìn)行再淘選。對(duì)于從細(xì)胞溶質(zhì)級(jí)分獲得的噬菌體，進(jìn)行3輪的細(xì)胞溶質(zhì)生物淘選，而對(duì)于從細(xì)胞核級(jí)分獲得的進(jìn)行2輪；
[0015]圖4表示根據(jù)本文的實(shí)施方式的由生物淘選分離的運(yùn)輸變體的比對(duì)；
[0016]圖5表示根據(jù)本文的實(shí)施方式的全長(zhǎng)突變體IllC展示出增強(qiáng)的向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的運(yùn)輸。圖5(A)通過(guò)丙酮沉淀法從每個(gè)級(jí)分使蛋白質(zhì)沉淀，并且將小球再懸浮在40uL脫鹽緩沖液中，隨后通過(guò)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)和蛋白質(zhì)印記法分析。圖5(B)表示使用Image J進(jìn)行的條帶密度分析，顯示出與野生型蛋白質(zhì)相比，IllC在細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核級(jí)分中都增加。運(yùn)輸和細(xì)胞分級(jí)分離試驗(yàn):將在燒瓶中生長(zhǎng)的粘附HeLa細(xì)胞通過(guò)用5mLlXPBS+2mM EDTA在37°C攪拌孵育50min解粘附，并且轉(zhuǎn)移至15mL圓錐形管。測(cè)量細(xì)胞的密度，并且將細(xì)胞以每管5xl06個(gè)細(xì)胞分散至分開的管。用IX PBS+Ca2++Mg2+洗滌細(xì)胞三次以去除EDTA，并且將細(xì)胞小球再懸浮于0.7ml緩沖液A(20mM HEPES，pH 7.4 ；2mM MgCl2;DMEM中的3%BSA)中。將野生型(WT)或突變體(111C，333F)五鄰體基質(zhì)蛋白(450ug)添加至分開的細(xì)胞等份中，并且將混合物在4°C攪拌孵育2hrs，以促進(jìn)受體結(jié)合，隨后在37攝氏度攪拌孵育2h，以促進(jìn)結(jié)合受體的蛋白質(zhì)的內(nèi)化。對(duì)照處理沒(méi)有接收蛋白質(zhì)(NP)。然后收集并且處理細(xì)胞，以用于使用Qproteome Cel