專利名稱：一種目的蛋白制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技木，特別涉及ー種目的蛋白制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，ー些具有生物活性的小分子多肽如胸腺肽等受到高度重視。胸腺肽是由胸腺產(chǎn)生的ー種蛋白質(zhì)和多肽激素。早在20世紀(jì)60年代，Miller等人(Lancet, 1961，2:748 一 749.)就發(fā)現(xiàn)胸腺肽對(duì)免疫系統(tǒng)有重要作用，并從中分離到ー組分子量為1000 — 15000D的多肽混合物，稱為胸腺肽組分5 (thymosin fraction 5，TF5)；隨后 Goldstein 等人(Proc. Natl. Acad. Sc1. USA , 1966, 56: 1010 - 1017)從牛胸腺抽提物的TF5分離出ー種酸性多肽a I組分(thymosin a 1，T a 1)，T a I是TF5的主要活性組分，在哺乳動(dòng)物中異常保守，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的胸腺、脾、肺、腎、腦、血液和其他組織中，在胸腺中濃度最高。 目前，活性多肽的制備多數(shù)采用化學(xué)合成或生物組織提取的方法，作為活性多肽的胸腺肽也不例外。臨床上廣泛應(yīng)用的用各種改良方法制備的胸腺肽類制劑大多是從動(dòng)物組織中提取的多種肽類的混合物，不同公司生產(chǎn)的胸腺肽類制劑的活性相差甚遠(yuǎn)，而有的因生產(chǎn)エ藝或質(zhì)量問(wèn)題使產(chǎn)品中含有?；蜇i等蛋白，注射時(shí)可產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。因此，有人采用人胚胎胸腺作為原料，制備出人胸腺肽a I組分(thymosin a 1，T a 1)，療效不錯(cuò)。但由于人胚胎來(lái)源困難，價(jià)格昂貴，而且Ta I含量很少。隨著人類基因組計(jì)劃的不斷實(shí)施，胸腺肽的氨基酸序列順序可以輕易獲得，使化學(xué)合成類似胸腺肽的活性多肽成為可能。國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究組，比如Wang S S等、黃臻輝、苷一如等、程虎等(Int J Pept Res, 1992,40(3 -4) :344 ;藥物生物技術(shù)，2001，8(4) :207 ;化工學(xué)報(bào)，2004，55 (2) : 305 ;南京エ業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004, 26(2):78)采用不同的固相方法以及適宜的技術(shù)進(jìn)行了 Ta I的合成和エ藝優(yōu)化，但是化學(xué)合成エ藝始終解決不了成本高、產(chǎn)量低、純度差與活性低的難題。為了獲得質(zhì)量高、療效好的胸腺肽類制劑，科學(xué)家開始探索應(yīng)用基因工程方法制備胸腺肽，并引起了針對(duì)Ta I的廣泛研究[1，2，7]。與化學(xué)合成方法或組織提取方法相比，基因工程方法用于生產(chǎn)Ta I制品在降低成本、提高產(chǎn)量、減少毒性副產(chǎn)物或恢復(fù)生物活性方面具有一定的優(yōu)勢(shì)和改良，但是，由于融合表達(dá)使目的肽在融合蛋白中所占比例小，造成宿主表達(dá)潛能浪費(fèi)，而減小標(biāo)簽蛋白長(zhǎng)度又降低融合蛋白穩(wěn)定性。因此，無(wú)論是單獨(dú)表達(dá)或是與標(biāo)簽蛋白形成融合改善細(xì)胞毒性作用的表達(dá)方式，都不能從根本上解決產(chǎn)量問(wèn)題，難以作為大規(guī)模生產(chǎn)的エ藝技術(shù)進(jìn)ー步推廣。上述單拷貝或融合表達(dá)所存在的問(wèn)題，可將多肽基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)而得以解決
(I)串聯(lián)增加了多肽基因數(shù)量，有利于提高表達(dá)量；(2)串聯(lián)多聚體形式的表達(dá)可有效屏蔽宿主毒性；(3)多聚體表達(dá)產(chǎn)物更穩(wěn)定。因此，對(duì)Ta I多肽采用構(gòu)建多聚體的方法對(duì)于提高表達(dá)量具有突出的優(yōu)勢(shì)。迄今，多種肽的多聚體、多拷貝形式已獲得成功表達(dá)[8_11]。國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)的兩篇報(bào)道中提及Ta I的定向多拷貝克隆制備方案，其一采用基因片段隨機(jī)退火和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法構(gòu)建了 3個(gè)拷貝的Ta I串聯(lián)構(gòu)建體[28];其二采用表達(dá)盒串聯(lián)法構(gòu)建了含有I 一 8 個(gè)拷貝Ta I完整表達(dá)盒的構(gòu)建體[29]。在第一種方法中，傳統(tǒng)的PCR方法雖然簡(jiǎn)便易行，但是作者未考慮到串聯(lián)構(gòu)建體表達(dá)之后的單體切割問(wèn)題，僅單純從技術(shù)方法探討了該方法的可行性。第二種方法雖然可以獲得比較高拷貝的串聯(lián)構(gòu)建體，各表達(dá)盒獨(dú)立表達(dá)多肽產(chǎn)物而規(guī)避了后續(xù)的多肽切割步驟，但是Ta I單體表達(dá)產(chǎn)物分子量太小，容易被降解而難以實(shí)現(xiàn)表達(dá)量的提升。
因此，目前需要一種構(gòu)建高效表達(dá)胸腺肽制品的基因工程方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效表達(dá)目的蛋白的基因工程方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案，包括以下步驟目的蛋白的核苷酸序列片段的獲得；目的蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建；目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；目的蛋白的純化；純化產(chǎn)物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入單一切割位點(diǎn)；所述目的蛋白通過(guò)合成編碼鏈和模板鏈，將兩者雜交獲得，在合成編碼鏈和模板鏈時(shí)引入單體切割的識(shí)別位點(diǎn)；優(yōu)選地，所述目的蛋白是人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮(zhèn)痛肽。
在切割步驟后還可以包括進(jìn)一步純化的步驟，優(yōu)選是為采取HPLC純化。
還可以包括目的蛋白活性測(cè)定。
所述目的蛋白基因是一或多個(gè)拷貝；優(yōu)選地，所述目的蛋白基因的多拷貝數(shù)通過(guò)將目的蛋白基因片段進(jìn)行體外串聯(lián)連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。
所述的單一切割位點(diǎn)是根據(jù)密碼子規(guī)則編碼的氨基酸序列；優(yōu)選地，所述氨基酸序列為R或W或M或D或E或K。所述的英文大寫字母為氨基酸的代碼，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸，M表示甲硫氨酸，D表示天冬氨酸，E表示谷氨酸，K表示賴氨酸,遵守20 種氨基酸的密碼子表。
所述目的蛋白基因的核苷酸序列片段的獲得為，合成目的蛋白基因模板鏈和編碼鏈；經(jīng)過(guò)變性退火處理將編碼鏈和模板鏈雜交獲得雜交雙鏈，雜交雙鏈在反應(yīng)體系中具有逐一定向連接形成多聚體的特征，所述多聚體含有2個(gè)及以上拷貝數(shù)目的蛋白基因片段；優(yōu)選的，還可以包括將形成的多聚體作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行更多目的蛋白基因拷貝數(shù)的獲得。
所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選為pET系統(tǒng)、pGEX系統(tǒng)、pMAL系統(tǒng)；所述的目的蛋白的純化為采用親和層析柱進(jìn)行純化，優(yōu)選為，親和層析柱的標(biāo)簽為His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、MBP標(biāo)簽。
所述純化產(chǎn)物的切割可以是化學(xué)試劑或酶切割，優(yōu)選地是BrCN切割。具體步驟可以是在純化后的蛋白質(zhì)中加BrCN溶液后置4°C冰箱處理24小時(shí)，加等體積雙蒸H2O冷凍干燥。
本發(fā)明還保護(hù)由該方法所得的目的蛋白制品。
本發(fā)明還保護(hù)由該方法所得的目的蛋白制品用于醫(yī)藥的用途。
本發(fā)明以胸腺肽為例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的方法。
本發(fā)明提供的方法具有如下設(shè)計(jì)方案1、根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編碼目的蛋白的基因編碼區(qū)堿基序列，并商業(yè)化合成模板鏈和編碼鏈寡核苷酸鏈；2、合成的寡核苷酸鏈具有如下特征編碼鏈和模板鏈的3’端下游序列的下游均引入單一切割位點(diǎn)序列，所述單一切割位點(diǎn)序列具有如下特征根據(jù)密碼子規(guī)則編碼的氨基酸序列可被化學(xué)試劑或酶單一切割。優(yōu)選的，所述單一切割位點(diǎn)序列編碼單個(gè)氨基酸，即R或 W或M或D或E或K ;3、所述單一切割位點(diǎn)序列被化學(xué)試劑和酶切割后，目的蛋白羧基端末端以及下游均產(chǎn)生一個(gè)多余的氨基酸，確切地，該氨基酸為R或W或M或D或E或K;4、所述編碼鏈和模板鏈經(jīng)過(guò)變性退火處理后獲得雜交雙鏈，所述雜交雙鏈具有如下特征雙鏈5’端均有3個(gè)堿基的粘性末端，且粘性末端具有堿基互補(bǔ)性，并且互補(bǔ)性又具有定向性；5、所述定向性是指線性DNA雙鏈互補(bǔ)粘性末端發(fā)生且僅5’端粘性末端和3’端粘性末端的互補(bǔ)配對(duì)；6、所述雜交雙鏈在反應(yīng)體系中具有逐一定向連接形成多聚體的特征，所述多聚體含有 2個(gè)及以上拷貝數(shù)目的蛋白基因片段。所述多聚體形成的混合物可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR)的模板；7、所述模板可被根據(jù)感興趣多肽基因片段所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增，所述擴(kuò)增產(chǎn)物含有高拷貝的目的蛋白基因片段定向連接單元；8、DNA凝膠回收所述高拷貝連接單元并進(jìn)行TA克隆后測(cè)序鑒定獲得感興趣拷貝數(shù)構(gòu)建體；9、所述構(gòu)建體亞克隆至表達(dá)載體中形成表達(dá)構(gòu)建體。比如表達(dá)載體可以是原核表達(dá)載體，所述構(gòu)建體可在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行原核表達(dá)，所述原核表達(dá)系統(tǒng)包括PET系統(tǒng)、pGEX 系統(tǒng)、pMAL系統(tǒng)等，不排除其他原核表達(dá)系統(tǒng)；10、所述原核表達(dá)構(gòu)建體在所述原核表達(dá)系統(tǒng)中原核表達(dá)后的產(chǎn)物可被原核表達(dá)系統(tǒng)中的親和標(biāo)簽親和純化，所述親和標(biāo)簽包括His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、MBP標(biāo)簽等，不排除其他親和標(biāo)簽；11、所述原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和純化后可被化學(xué)試劑或酶切割，形成含有目的蛋白單體的混合物；12、所述目的蛋白單體混合物經(jīng)高效液相色譜(HPLC)方法進(jìn)行深度純化；13、所述純化后的目的蛋白單體產(chǎn)物的活性測(cè)定。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了用本發(fā)明的方法制備胸腺肽制品的步驟，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單、并高效表達(dá)胸腺肽。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證明了該方法得到的胸腺肽單體產(chǎn)物具有顯著促進(jìn)昆明小鼠脾細(xì)胞增殖活性；本發(fā)明的目的之一是構(gòu)建目的蛋白的定向多拷貝克隆，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Ta I的聞效、聞廣制備。本發(fā)明的目的之ニ是建立ー種目的蛋白基因定向多拷貝克隆構(gòu)建的方法。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“定向”是指目的蛋白基因DNA片段按照編碼鏈5’-3’方向相互連接，還指表達(dá)目的蛋白產(chǎn)物按氨基端-羧基端方向相互連接。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多拷貝”是指目的蛋白基因DNA片段大于或等于兩個(gè)拷貝數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。以下目的蛋白是以胸腺肽為例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明本發(fā)明的方法，其它目的蛋白類似。 以下實(shí)施例中涉及到的序列合成、測(cè)序均由Invitrogen生物科技有限公司完成。實(shí)施例1 :T a I基因定向多拷貝構(gòu)建體構(gòu)建1、商業(yè)化合成T a I基因寡核苷酸片段
編碼鏈T a 1-F: 5’ -AGCGATGCCGCCGTGGATACCAGCAGCGAAATTACCACCAAAGATCTGAAAGAAAAAAAAGAAGTGGTGGAAGAAGCCGAAAACATG _3’ (SEQ ID NO:1)
模板鏈T a 1-R: 5，-GTTTTCGGCTTCTTCCACCACTTCTTTTTTTTCTTTCAGATCTTTGGTGGTAATTTCGCTGCTGGTATCCACGGCGGCATCGCTCAT-3’ (SEQ ID NO:2)
其中編碼鏈3’末端ATG三核苷酸(見下劃線標(biāo)明)為引入的單ー酶切位點(diǎn)，編碼蛋氨酸(M)，可被化學(xué)試劑氰溴酸(BrCN)在蛋氨酸的羧基端位點(diǎn)單一切開。模板鏈CAT三核苷酸(見下劃線標(biāo)明)為所述ATG三核苷酸的反向互補(bǔ)序列，所述互補(bǔ)序列經(jīng)體外連接反應(yīng)可獲得Ta I編碼基因的兩拷貝串聯(lián)體。2, Tal基因片段體外連接
將步驟I所述的編碼鏈和模板鏈經(jīng)T4多聚核苷酸激酶(TAKARA)處理后于雜交液(50mMNaCl, IOmM Tris-Cl, ImM EDTA)中進(jìn)行雜交反應(yīng)。所得雜交反應(yīng)產(chǎn)物用T4連接酶(TAKARA)進(jìn)行連接反應(yīng)得到連接產(chǎn)物。3,Ta I基因片段多拷貝定向克隆
步驟2所得到的連接產(chǎn)物經(jīng)如下引物T-F :5’ -ATGAGCGATGCCGCCGCCGT-3’ (SEQ IDN0:3)
T-R :5’ -CTAGTTTTCGGCTTCTTCCACC-3’ (SEQ ID NO:4)
用Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10 X PCR緩沖液5 y L，dNTP4 u L, TaqDNA 聚合酶 0. 25 u L, T-F 和 T-R (10 u mol/L)各 5 y L，模板(步驟 2 的連接產(chǎn)物)I U L，加雙蒸水至50 iiしPCR反應(yīng)程序先94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后再72°C保持5min，冷卻4°C。回收多拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物片段并與pMD19-T(TAKARA)進(jìn)行TA克隆操作。菌落PCR方式篩選陽(yáng)性克隆，篩選獲得含有1、2、4、5、7拷貝的構(gòu)建體。所述構(gòu)建體亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28b ( + )(Merck)，分別命名為 pET-28b-Tl、pET-28b-T2、pET_28b_T4、pET_28b_T5 和 pET_28b_T7。構(gòu)建體測(cè)序鑒定正確。
實(shí)施例2 :Τ α I基因多拷貝定向克隆構(gòu)建體原核表達(dá)與純化 UTal基因多拷貝定向克隆構(gòu)建體原核表達(dá)所述 pET-28b-T2、pET-28b-T4、pET_28b_T5 和 pET_28b_T7 構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，分別挑取單個(gè)菌落在含50mg/mL卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)過(guò)夜， 培養(yǎng)物1: 100擴(kuò)大培養(yǎng)至600nm波長(zhǎng)的OD值為O. 6 0. 8，分別加入O. 5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，離心收集菌體，超聲裂解后離心獲得細(xì)菌總蛋白溶液；2、原核表達(dá)產(chǎn)物的初步純化所述細(xì)菌總蛋白溶液經(jīng)親和層析柱(Ni2+_charged IDA his-bind column, Merck)結(jié)合后，逐步洗去雜蛋白后用咪唑作為洗脫液將結(jié)合在柱上的目的蛋白洗脫下來(lái)；3、純化產(chǎn)物的切割所述初步純化的產(chǎn)物用BCA法(Priece)法測(cè)定蛋白含量，每克蛋白質(zhì)加ImL BrCN溶液(50mg/mL，70%甲酸配制)置4°C冰箱處理24小時(shí)，加等體積雙蒸H2O冷凍干燥除去甲酸和BrCN，獲得T α I多肽單體產(chǎn)物混合物；4、切割產(chǎn)物的深度純化所述T α I多肽單體切割產(chǎn)物混合物經(jīng)HPLC進(jìn)一步純化。
實(shí)施例3 :Τ α I多肽單體產(chǎn)物活性研究 以常規(guī)MTT法進(jìn)行T α I多肽單體產(chǎn)物對(duì)小鼠脾細(xì)胞(購(gòu)于上海信然生物技術(shù)有限公司)的增值實(shí)驗(yàn)。結(jié)果Ta I多肽單體產(chǎn)物具有顯著的促進(jìn)昆明小鼠脾細(xì)胞增殖活性。
權(quán)利要求
1.一種目的蛋白的制備方法，其特征是包括如下步驟，目的蛋白的核苷酸序列片段的獲得；目的蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建；目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；目的蛋白的純化；純化產(chǎn)物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入單一切割位點(diǎn)；所述目的蛋白通過(guò)合成編碼鏈和模板鏈，將兩者雜交獲得，在合成編碼鏈和模板鏈時(shí)引入單體切割的識(shí)別位點(diǎn)；優(yōu)選地，所述目的蛋白是人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮(zhèn)痛肽。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于，在切割步驟后還包括進(jìn)一步純化的步驟；任選地，還包括目的蛋白活性測(cè)定。
3.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述目的蛋白基因是I或I個(gè)以上拷貝； 優(yōu)選地，所述目的蛋白基因的I個(gè)以上拷貝數(shù)通過(guò)將目的蛋白基因片段進(jìn)行體外串聯(lián)連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。
4.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的單一切割位點(diǎn)是根據(jù)密碼子規(guī)則編碼的氨基酸序列；優(yōu)選地，所述氨基酸序列為R或W或M或D或E或K。
5.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述目的蛋白基因的核苷酸序列片段的獲得為，合成目的蛋白基因模板鏈和編碼鏈；經(jīng)過(guò)變性退火處理將編碼鏈和模板鏈雜交獲得雜交雙鏈，雜交雙鏈在反應(yīng)體系中具有逐一定向連接形成多聚體的特征，所述多聚體含有2 個(gè)及以上拷貝數(shù)目的蛋白基因片段；優(yōu)選的，還可以包括將形成的多聚體作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行更多目的蛋白基因拷貝數(shù)的獲得。
6.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選為 PET系統(tǒng)、pGEX系統(tǒng)、pMAL系統(tǒng)；任選地，所述的目的蛋白的純化為采用親和層析柱進(jìn)行純化，優(yōu)選為，親和層析柱的標(biāo)簽為His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、MBP標(biāo)簽。
7.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述純化產(chǎn)物的切割可以是化學(xué)試劑或酶切割，優(yōu)選地是BrCN切割。
8.權(quán)利要求2的構(gòu)建方法，其特征在于，所述進(jìn)一步純化為采取HPLC純化。
9.權(quán)利要求1一 8任一方法所得的目的蛋白。
10.權(quán)利要求9的目的蛋白用于醫(yī)藥的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種目的蛋白制備方法及其用途。其制備方法為，目的蛋白的核苷酸序列片段的獲得；目的蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建；目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化；切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入單一切割位點(diǎn)；所述目的蛋白通過(guò)合成編碼鏈和模板鏈，將兩者雜交獲得，在合成編碼鏈和模板鏈時(shí)引入單體切割的識(shí)別位點(diǎn)；優(yōu)選地，其中的目的蛋白可以是人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮(zhèn)痛肽。采用本發(fā)明的制備方法制備得到的目的蛋白表達(dá)量高、易于純化，基因表達(dá)產(chǎn)物即為目的蛋白單體，不帶額外氨基酸殘基，既保證了目的蛋白產(chǎn)物良好的生物學(xué)活性，也省去了多拷貝的切割成本，純化簡(jiǎn)單，易于大量生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103014048SQ201210465278
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者任宏偉, 凡復(fù), 陳星 , 陳勝亮 申請(qǐng)人:廈門北大之路生物工程有限公司