專利名稱：獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法、引物組合及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法、引物組合及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，我國國家蔬菜種質(zhì)資源庫收集和保存葉用萵苣種質(zhì)資源200余份，但目前生產(chǎn)上使用的栽培品種多數(shù)引自國外。葉用萵苣是一種低投入、高收益、營養(yǎng)價(jià)值豐富的速生蔬菜，近年來栽培面積迅速擴(kuò)大，逐漸成為人們食用的首選綠葉蔬菜之一。但是，我國葉用萵苣的栽培品種主要靠引進(jìn)國外已有品種，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種和類型很有限，并且在品種資源搜集、鑒定上幾乎是空白。因此，需要多角度、多方法開展種質(zhì)資源的創(chuàng)新工作，開發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良的葉用萵苣新品種，來滿足當(dāng)前生產(chǎn)的需要。種質(zhì)資源是蔬菜遺傳育種和品種改良的基本材料，種質(zhì)資源的鑒定和篩選是培育和改良優(yōu)異品種的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。由于不同地區(qū)之間頻繁引種，使得品種名稱十分混亂，同物異名和同名異物的現(xiàn)象非常普 遍。所以，鑒定葉用萵苣種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系中的有效性，能為葉用萵苣種質(zhì)資源的收集、保存、利用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)階段，對于蔬菜的種質(zhì)資源鑒定，大多用的基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記技術(shù)，可綜合為三大類一是以分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù),主要是RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism)及 VNTR(Variable number tandem repeat)；二是以 PCR 為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，如 RAF1D(Random Amplified Polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)、STS (Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)> ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)、 DAF(DNAAmplified Fingerprinting)及 ERPAR(Ex-tended Random Primer Amplified Regions)等;三是酶切和PCR相結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，主要有AFLP(Amplified ragment LengthPolymorphism)和 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)。此外，還有一類新近發(fā)展起來的基于單個(gè)核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記，即SNP(Simple NucleotidePolymorphism)。隨著逆轉(zhuǎn)座子研究,一項(xiàng)基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的植物分子標(biāo)記技術(shù)-RTN技術(shù)得到了很大的發(fā)展，主要有 SSAP(Sequence-1 Variation Polymorphism) >RIAP(InverseRetrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP(Retrotransposon based InsertionPolymorphism)等5種。選擇何種方法對葉用萵苣種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定是急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施方式提供一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法、引物組合及應(yīng)用，可以解決目前不能對葉用萵苣種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行有效鑒定的問題。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
本發(fā)明實(shí)施方式提供一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的引物組合，其為以下引物組合中的任一組E39/M58、E40/M55、E41/M56、E50/M78、E75/M65、E75/M66、E75/M64、E76/M64、E78/M65 或 E75/M63。本發(fā)明實(shí)施方式還提供一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法，該方法包括以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將上述步驟得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離DNA標(biāo)記，用銀染顯色法顯示DNA條帶；選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析得出聚類分析圖。
本發(fā)明實(shí)施方式進(jìn)一步提供一種上述的引物組合在獲得葉用萵苣的聚類分析圖中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施方式又提供一種葉用萵苣的聚類分析圖，利用上述的方法獲得。從上述提供的技術(shù)方案中可以看出，本發(fā)明實(shí)施方式中，利用確定的引物組合，可以通過AFLP的方法，獲得葉用萵苣的聚類分析圖，多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、可重復(fù)性好、樣品適應(yīng)性廣，將在葉用萵苣親緣關(guān)系鑒定，不同品種雜交，以及不同地域間品種引種等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，能為葉用萵苣種質(zhì)資源的收集、保存、利用提供理論依據(jù)，可以有效鑒定葉用萵苣種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例I本發(fā)明實(shí)施例提供一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的引物組合，其為以下引物組合中的任一組(1)E39/M58(2) E40/M55(3)E41/M56(4) E50/M78(5)E75/M65(7)E75/M66(8) E75/M64(9) E76/M64(10)E78/M65(11)E75/M63。實(shí)施例2
本實(shí)施例還提供一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法，該方法包括以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用上述權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將上述步驟得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離DNA標(biāo)記，用銀染顯色法顯示DNA條帶；選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析得出聚類分析圖。上述方法的選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析得出聚類分析圖步驟，具體可通過以下方式實(shí)現(xiàn)(I)根據(jù)擴(kuò)增帶的強(qiáng)弱及清晰度確定遺傳變異的帶，淘汰假象帶； (2)在電泳圖譜中進(jìn)行比較，確定單態(tài)帶和多態(tài)帶；(3)選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，以“I”和“0”分別記錄條帶的有無，在同一遷移距離上有帶賦值為“ 1”，無帶賦值為“0” ;將整個(gè)分子標(biāo)記圖轉(zhuǎn)化為0/1矩陣輸入P0PGENEI. 32軟件進(jìn)行分析；計(jì)算個(gè)體間的Nei相似系數(shù)(Nei&Li，1979)，其公式為Sc =2Nab/ (Na+Nb+Nab)，其中，Na表示樣品A特有的帶數(shù)；Nb表示樣品B特有的帶數(shù)；Nab表示樣品A和樣品B共有的帶數(shù)。用NTSYSpc2. 10軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析，生成聚類分析圖。本實(shí)施例提供一種上述引物組合在獲得葉用萵苣的聚類分析圖中的應(yīng)用。下面結(jié)合具體獲取過程對上述方法作進(jìn)一步說明本實(shí)施例利用上述引物組合通過AFLP分子標(biāo)記方式對葉用萵苣的73個(gè)品種進(jìn)行聚類分析獲得聚類分析圖的方法，具體操作流程為制備模板DNA —利用引物組合進(jìn)行DNA擴(kuò)增一電泳一銀染顯色一統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。具體方法和過程如下(I)使用改良的CTAB法提取的葉用萵苣基因組DNA，提取的基因組DNA經(jīng)核酸蛋白測定儀(Eppendorf Biophotometer)測定 OD260/OD280 值在 I. 7 I. 9 范圍內(nèi)；將 DNA 提取液稀釋成IOOng/ y I,取I DNA樣品加入I y I上樣緩沖液(loading buffer)稀釋液，在I %的瓊脂糖凝膠上檢測，穩(wěn)壓4V/cm，電泳45分鐘；電泳結(jié)果顯示，DNA主帶清晰，無降解現(xiàn)象，RNA去除干凈，可以作為模板DNA ；(2)AFLP引物的設(shè)計(jì)和篩選在AFLP分子標(biāo)記方式操作中，不同引物組合對某一特定基因組的擴(kuò)增效率是不同的，引物擴(kuò)增效率的高低由它產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)決定。本實(shí)驗(yàn)對34對引物組合進(jìn)行分別進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出了 11對譜帶分布均勻，條帶豐富，多態(tài)性較高且譜帶質(zhì)量較好的引物組合，可用于提供樣品種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，這十一對引物如下引物組合I :E39/M58 ；GACTGCGTACCAATTC ATG/GATGAGTCCTGAGTAA CGT引物組合2 E40/M55 ；GACTGCGTACCAATTC AGC/GATGAGTCCTGAGTAA CGA引物組合3 E41/M56 ；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGC引物組合4 E41/M57 ；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGG引物組合5 E50/M78 ；GACTGCGTACCAATTC CAT/GATGAGTCCTGAGTAA GTT引物組合6 E75/M65 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAG引物組合7 E75/M63 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAA引物組合8 E75/M66 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA CGA
引物組合9 E75/M64 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAC引物組合10 E76/M64 ；GACTGCGTACCAATTC GTC/GATGAGTCCTGAGTAA GAC引物組合11 :E78/M65 ；GACTGCGTACCAATTC GTT/GATGAGTCCTGAGTAA GAG(3)利用上述⑵的任一組引物組合對DNA進(jìn)行擴(kuò)增首先按如下PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增94°C預(yù)變性3分鐘一(94°C變性30秒—50°C復(fù)性30秒一72°C延伸I分鐘)擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)一72°C延伸10分鐘一4°C。然后，取5 ii L稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入表3-4的混合體系中，最后補(bǔ)ddH20至20 ii L，按如下PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行選擇性擴(kuò)增95°C預(yù)變性5分鐘一(95°C變性35秒一65°C復(fù)性35秒(每循環(huán)降低0. 70C ) — 72°C延伸I分鐘)2個(gè)循環(huán)一(94°C變性30秒一56°C復(fù)性30秒一72°C 延伸I分鐘)23個(gè)循環(huán)一72°C延伸10分鐘一4°C。表I為AFLP擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果表I為AFLP擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的引物組合，其為以下引物組合中的任一組 E39/M58、E40/M55、E41/M56、E50/M78、E75/M65、E75/M66、E75/M64、E76/M64、E78/M65或E75/M63。
2.一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法，該方法包括 以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用上述權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 將上述步驟得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離DNA標(biāo)記，用銀染顯色法顯示DNA條帶； 選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析得出聚類分析圖。
3.—種權(quán)利要求I所述的引物組合在獲得葉用萵苣的聚類分析圖中的應(yīng)用。
4.一種葉用萵苣的聚類分析圖，其特征在于，利用上述權(quán)利要求2所述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得葉用萵苣的聚類分析圖的方法、引物組合及應(yīng)用，屬于生物種質(zhì)分析領(lǐng)域。該獲得葉用萵苣的聚類分析圖的引物組合，包括(1)E39/M58(2)E40/M55(3)E41/M56(4)E50/M78(5)E75/M65(7)E75/M66(8)E75/M64(9)E76/M64(10)E78/M65(11)E75/M63中的任一組?；赑CR技術(shù)的分子標(biāo)記法AFLP，應(yīng)用所述專用引物獲得的葉用萵苣聚類分析圖譜也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明獲得的葉用萵苣聚類分析圖譜多態(tài)性高、可靠穩(wěn)定性強(qiáng)，將在葉用萵苣親緣關(guān)系鑒定，不同品種雜交，以及不同地域間品種引種等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/11GK102747143SQ20121009345
公開日2012年10月24日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉甜甜, 劉超杰, 李君平, 范雙喜, 陳青君, 韓瑩琰 申請人:北京農(nóng)學(xué)院