專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物微電極領(lǐng)域，具體涉及一種新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器。
背景技術(shù)：
鉻是自然界中廣泛存在的一種元素，主要以三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的形式存在。三價(jià)鉻參與人和動(dòng)物體內(nèi)的糖與脂肪的代謝，是人體必需的微量元素；六價(jià)鉻則是明確的有害元素，能使人體血液中某些蛋白質(zhì)沉淀，引起貧血、腎炎、神經(jīng)炎等疾病，長(zhǎng)期與六價(jià)鉻接觸還會(huì)引起呼吸道炎癥并誘發(fā)肺癌或者引起侵入性皮膚損害，嚴(yán)重的六價(jià)鉻中毒還會(huì)致人死亡。因?yàn)殂t是工業(yè)界廣泛使用的物質(zhì)之一，多應(yīng)用于鋼鐵制造、金屬腐蝕和電鍍業(yè)等等。不
同產(chǎn)業(yè)所排放的含鉻廢水，如未謹(jǐn)慎處理將導(dǎo)致水體中殘留大量毒性六價(jià)鉻化合物進(jìn)入環(huán)境。所以，鉻污染一直是公共衛(wèi)生與環(huán)境保護(hù)上重視的議題，美國(guó)環(huán)保署(USEPA)已將其列名為最危害人類(lèi)十七種物質(zhì)之一。我國(guó)規(guī)定工業(yè)廢水中鉻的最高排放濃度為O. 5mg/L (飲用水中鉻含量上限為O. 05mg/L)。目前檢測(cè)水中六價(jià)鉻金屬離子的方法主要是原子吸收光譜儀，此類(lèi)設(shè)備價(jià)格昂貴，操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)也需耗費(fèi)不少時(shí)間。因此，在檢測(cè)的過(guò)程中，上萬(wàn)噸不合格的工業(yè)廢水可能已流入河流。用簡(jiǎn)單的、快捷的傳感技術(shù)來(lái)檢測(cè)鉻離子是目前最佳的、最廉價(jià)的、最及時(shí)的解決辦法。而電勢(shì)法離子選擇性傳感器更是因高靈敏度、低成本和快速響應(yīng)而被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。傳感器分為電化學(xué)傳感器和生物傳感器兩大類(lèi)。高穩(wěn)定性是電化學(xué)傳感器的一大優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)被檢物(例如鉻離子)的選擇性與生物傳感器相比就稍遜一籌了。以往制備生物傳感器是用活性微生物粘附固定在電極上，這樣微生物的活性成了傳感器使用壽命和穩(wěn)定性的決定因素。另外，挑選對(duì)被檢物具選擇性的微生物，也是制備生物傳感器的關(guān)鍵。有文獻(xiàn)提到一些對(duì)鉻具有抵抗力或可將其還原減毒的代表性細(xì)菌包括Pseudomonas aeruginosaA2Chr、Bacillus megaterium TKW3> Enterobavter cloacaeHOl 及 Bacillus firmus 等(Ganguli andTripathi, 2002;Cheung et al·，2006;Sau etal.，2008)，這類(lèi)細(xì)菌可應(yīng)用于去除六價(jià)鉻污染，但是這些菌株的種類(lèi)還是非常有限，特別缺少一些本土化的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單易用、成本低廉、便于攜帶、探測(cè)響應(yīng)快，靈敏度高，穩(wěn)定性高，檢測(cè)下限低和使用壽命長(zhǎng)的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器。本發(fā)明的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，其特征在于，包括PC檢測(cè)底板，在PC檢測(cè)底板表面具有一條合金涂層傳導(dǎo)通道，合金涂層傳導(dǎo)通道一端與引線(xiàn)相連，另外一端為檢測(cè)涂層，在檢測(cè)涂層上方覆蓋有一層PC蓋板，在PC蓋板上，與檢測(cè)涂層相對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有檢測(cè)池，檢測(cè)涂層成為檢測(cè)池的底面，在檢測(cè)池的檢測(cè)涂層表面敷有一層鉻離子感應(yīng)層；
所述的鉻離子感應(yīng)層是由石墨粉、人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)GIMT1. 002凍干粉和液體石蠟按照質(zhì)量比45:45:10組成，將三者混合均勻后，平鋪于檢測(cè)
涂層表面。所述的檢測(cè)涂層優(yōu)選呈圓盤(pán)狀，其直徑為l(Tl5mm。這種直徑的圓盤(pán)狀檢測(cè)涂層可使鉻離子感應(yīng)層有效地附著在電極的檢測(cè)涂層上，避免電信號(hào)損失，又能保持其良好的靈敏性，且節(jié)省空間。所述的合金涂層傳導(dǎo)通道優(yōu)選是用合成黃金、鉬金或銀電鍍而成，其起電信號(hào)傳導(dǎo)作用。所述的PC檢測(cè)底板和PC蓋板指的是其材質(zhì)為PC (聚碳酸酯)材質(zhì)制成的檢測(cè)底板和蓋板。所述的鉻離子感應(yīng)層的厚度優(yōu)選為< 1mm。 本發(fā)明的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器可以通過(guò)引線(xiàn)與多通道數(shù)據(jù)采集儀相連，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中鉻離子的快速、有效分析檢測(cè)。本發(fā)明結(jié)合電化學(xué)傳感器(高穩(wěn)定性)與生物傳感器(高選擇性)的優(yōu)點(diǎn)，用“鉻耐受性”本土菌株人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi) GIMTI. 002作為檢測(cè)鉻離子的感應(yīng)元件，用凍干技術(shù)制備人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi) GIMTI. 002菌株凍干粉，并將凍干菌株混合碳粉固定在檢測(cè)涂層上，以多通道數(shù)據(jù)收集器為信號(hào)輸出顯示裝置，建立鉻離子濃度與電極輸出信號(hào)(電壓值)的關(guān)系，成為檢測(cè)含鉻廢水的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了樣品需要量少、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、檢測(cè)下限低等特點(diǎn)，極易攜帶，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；最重要的是制作成本低廉，可大批量生產(chǎn)，還穩(wěn)定性高，生物選擇性也高。并且，本發(fā)明與相關(guān)的測(cè)試技術(shù)及數(shù)據(jù)處理軟件相結(jié)合，將可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)原位、在線(xiàn)的微全分析系統(tǒng)，給傳統(tǒng)環(huán)境檢測(cè)帶來(lái)根本的變革。本發(fā)明的人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)GIMTI. 002,保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(地址廣東省廣州市越秀區(qū)先烈中路100號(hào)大院微生物所實(shí)驗(yàn)樓五樓)，其保藏編號(hào)是GMT1. 002，該菌種是對(duì)外銷(xiāo)售的，任何人都可以從這里購(gòu)買(mǎi)到該菌種。


圖I是人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi) GIMT1. 002在不同濃度的絡(luò)離子環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖；圖2是本發(fā)明新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器(凍干人蒼白桿菌附著電極)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極的使用示意圖；圖4是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極對(duì)不同濃度鉻離子溶液的響應(yīng)曲線(xiàn)；圖5是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極靈敏度測(cè)試(濃度/電壓)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖6是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極對(duì)不同濃度鉻離子溶液的響應(yīng)曲線(xiàn)；圖7是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖8是本發(fā)明凍干人蒼白桿菌附著電極對(duì)含鉻水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)曲線(xiàn)。其中1、PC檢測(cè)底板；11、鉻離子合金涂層傳導(dǎo)通道；111、鉻離子檢測(cè)涂層；112、銀引線(xiàn)；2、PC蓋板；3、鉻離子檢測(cè)池；4、多通道數(shù)據(jù)采集儀；5、銀-氯化銀參比電極。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。一、新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器的制備I.菌株的選擇人蒼白桿菌GIMT1. 002對(duì)鉻離子的耐受性實(shí)驗(yàn)把人蒼白桿菌GMT1. 002分別接種于含10_7mol/L 10_3mol/L硝酸鉻的LB培養(yǎng)基中，以光密度0D_、30°C震蕩48小時(shí)的狀況下，測(cè)定人蒼白桿菌GMT1. 002菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。如圖I所示，菌株無(wú)論在低濃度(l(r7mol/L)的硝酸鉻溶液或在高濃度(l(T3mol/L)硝酸鉻溶液中皆呈現(xiàn)持續(xù)生長(zhǎng)的狀態(tài)，大約30小時(shí)以后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖中實(shí)線(xiàn)是菌株在不含鉻離子的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn))。因此證明人蒼白桿菌GMT1. 002對(duì)鉻離子具有耐受性。2.人蒼白桿菌GMT1. 002的培養(yǎng)與凍干粉的制備方法I)將5mL人蒼白桿菌GMT1. 002接種至500mL LB培養(yǎng)液內(nèi)，置于30°C搖床內(nèi)培養(yǎng)12 16小時(shí)；2)把培養(yǎng)好的菌株分裝到50mL的離心管里，30°C 6000rpm離心10分鐘，棄上清，
得菌體。3)將菌體冷凍抽干，得到人蒼白桿菌GMT1. 002凍干粉，置于4°C保存待用。3.制備離子傳導(dǎo)成金涂層如圖2所示，以一塊50X75Xlmm (長(zhǎng)X寬X厚)的聚碳酸酯底板(PC板)作為PC檢測(cè)底板1，用合金材料(主要的成分是銅和鎳)在檢測(cè)底板I上電鍍一條用于傳導(dǎo)電信號(hào)的“火柴型”通道，即鉻離子合金涂層傳導(dǎo)通道11。鉻離子合金涂層傳導(dǎo)通道11是由直徑為10_的圓形涂層和7X60_ (長(zhǎng)X寬)的矩形涂層連接而成，圓形涂層處作為檢測(cè)涂層，即為鉻離子檢測(cè)涂層111，將此處定為檢測(cè)位點(diǎn)，矩形涂層起傳輸信號(hào)作用；然后在PC檢測(cè)底板I下部50X55mm (長(zhǎng)X寬)的范圍內(nèi)均勻地涂一層約400 μ m厚度的環(huán)氧樹(shù)脂，鉻離子檢測(cè)涂層111上不涂覆環(huán)氧樹(shù)脂，接著，將一塊50 X 55 X Imm (長(zhǎng)X寬X厚)的PC蓋板2覆蓋于PC檢測(cè)底板I下部的上面，使其粘附在環(huán)氧樹(shù)脂上面，環(huán)氧樹(shù)脂主要起粘附和絕緣的作用，并在此PC蓋板2上對(duì)應(yīng)鉻離子檢測(cè)涂層111的位置開(kāi)出直徑為IOmm的圓形孔洞，孔洞部分和鉻離子檢測(cè)涂層111就形成檢測(cè)池，即為鉻離子檢測(cè)池3，鉻離子檢測(cè)涂層111位于鉻離子檢測(cè)池3的底面。4.制備鉻離子感應(yīng)層鉻離子感應(yīng)層的配制方法是鉻離子感應(yīng)層的原料是由石墨粉、人蒼白桿菌GIMT1. 002凍干粉和液體石蠟按照質(zhì)量比45:45:10組成的。按照上述質(zhì)量比，稱(chēng)取石墨粉、人蒼白桿菌GMT1. 002凍干粉和液體石蠟，將三者混合徹底攪拌均勻，得菌混合物。用純水沖洗鉻離子檢測(cè)池3，再用氮?dú)鈽尨祰娨匀コ龤埩羲危蝗缓髮. 5g菌混合物薄薄地、平整地、均勻地涂于鉻離子檢測(cè)涂層111上，涂于鉻離子檢測(cè)涂層111上的菌混合物即為鉻離子感應(yīng)層，其厚度大約為1_，整個(gè)檢測(cè)裝置稱(chēng)為人蒼白桿菌石墨附著電極。在鉻離子合金涂層傳導(dǎo)通道11上端分別安上簡(jiǎn)易插頭以及銀引線(xiàn)112，由此而得到本發(fā)明的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，最后保存在干凈的玻璃器皿內(nèi)。
二、新型的凍干人蒼白桿菌附著電極的性能檢測(cè)在電極性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)前，用氮?dú)馔ㄈ?0mL IO^moI/L Tris-HCl溶液(pH=6. 7)中去除氧氣；然后，滴加IOuL lO-W/L Cr (NO3)3溶液至Tris-HCl溶液內(nèi)，攪勻；再將新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器浸入含有微量鉻離子(濃度約為10_5mol/L)的Tris-HCl溶液里，浸泡15分鐘(浸泡過(guò)程需磁力轉(zhuǎn)子攪拌)以激活電極。浸泡過(guò)后用純水徹底清洗干凈鉻離子感應(yīng)層。如圖3所示，鉻離子合金涂層傳導(dǎo)通道11通過(guò)銀引線(xiàn)112與多通道數(shù)據(jù)采集儀4 (Keithly 2700型)的高端電勢(shì)接口(H)連接，銀-氯化銀參比電極5 (上海雷磁218型)與多通道數(shù)據(jù)采集儀4的低端電勢(shì)接口(L)連接，并與傳感器一同浸入IOOmL硝酸鉀底液(濃度0. lmol/L，pH=6)中。隨后，依次添加 10 μ L、100 μ L、1000 μ L l(T3mol/L Cr (NO3) 3溶液(pH=5)和IOOyLUOOOyL lO—W/L Cr (NO3)3溶液(pH=5);最后，得出鉻離子的濃度范圍是10_7mol/L 10_3mol/L。該傳感器根據(jù)對(duì)不同濃度的鉻離子溶液的檢測(cè)，得出與之相對(duì)應(yīng)的電勢(shì)差值，如圖4所示，電勢(shì)差值隨著濃度的升高而升高，并呈現(xiàn)出有規(guī)律性的、階梯狀的上升趨勢(shì)；而圖5則是濃度/電壓的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，反映傳感器測(cè)出的電勢(shì)差值與鉻離子·濃度的線(xiàn)性關(guān)系。傳感器靈敏度是21mV/pCr (理論值30mV/deC);對(duì)鉻離子的最低檢測(cè)限為O. 14 μ mol/L，可用于檢測(cè)飲用水和工業(yè)污水的鉻離子濃度(世界衛(wèi)生組織和我國(guó)規(guī)定飲用水中含鉻最高上限標(biāo)準(zhǔn)0. 96 μ mol/L，我國(guó)工業(yè)含鉻廢水最高排放濃度9. 6 μ mol/L)。另外，該傳感器對(duì)鉻離子的響應(yīng)時(shí)間小于60s。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了探測(cè)響應(yīng)快，靈敏度高，檢測(cè)下限低等優(yōu)點(diǎn)。三、新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器對(duì)含鉻水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)首先，按照上述的實(shí)驗(yàn)方法，用本次發(fā)明的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器分別對(duì) I (T7mo I/L、I (T6mo I/L、l(T5mol/L、l(T4mol/L 和 l(T3mol/L 濃度的含鉻溶液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其測(cè)出的電壓值，畫(huà)出濃度/電壓的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖6、7)。然后，將新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器浸入含鉻樣品(批號(hào)201619,標(biāo)準(zhǔn)值1. 98±0. 09mg/L,相對(duì)濃度38±2ymol/L)中，測(cè)出電壓值在19. 5至22. 5mV之間(圖8)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖7所示，38±2ymol/L鉻離子濃度所對(duì)應(yīng)的電壓值為26± lmV，與該新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器檢測(cè)含鉻標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)所得的電壓值相近(誤差在15至25%之間)。由此證明本發(fā)明的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器是可靠的，可用于監(jiān)測(cè)工業(yè)含鉻廢水。并且，可根據(jù)濃度/電壓標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得知檢測(cè)所得電勢(shì)差值與之對(duì)應(yīng)的離子濃度是否達(dá)到或超過(guò)國(guó)家規(guī)定工業(yè)污水的安全標(biāo)準(zhǔn)，有效地、有針對(duì)性地開(kāi)展必要的更深層次的安全性分析，以及采取適當(dāng)?shù)拇胧?；也可以根?jù)檢測(cè)結(jié)果，初步確定污水污染的狀況和污染源，避免盲目投入，造成過(guò)多人力物力的浪費(fèi)，這是符合我國(guó)國(guó)情的水源安全性評(píng)估發(fā)展趨勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，其特征在于，包括PC檢測(cè)底板，在PC檢測(cè)底板表面具有一條合金涂層傳導(dǎo)通道，合金涂層傳導(dǎo)通道一端與引線(xiàn)相連，另外一端為檢測(cè)涂層，在檢測(cè)涂層上方覆蓋有一層PC蓋板，在PC蓋板上，與檢測(cè)涂層相對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有檢測(cè)池，檢測(cè)涂層成為檢測(cè)池的底面，在檢測(cè)池的檢測(cè)涂層表面敷有一層鉻離子感應(yīng)層； 所述的鉻離子感應(yīng)層是由石墨粉、人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)GIMT1. 002凍干粉和液體石蠟按照質(zhì)量比45:45:10組成，將三者混合均勻后，平鋪于檢測(cè)涂層表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，其特征在于，所述的檢測(cè)涂層呈圓盤(pán)狀，其直徑為l(Tl5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，其特征在于，所述的合金涂層傳導(dǎo)通道是用合成黃金、鉬金或銀電鍍而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器，其特征在于，所述的鉻離子感應(yīng)層的厚度+. 1mm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的檢測(cè)鉻離子的微生物傳感器。它包括PC檢測(cè)底板，在PC檢測(cè)底板表面具有一條合金涂層傳導(dǎo)通道，合金涂層傳導(dǎo)通道一端與引線(xiàn)相連，另外一端為檢測(cè)涂層，在檢測(cè)涂層上方覆蓋有一層PC蓋板，在PC蓋板上，與檢測(cè)涂層相對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有檢測(cè)池，檢測(cè)涂層成為檢測(cè)池的底面，在檢測(cè)池的檢測(cè)涂層表面敷有一層鉻離子感應(yīng)層；所述的鉻離子感應(yīng)層是由石墨粉、人蒼白桿菌凍干粉和液體石蠟按照質(zhì)量比45:45:10組成，將三者混合均勻后，平鋪于檢測(cè)涂層表面。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了樣品需要量少、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、檢測(cè)下限低等特點(diǎn)，極易攜帶，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；最重要的是制作成本低廉，可大批量生產(chǎn)，還穩(wěn)定性高，生物選擇性也高。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102944591SQ201210472840
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者郭詩(shī)韻, 許玫英, 張國(guó)霞, 陳杏娟, 孫國(guó)萍, 郭俊, 曾國(guó)驅(qū) 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 佛山市環(huán)境健康與安全評(píng)價(jià)研究中心