專利名稱：一種檢測磷酸鹽的微生物細胞傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水體中磷酸鹽含量的微生物細胞傳感器的搭建及使用。
背景技術(shù)：
隨著社會經(jīng)濟不斷發(fā)展和全球工業(yè)化程度的提高，全球許多河流遭受不同程度的污染，其中水體中磷酸鹽含量過高導致水體富營養(yǎng)化是比較常見的污染現(xiàn)象。富營養(yǎng)化導致藻類和大型植物迅速生長，深水中溶解氧變少，透明度降低，最終導致水體中生態(tài)系統(tǒng)的惡化。因此對水體中的磷酸鹽含量必須進行檢測控制。利用微生物細胞傳感器檢測環(huán)境中特定物質(zhì)含量是近年來興起的一種新的檢測方法
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明檢測磷酸鹽的微生物細胞傳感器是利用大腸桿菌中堿性磷酸酶基因啟動子與商業(yè)化質(zhì)粒中信號強度高的熒光素酶報告基因(Iuc) —起構(gòu)建出的一種有效檢測磷酸鹽含量的微生物細胞傳感器。構(gòu)建該細胞傳感器的具體操作步驟為I、含有終止子的質(zhì)粒的搭建對pUC19質(zhì)粒用PstI與HindIII進行雙酶切處理后純化得到載體a ；以大腸桿菌基因組為模板，擴增得到大腸桿菌終止子，用上述兩種酶進行雙酶切處理后純化得到片段r ;將片段r連入載體a，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化得到含有終止子的質(zhì)粒；2、含有大腸桿菌堿性磷酸酶基因啟動子的質(zhì)粒的搭建對含有終止子的質(zhì)粒用EcoRI與XmaI進行雙酶切處理后純化得到載體b ；以大腸桿菌基因組為模板，擴增得到大腸桿菌堿性磷酸酶基因啟動子，用上述兩種酶進行雙酶切處理后純化得到片段η ;將片段η連入載體b，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化得到含有大腸桿菌堿性磷酸酶基因啟動子的質(zhì)粒；3、目標質(zhì)粒的搭建對含有大腸桿菌堿性磷酸酶基因啟動子的質(zhì)粒用PstI與XmaI進行雙酶切處理后純化得到載體c ;以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模板，擴增得到熒光素酶報告基因，用上述酶進行雙酶切處理后純化得到片段u ;將片段u連入載體C，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化得到目標質(zhì)粒；4、得到檢測磷酸鹽的微生物細胞傳感器利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細胞為宿主，將目標質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞得到檢測磷酸鹽的微生物細胞傳感器。以下通過具體實事例詳細說明發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例I :第一步接種單菌落(載體細胞空白同時接種)于50ml三角瓶中；氨芐青霉素終濃度為100 μ g/ml ；37度過夜培養(yǎng)；
第二步5ml的LB培養(yǎng)基加入設(shè)定濃度的誘導物(如磷酸根標準溶液濃度100 μ Μ)；第三步菌體培養(yǎng)至0D600 = I. 2 ；第四步稀釋到0D600 = O. 4，取5ml的稀釋好的培養(yǎng)液加入第二步準備好的培養(yǎng)液中；23度誘導；第五步對于細菌，將40 μ I未轉(zhuǎn)化細胞(載體細胞)與50 μ I轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物混合(細胞濃度相同)加入10 μ IIM K2HPO4 (ρΗ7· 8)，20mM EDTA ( 一個溶液)。用-70度冰箱快速冷凍混合物(凍融)(IOmin)，然后將細胞轉(zhuǎn)移至室溫并置于室溫水浴中(23度或置于室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ I新鮮配制的裂解混合物(見附錄)?；旌喜⒂谑覝胤跤?0分鐘；第五步檢測；每個96孔板中加入20 μ I的裂解液后，加入100 μ I熒光素酶檢測 液，立刻檢測；第六步數(shù)據(jù)處理，得到數(shù)據(jù)與空白對照的差值，然后改差值乘以400得到即為每毫升菌液對應的數(shù)值。附錄10毫升裂解混合物配方5. 5ml 水2ml5XCCLR加入25mg BSA2. 5ml 溶菌酶混合液(配 5ml 配方0. 5mllM K2HPO4 (ρΗ7· 8)，20mM EDTA+4. 5ml 無菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均勻。
權(quán)利要求
1.一種微生物傳感器，由大腸桿菌作基本材料，通過基因工程手段構(gòu)建用來檢測水體中磷酸鹽的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物傳感器，其特征在于檢測物質(zhì)為磷酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明是利用大腸桿菌堿性磷酸酶基因啟動子與熒光素酶基因(luc)構(gòu)建于大腸桿菌中的一種傳感器，用于水體中磷酸鹽含量的檢測。本發(fā)明介紹了該傳感器的搭建以及使用。
文檔編號C12R1/19GK102911963SQ201210465640
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者莊國強, 崔萌萌, 馬安周, 于清, 齊鴻雁 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心