一種用成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，是將離體的成纖維細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明通過低貼附的物理方法使小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)為三維立體球狀，從而模擬神經(jīng)球的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過三維球狀培養(yǎng)，小鼠成纖維細(xì)胞(胚胎成纖維細(xì)胞和尾尖成纖維細(xì)胞)可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣的細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的制備和應(yīng)用具有重大價(jià)值。
【專利說明】一種用成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新能力以及分化為神經(jīng)系統(tǒng)各類細(xì)胞的能力，在科研與臨床上都具有重要意義。神經(jīng)干細(xì)胞為修復(fù)受損的神經(jīng)組織提供了可能途徑，但是由于神經(jīng)干細(xì)胞的來源受限，大量獲取比較困難。
[0003]細(xì)胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)的出現(xiàn)可以將其他譜系的較容易獲取的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。目前轉(zhuǎn)分化主要采取轉(zhuǎn)基因的方法，但是由于基因組的改變，細(xì)胞面臨癌變的風(fēng)險(xiǎn)，眾多科研人員正在致力于尋找更安全的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，是將離體的成纖維細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到神經(jīng)干細(xì)胞。
[0006]所述懸浮培養(yǎng)是在三維懸浮培養(yǎng)基上進(jìn)行的；所述三維懸浮培養(yǎng)基為在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加瓊脂糖得到的凝膠。
[0007]所述細(xì)胞培養(yǎng)液可為DMEM培養(yǎng)基，具體可為高糖DMEM培養(yǎng)基。
[0008]所述瓊脂糖在所述凝膠中的濃度具體可為0.5g/100mL。
[0009]所述凝膠的制備方法具體如下:將2倍濃度的所述細(xì)胞培養(yǎng)液與瓊脂糖溶液混合，得到混合液；所述混合液凝固后得到所述凝膠。
[0010]所述瓊脂糖溶液具體可為將瓊脂糖溶于DPBS緩沖液得到的溶液。
[0011]所述成纖維細(xì)胞在進(jìn)行所述懸浮培養(yǎng)前，可先進(jìn)行胰酶消化。
[0012]所述胰酶消化采用的消化液的制備方法具體如下:在IOOmL DPBS緩沖液中溶解胰蛋白酶干粉0.25g、EDTA-4Na 0.04g，用0.22 μ m濾膜過濾除菌。
[0013]所述成纖維細(xì)胞可為小鼠成纖維細(xì)胞。所述小鼠成纖維細(xì)胞具體可為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小鼠尾尖成纖維細(xì)胞。
[0014]所述小鼠具體可為 ICR小鼠。
[0015]以上任一所述方法制備得到的神經(jīng)干細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]以上任一所述神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量大于所述成纖維細(xì)胞的細(xì)胞。所述神經(jīng)干細(xì)胞為如下各個(gè)標(biāo)志物中的至少一種:Sox2、Nestin、Pax6、01ig2、Blbp、Nkx2.2、Ascll、Brn2 和 Gpm6a。
[0017]以上任一所述神經(jīng)干細(xì)胞為具有分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元的能力的細(xì)胞。
[0018]所述星形膠質(zhì)細(xì)胞可為表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物GFAP和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物SlOO的細(xì)胞。[0019]所述少突膠質(zhì)細(xì)胞可為表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物04的細(xì)胞。
[0020]所述神經(jīng)元可為表達(dá)神經(jīng)元分化標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0021]細(xì)胞命運(yùn)不僅受內(nèi)部基因的調(diào)控，外部環(huán)境的影響也是很關(guān)鍵的。神經(jīng)干細(xì)胞在體外一般以神經(jīng)球的形態(tài)生長(zhǎng)，本發(fā)明通過低貼附的物理方法使小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)為三維立體球狀，從而模擬神經(jīng)球的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過三維球狀培養(yǎng)，小鼠成纖維細(xì)胞(胚胎成纖維細(xì)胞和尾尖成纖維細(xì)胞)可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣的細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明提供的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的制備和應(yīng)用具有重大價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為實(shí)施例1中對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行電子顯微鏡觀察并拍照的照片。
[0024]圖2為實(shí)施例1中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的定量PCR檢測(cè)的結(jié)果。
[0025]圖3為實(shí)施例1中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果和誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果。
[0026]圖4為實(shí)施例2中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果和誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果。
[0027]圖5為實(shí)施例3中對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行電子顯微鏡觀察并拍照的照片。
[0028]圖6為實(shí)施例2中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的定量PCR檢測(cè)的結(jié)果。
[0029]圖7為實(shí)施例3中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果和誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)志物的免疫熒光染色的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0031]實(shí)施例中的PBS緩沖液均為購(gòu)自Hyclone的貨號(hào)為SH30013.09的ρΗ7.0-7.4的DPBS緩沖液。
[0032]胎牛血清:Gibco。高糖DMEM培養(yǎng)基:Gibco。
[0033]ICR小鼠:購(gòu)自維通利華,名稱為CD-Ιβ (ICR),品系代碼為201。
[0034]GFP轉(zhuǎn)基因的ICR小鼠:購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所，品系名為EGFP。
[0035]雄性SD大鼠:購(gòu)自維通利華，名稱為CD? (SD)，品系代碼為101。
[0036]0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液的制備方法:在IOOmL DPBS緩沖液中溶解胰蛋白酶干粉(sigma) 0.25g、EDTA-4Na 0.04g，用0.22μπι濾膜過濾除菌。
[0037]petri dish (陪替氏培養(yǎng)皿):corning VISTA Petri Dish，貨號(hào) CLS7016560。
[0038]實(shí)施例1、用 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞
[0039]一、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離
[0040]取剛剛死亡的懷孕13.5天的ICR小鼠，75%酒精消毒后，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到IOcm的皿里。用IOmL DPBS緩沖液洗三遍.用剪刀剪開每一側(cè)的胚囊，并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后除去頭、四肢、內(nèi)臟、脊柱、和尾巴。將胚胎剩余部分轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，用IOmL DPBS緩沖液洗三遍，將組織剪碎，加入
0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液(每只胚胎剩余物的組織碎片加lmL)，37°C孵育10分鐘，然后用含10% (體積比)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，吹打胚胎組織，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，250g離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀。用含10% (體積比)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，接種到IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(每?jī)芍慌咛カ@得的細(xì)胞接種一個(gè)皿)，此為PO代細(xì)胞。將PO代細(xì)胞放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)95%以后進(jìn)行1:3傳代，第一次傳代得到Pl代細(xì)胞，第二次傳代得到P2代細(xì)胞。
[0041]二、培養(yǎng)皿的制備
[0042]1、三維懸浮培養(yǎng)皿的制備
[0043]2 X高糖DMEM培養(yǎng)基的制備方法:將13.4g高糖DMEM培養(yǎng)基粉末(Gibco)和3.7g碳酸氫鈉用500mL去離子水溶解，用0.22 μ m濾膜過濾除菌。1%瓊脂糖溶液的制備方法:將Ig瓊脂糖溶于IOOmL DPBS緩沖液，用微波爐加熱至沸騰。
[0044]將I體積份2 X高糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)熱至37 °C，與I體積份1%瓊脂糖溶液混勻，得到混合液；將混合液倒入60mm petri dish (5ml/dish),混合液會(huì)凝成膠狀，附著在petridish底部，得到三維懸浮培養(yǎng)皿。
[0045]2、二維貼壁培養(yǎng)皿的制備
[0046]將高糖DMEM培養(yǎng)基倒入60_ petri dish (5ml/dish),得到二維貼壁培養(yǎng)皿。
[0047]三、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
[0048]1、小鼠胚胎成纖 維細(xì)胞的三維懸浮培養(yǎng)
[0049]將步驟一得到的P2代細(xì)胞用DPBS緩沖液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA混合消化液消化，然后接種到步驟二得到的三維懸浮培養(yǎng)皿的凝膠表面(6X IO6個(gè)/皿)，放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，用電子顯微鏡觀察并拍照。
[0050]2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的二維貼壁培養(yǎng)
[0051]將步驟一得到的P2代細(xì)胞用DPBS緩沖液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA混合消化液消化，接種到二維貼壁培養(yǎng)皿上(5X IO5個(gè)/皿)，放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，用電子顯微鏡觀察并拍照。
[0052]結(jié)果見圖1，A為二維貼壁培養(yǎng)的照片，B為三維懸浮培養(yǎng)的照片，標(biāo)尺為200 μ m。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在二維貼壁培養(yǎng)后仍然成單層纖維狀生長(zhǎng)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在三維懸浮培養(yǎng)后形成三維球狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:在傳統(tǒng)的二維貼壁培養(yǎng)中，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞會(huì)沉降于培養(yǎng)皿底部，在底部進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)；在三維懸浮培養(yǎng)中，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞接種于三維懸浮培養(yǎng)皿的凝膠表面，由于凝膠的存在，細(xì)胞不會(huì)由于重力沉降于培養(yǎng)皿底部，而是在凝膠中上部懸浮生長(zhǎng)，成為三維球狀細(xì)胞。
[0053]四、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的定量PCR檢測(cè)
[0054]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行如下鑒定:提取的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用Power SYBR Green RT-PCRKit (Applied Biosystems)進(jìn)行突光定量PCR反應(yīng)，分別鑒定各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Sox2、Nestin、Pax6、01ig2、Blbp、Nkx2.2、Ascll、Brn2 和 Gpm6a)的表達(dá)情況。
[0055]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2的編碼基因的引物對(duì)如下:[0056]Fl: 5 ’ -CTGGACTGCGAACTGGAGAAG-3 ’ ；
[0057]Rl:5 ’ -TTTGCACCCCTCCCAATTC-3，。
[0058]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0059]F2:5，-TCTTCCCCCTTGCCTAATACC-3，；
[0060]R2:5，-TTAGGATAGGGAGCCTCAGACATAG-3，。
[0061]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Pax6的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0062]F3:5，-ACCTGTCTCCTCCTTCACATCAG-3’ ；
[0063]R3:5，-TTGGTGAGGGCGGTGTCT-3，。
[0064]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物01ig2的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0065]F4:5 ’ -CTGGCGCGAAACTACATCCT-3，；
[0066]R4:5 ’ -GCTCACCAGTCGCTTCATCTC-3’。
[0067]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Blbp的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0068]F5:5，-CGCAACCTGGAAGCTGACA-3 ’ ；
[0069]R5:5，-GCCCAGAGCTTTCATGTACTCA-3 ’。
[0070]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.2的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0071]F6:5，-ATCCCCTTTTCCGCCTACAG-3，；
[0072]R6:5 ’ -CTGGGCGTTGTACTGCATGT-3，。
[0073]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Ascll的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0074]F7:5，-TCGTCCTCTCCGGAACTGAT-3，；
[0075]R7:5，-TAGCCGAAGCCGCTGAAGT-3 ’。
[0076]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Brn2的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0077]F8:5，-GCGCTTGGCACCCTGTAC-3，；
[0078]R8:5，-GCCTCAAACCTGCAGATGGT-3，。
[0079]用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Gpm6a的編碼基因的引物對(duì)如下:
[0080]F9:5，-TCTGCCGGAACACCACTCTAG-3 ’ ；
[0081 ] R9:5 ’ -AACTGACGCAGATCCAAGCA-3 ’。
[0082]以完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量作為1，計(jì)算完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中各個(gè)相應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維懸浮培養(yǎng)后，顯著上調(diào)了細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Sox2、Nestin、Pax6、01ig2、Blbp、Nkx2.2、Ascll、Brn2 和 Gpm6a)的水平。
[0083]五、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色
[0084]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行如下免疫熒光染色鑒定:采用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40分鐘，用DPBS緩沖液清洗兩遍?’然后用0.l%Triton X-100透化處理5分鐘，用DPBS緩沖液清洗兩遍；然后用含10%馬血清和
0.l%Triton X-100的DPBS緩沖液將細(xì)胞4°C孵育過夜；然后加入用DPBS緩沖液稀釋的一抗，37°C孵育2小時(shí)，用DPBS緩沖液清洗三遍；然后加入用DPBS緩沖液稀釋的二抗，37°C孵育40分鐘，然后含I μ g/ml染料Hoechst 33342的DPBS緩沖液37°C孵育20分鐘，用DPBS緩沖液清洗三遍后拍照。
[0085]一抗及其稀釋比例如下:[0086]用于檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2的一抗:購(gòu)自Invitrogen, 1:50稀釋。
[0087]用于檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的一抗:購(gòu)自eBioscience, 1:50稀釋。
[0088]照片見圖3，標(biāo)尺為100 μ m，A和B為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的檢測(cè)結(jié)果，C和D為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2的檢測(cè)結(jié)果，A、C為二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果，B、D為三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中，均未檢測(cè)到各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物。三維懸浮培養(yǎng)7天的細(xì)胞中，Nestin和Sox2顯示陽性染色。
[0089]六、分化標(biāo)志物的檢測(cè)
[0090]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行如下操作:
[0091]1、將細(xì)胞消化后接種在包被了 0.001g/100mL多聚鳥氨酸(Sigma，P4957)和IOng/HiL層粘連蛋白(Sigma，L2020)的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+B27，B27購(gòu)買于Life Technologies，貨號(hào)17504-044，使用時(shí)原液稀釋50倍)中培養(yǎng)2周，培養(yǎng)是在于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。
[0092]2、將完成步驟I的培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，方法參見步驟五，差異僅在于采用針對(duì)分化標(biāo)志物(Tujl、GFAP、04)的一抗。
[0093]一抗及其稀釋比例如下:
[0094]用于檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志物Tujl的一抗:購(gòu)自Millipore, 1:500稀釋；
[0095]用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物GFAP的一抗:購(gòu)自Millipore, 1:500稀釋；
[0096]用于檢測(cè)少突膠質(zhì) 細(xì)胞分化標(biāo)志物04的一抗:購(gòu)自Sigma，1:200稀釋。
[0097]照片見圖3，標(biāo)尺為100 μ m，E和F為分化標(biāo)志物Tujl的檢測(cè)結(jié)果，G和H為分化標(biāo)志物GFAP的檢測(cè)結(jié)果，I和J為分化標(biāo)志物04的檢測(cè)結(jié)果，E、G和I為二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果，F(xiàn)、H和J為三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行步驟I后，均未檢測(cè)到各個(gè)分化標(biāo)志物。三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行步驟I后，分化標(biāo)志物(Tujl、GFAP、04)均顯示陽性染色結(jié)果，即三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞具有向神經(jīng)系統(tǒng)三個(gè)譜系細(xì)胞分化的能力。
[0098]實(shí)施例2、用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)
[0099]一、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離
[0100]用GFP轉(zhuǎn)基因的ICR小鼠代替ICR小鼠，其它完全同實(shí)施例1的步驟一。
[0101]二、培養(yǎng)皿的制備
[0102]同實(shí)施例1的步驟二。
[0103]三、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
[0104]同實(shí)施例1的步驟三。
[0105]四、體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)
[0106]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行如下鑒定:
[0107]1、將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化后用DPBS緩沖液重懸，得到5X IO4Cells/μ I的細(xì)胞懸液。
[0108]2、使用10%水合氯醛將成年雄性SD大鼠(230 - 250g)麻醉(400mg/kg)，使用立體定位儀，以Bregma點(diǎn)為零點(diǎn)后移5.0mm、旁開2.5mm、深度3.5mm,向大鼠腦部注射10 μ I步驟I得到的細(xì)胞懸液。從注射細(xì)胞前一天到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天給大鼠注射環(huán)孢素A(15mg/kg/day)。注射細(xì)胞懸液4周后將大鼠進(jìn)行灌注和大腦取材，冰凍切片并免疫染色。
[0109]染色時(shí)采用的一抗及其稀釋比例如下:
[0110]用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物GFAP的一抗:購(gòu)自Millipore，l:200稀釋；
[0111]用于檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志物NeuN的一抗:購(gòu)自Millipore, 1:50稀釋；
[0112]用于檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志物MAP2的一抗:購(gòu)自Sigma，1:200稀釋；
[0113]用于檢測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物04的一抗:購(gòu)自Sigma, 1:200稀釋。
[0114]用于檢測(cè)綠色突光蛋白GFP的一抗:購(gòu)自Abeam, 1:400稀釋。
[0115]結(jié)果見圖4，標(biāo)尺為100μπι。二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞移植后存活數(shù)量較少且不能分化為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，如圖Α，C，E和G所示。三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞移植到大鼠海馬區(qū)域后具有較強(qiáng)的生存能力，并且能分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，如圖B，D，F(xiàn)和H所示。
[0116]實(shí)施例3、用小鼠尾尖成纖維細(xì)胞制備神經(jīng)干細(xì)胞
[0117]一、小鼠尾尖成纖維細(xì)胞的分離
[0118]取剛剛死亡的出生24小時(shí)的 ICR小鼠，75%酒精消毒后，從尾尖游離端開始計(jì)量，取1/4-1/5位置，用剪刀剪碎，剪碎的組織塊接種到IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞會(huì)逐漸從組織塊中爬出，此為PO代細(xì)胞。于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PO代細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)95%以后進(jìn)行1:3傳代，第一次傳代得到Pl代細(xì)胞，第二次傳代得到P2代細(xì)胞，第三次傳代得到P3代細(xì)胞。
[0119]二、培養(yǎng)皿的制備
[0120]同實(shí)施例1的步驟二。
[0121 ] 三、小鼠尾尖成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
[0122]1、小鼠尾尖成纖維細(xì)胞的三維懸浮培養(yǎng)
[0123]將步驟一得到的P3代細(xì)胞用DPBS緩沖液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA混合消化液消化，然后接種到步驟二得到的三維懸浮培養(yǎng)皿的凝膠表面(6X IO6個(gè)/皿)，放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，用電子顯微鏡觀察并拍照。
[0124]2、小鼠尾尖成纖維細(xì)胞的二維貼壁培養(yǎng)
[0125]將步驟一得到的P3代細(xì)胞用DPBS緩沖液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA混合消化液消化，接種到二維貼壁培養(yǎng)皿上(5X IO5個(gè)/皿)，放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，用電子顯微鏡觀察并拍照。
[0126]結(jié)果見圖5，A為二維貼壁培養(yǎng)的照片，B為三維懸浮培養(yǎng)的照片，標(biāo)尺為200 μ m。小鼠尾尖成纖維細(xì)胞在二維貼壁培養(yǎng)后仍然成單層纖維狀生長(zhǎng)，小鼠尾尖成纖維細(xì)胞在三維懸浮培養(yǎng)后形成三維球狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:在傳統(tǒng)的二維貼壁培養(yǎng)中，小鼠尾尖成纖維細(xì)胞會(huì)沉降于培養(yǎng)皿底部，在底部進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)；在三維懸浮培養(yǎng)中，小鼠尾尖成纖維細(xì)胞接種于三維懸浮培養(yǎng)皿的凝膠表面，由于凝膠的存在，細(xì)胞不會(huì)由于重力沉降于培養(yǎng)皿底部，而是在凝膠中上部懸浮生長(zhǎng)，成為三維球狀細(xì)胞。
[0127]四、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的定量PCR檢測(cè)
[0128]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行如下鑒定:提取的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用Power SYBR Green RT-PCRKit (Applied Biosystems)進(jìn)行突光定量PCR反應(yīng)，分別鑒定各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Sox2、Nestin、Pax6、01ig2、Blbp、Nkx2.2、Ascll 和 Brn2)的表達(dá)情況。
[0129]采用的引物同實(shí)施例1的步驟四。
[0130]以完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量作為1，計(jì)算完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中各個(gè)相應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，將小鼠尾尖成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維懸浮培養(yǎng)后，顯著上調(diào)了細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Sox2、Nestin、Pax6、Blbp、Nkx2.2、Ascll 和 Brn2)的水平。
[0131]五、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色
[0132]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，方法同實(shí)施例1的步驟五。
[0133]照片見圖7，標(biāo)尺為100 μ m，A和B為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的檢測(cè)結(jié)果，C和D為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2的檢測(cè)結(jié)果，A、C為二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果，B、D為三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中，均未檢測(cè)到各個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物。三維懸浮培養(yǎng)7天的細(xì)胞中，Nestin和Sox2顯示陽性染色。
[0134]六、分化標(biāo)志物的檢測(cè)
[0135]分別將步驟三中完成三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和完成二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分化標(biāo)志物的檢測(cè),方法同實(shí)施例1的步驟六。
[0136]一抗及其稀釋比例如下:
[0137]用于檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志物Tujl的一抗:購(gòu)自Millipore, 1:500稀釋；
[0138]用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物SlOO的一抗:購(gòu)自Sigma，1:50稀釋；
[0139]用于檢測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物04的一抗:購(gòu)自Sigma，1:200稀釋。
[0140]照片見圖7，標(biāo)尺為100 μ m，E和F為分化標(biāo)志物Tujl的檢測(cè)結(jié)果，G和H為分化標(biāo)志物SlOO的檢測(cè)結(jié)果，I和J為分化標(biāo)志物04的檢測(cè)結(jié)果，E、G和I為二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果，F(xiàn)、H和J為三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。二維貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行步驟I后，均未檢測(cè)到各個(gè)分化標(biāo)志物。三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行步驟I后，分化標(biāo)志物(Tujl、S100、04)均顯示陽性染色結(jié)果，即三維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞具有向神經(jīng)系統(tǒng)三個(gè)譜系細(xì)胞分化的能力。
【權(quán)利要求】
1.一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，是將離體的成纖維細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到神經(jīng)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述懸浮培養(yǎng)是在三維懸浮培養(yǎng)基上進(jìn)行的；所述三維懸浮培養(yǎng)基為在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加瓊脂糖得到的凝膠。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述凝膠的制備方法如下:將2倍濃度的所述細(xì)胞培養(yǎng)液與瓊脂糖溶液等體積混合，得到混合液，所述混合液凝固后得到所述凝膠。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述瓊脂糖在所述凝膠中的濃度為0.5g/100mL。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞在進(jìn)行所述懸浮培養(yǎng)前，先進(jìn)行胰酶消化。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述小鼠成纖維細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小鼠尾尖成纖維細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1至7中任一所述方法`制備得到的神經(jīng)干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0797GK103865875SQ201210552280
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】蘇冠男, 趙燕南, 魏建樹, 肖志峰, 陳冰, 戴建武 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所