檢測(cè)牛白血病的熒光定量pcr的試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，包括FRET-PCR引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，所述FRET-PCR引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探針和LCRed640探針；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述6-FAM探針具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述LCRed640探針具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高的牛白血病的實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)試劑盒。
【專利說明】檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試 劑盒及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛白血病病毒Bovine leukemia virus屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科Retroviridae、丁型反 轉(zhuǎn)錄病毒屬Deltaretrovims。該病毒粒子呈球形，有囊膜，病毒含單股RNA，能產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄 酶，衣殼呈20面體對(duì)稱。
[0003] 牛白血病是由白血病病毒引起牛的一種慢性腫瘤性疾病，其特征為淋巴樣細(xì)胞惡 性增生,進(jìn)行性惡病質(zhì)和高度病死率。此病主要發(fā)生于牛、綿羊、瘤牛、水牛、水豚，已呈世界 性分布，幾乎遍及所有養(yǎng)牛的國(guó)家和地區(qū)。在中國(guó)的安徽、上海、江蘇、廣東、陜西、江西、新 疆、北京、浙江、黑龍江等地都有發(fā)病的報(bào)道。本病可以水平傳播和垂直傳播，近年來證明吸 血昆蟲在本病傳播上具有重要作用，被污染的醫(yī)療器械，如注射器和針頭，可以起到機(jī)械傳 播本病的作用。病毒可以通過胎盤感染胎兒，這種感染主要發(fā)生在母牛懷孕6個(gè)月以后，感 染本病的母牛所生的犢牛有3% -20%在出生時(shí)已被感染，同時(shí)，犢牛通過吸吮感染母牛的 初乳也可被感染。本病有亞臨床型和臨床型兩種表現(xiàn)。亞臨床型無瘤的形成，其特點(diǎn)是淋 巴細(xì)胞增生，部分可進(jìn)一步發(fā)展為臨床型。臨床型的癥狀為病牛生長(zhǎng)緩慢，體重減輕。腮淋 巴結(jié)或股前淋巴結(jié)常顯著增大，觸摸時(shí)可移動(dòng)。眶后淋巴結(jié)增大可引起眼球突出。出現(xiàn)臨 床癥狀的牛，通常均取死亡轉(zhuǎn)歸。病死牛尸體常消瘦，腮淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)、股前淋巴結(jié)、 乳房上淋巴結(jié)和腰下淋巴結(jié)常腫大，被膜緊張，呈均勻灰色，柔軟，切面突出。心臟、皺胃和 脊髓常發(fā)生浸潤(rùn)。心肌浸潤(rùn)常發(fā)生于右心房、右心室和心隔，色灰而增厚。循環(huán)擾亂導(dǎo)致全 身性被動(dòng)充血和水腫。脊髓被膜外殼里的腫瘤結(jié)節(jié)，使脊髓受壓、變形和萎縮。皺胃壁因腫 瘤浸潤(rùn)而增厚變硬。腎、肝、肌肉、神經(jīng)干和其他器官亦可受損。
[0004] 有研究表明，牛白血病病毒具有潛在的感染人類的風(fēng)險(xiǎn)，在人體中已經(jīng)檢測(cè)到了 牛白血病病毒抗體；最新研究發(fā)現(xiàn)，女性乳腺癌患者中，44 %患者的乳腺組織中檢測(cè)到牛白 血病病毒核酸。
[0005] 目前牛白血病的檢測(cè)方法主要有：（1)電鏡檢測(cè)?？扇〔∨Ｍ庵苎毫馨图?xì)胞培 養(yǎng)分離病毒，通過電鏡方法檢測(cè)。（2)血清學(xué)檢測(cè)。應(yīng)用最廣泛的有瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)、酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)。（3)分子生物學(xué)檢測(cè)。主要有聚合酶鏈反應(yīng)PCR。
[0006] 在電鏡檢測(cè)方法中，需要固定、脫干、墊入、分割和染色等步驟，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，且 微生物品種繁多，容易產(chǎn)生誤診，對(duì)操作人員要求較高。在血清學(xué)檢測(cè)方法中，檢測(cè)的基礎(chǔ) 是抗原抗體的特異反應(yīng)。如檢測(cè)抗原，除了要求抗體，抗體為單抗或多抗，是特異的外，還要 求待測(cè)抗原上必須存在有能與所用抗體結(jié)合的抗原決定簇，如果因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致某些位 點(diǎn)的不表達(dá)，或者結(jié)合位點(diǎn)因?yàn)槟承┰虮环忾]或阻斷，都會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合，造成 假陰性結(jié)果；如檢測(cè)抗體，則要求所用包被抗原應(yīng)盡可能包含所有的特異抗原決定簇，同時(shí) 又盡可能不含有非特異的成分，這一點(diǎn)往往由于技術(shù)水平的限制而難以完全做到。因此，從 某種意義上來說，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的假陽性和假陰性是不能完全避免的，從而影響了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn) 確性。PCR是目前在病原檢測(cè)中最常用的方法。目前，已有普通PCR、巢式PCR和熒光定量 PCR等多種PCR方法應(yīng)用于牛白血病的檢測(cè)。然而，普通PCR需要結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn) 進(jìn)行結(jié)果的判定，因而操作較為繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，從而達(dá)不到快速檢測(cè)的效果。
[0007] 至今，中國(guó)國(guó)內(nèi)很少有用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)牛白血病。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍， 它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中 的重要工具，目前已得到廣泛應(yīng)用。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基 因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。
[0008] 目前，缺乏一種檢測(cè)靈敏度高的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒及其檢測(cè) 方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了 一種檢測(cè)靈敏度高的檢測(cè)牛白血病的熒光 定量PCR的試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種檢測(cè)牛白血病的熒光定 量PCR的FRET-PCR引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，所述FRET-PCR引物為上游引物和下游引 物；所述探針為6-FAM探針和LCRed640探針；
[0011] 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列；
[0012] 所述下游引物具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列；
[0013] 所述6-FAM探針具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列；
[0014] 所述LCRed640探針具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列；
[0015] 所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板具有SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
[0016] 本發(fā)明的一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，所述試劑盒包括： FRET-PCR引物、6-FAM探針、LCRed640探針、PCR緩沖液、熱啟動(dòng)Taq酶、dNTP、標(biāo)準(zhǔn)陽性模 板、對(duì)照品；所述對(duì)照品為超純水。
[0017] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探針對(duì)牛白血病前 病毒DNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增核苷酸片段插入pUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
[0018] 進(jìn)一步地，所述FRET-PCR引物的終始濃度為0. 2 μ M ;所述6-FAM探針的終始濃度 為0. 2 μ M ;所述LCRed640探針的終始濃度為0. 2 μ Μ。
[0019] 更進(jìn)一步地，所述熱啟動(dòng)Taq酶的終始濃度為2. 0U/20 μ L ;所述dNTP的終始濃度 為5 μ M ;所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的終始濃度為5ng ;所述對(duì)照品的終始濃度為5ng。
[0020] 本發(fā)明的一種牛白血病的熒光定量PCR的擴(kuò)增檢測(cè)體系，所述擴(kuò)增檢測(cè)體系包括 20 μ 1的PCR擴(kuò)增檢測(cè)體系：DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑10 μ I、IxPCR緩沖液、1 μ M上游引 物、ΙμΜ下游引物、0. 2μΜ的6-FAM探針、0. 2μΜ的LCRed640探針、2個(gè)單位的Taq酶和 200 μ M dNTP〇
[0021] 本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行牛白血病的熒光定量PCR的檢測(cè)方法，在孔板中加入試 齊IJ，加樣完畢后，將孔板放入系統(tǒng)中，設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性、18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循 環(huán)、30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)、1個(gè)持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個(gè)降溫循環(huán)；
[0022] 預(yù)變性：l*2min@95°C ;18 個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)：6*lsec@95°C，12sec@70°C， 8seci72〇C ；9*lseci95〇C, 12seci68〇C, 8seci72〇C ；3*lseci95〇C, 12seci66〇C , 8seci72〇C ；
[0023] 30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)：30*lsec@95 °C，30sec@56 °C (在此收集熒 光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個(gè)熔解循環(huán)：l*lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù) 收集熒光；I個(gè)降溫循環(huán)：l*lsec@38°C。
[0024] 進(jìn)一步地，所述孔板為96孔板，所述系統(tǒng)為羅氏LightCycler?480II系統(tǒng)；加入檢 測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒10 μ 1，所述試劑盒包括IxPCR緩沖液、1 μ M FRET-上 游引物、1 μ M FRET-下游引物、0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的LCRed640探針、2個(gè)單位的 Taq酶、200 μ M dNTP、超純水，10 μ 1樣品DNA模板或者定量試劑。
[0025] 本發(fā)明所述的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒在檢測(cè)牛白血病的應(yīng)用。
[0026] 有益效果：本發(fā)明提供了一種操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高的牛白血病的實(shí) 時(shí)定量PCR的檢測(cè)試劑盒。利用該試劑盒，可以對(duì)牛、綿羊、水牛全血樣品以及牛奶、羊奶樣 品中病毒的核酸片段進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，篩選出牛白血病病毒DNA陽性動(dòng)物。本發(fā)明 具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] (1)本發(fā)明可以特異性地檢測(cè)牛白血病DNA。本發(fā)明依托牛白血病病毒DNA序列， 選擇相對(duì)保守的區(qū)間巧妙的設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針檢測(cè)牛白血病病毒。
[0028] (2)本發(fā)明具有較高的靈敏度，單個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)可以擴(kuò)增10個(gè)拷貝的牛白血病病毒 DNA。對(duì)牛白血病病毒早期感染的篩查診斷有顯著意義。
[0029] (3)本發(fā)明操作便捷，適合于檢測(cè)大量樣本。在實(shí)際應(yīng)用中，如流行病學(xué)調(diào)查或檢 測(cè)大量送檢樣品，對(duì)于普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳等方法需要極大的工作量。而本發(fā)明 可以從大量樣本中篩選出含有牛白血病病毒核酸的樣本，從而判斷出被感染的動(dòng)物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的熒光定量PCR上游引物的示意圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明的熒光定量PCR下游引物的示意圖；
[0032] 圖3是本發(fā)明的熒光定量PCR 6-FAM探針示意圖；
[0033] 圖4是本發(fā)明的熒光定量PCR LCRed640探針示意圖；
[0034] 圖5牛全血樣品PCR擴(kuò)增曲線的示意圖；
[0035] 圖6牛全血樣品PCR溶解曲線的示意圖；
[0036] 圖7牛奶樣品PCR擴(kuò)增曲線的示意圖；
[0037] 圖8牛奶樣品PCR溶解曲線的示意圖；
[0038] 圖9本發(fā)明的熒光定量PCR敏感性測(cè)試擴(kuò)增曲線示意圖；
[0039] 圖10本發(fā)明的熒光定量PCR敏感性測(cè)試統(tǒng)計(jì)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0041] 如圖1至圖10所示，本發(fā)明的一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的FRET-PCR引 物、探針和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，所述FRET-PCR引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探 針和LCRed640探針；
[0042] 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列；
[0043] 所述下游引物具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列；
[0044] 所述6-FAM探針具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列；
[0045] 所述LCRed640探針具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列；
[0046] 所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板具有SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
[0047] 本發(fā)明的一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，所述試劑盒包括： FRET-PCR引物、6-FAM探針、LCRed640探針、PCR緩沖液、熱啟動(dòng)Taq酶、dNTP、標(biāo)準(zhǔn)陽性模 板、對(duì)照品；所述對(duì)照品為超純水。
[0048] 所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探針對(duì)牛白血病前病毒DNA進(jìn) 行擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增核苷酸片段插入PUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
[0049] 所述FRET-PCR引物的終始濃度為0. 2 μ M ;所述6-FAM探針的終始濃度為0. 2 μ M ; 所述LCRed640探針的終始濃度為0. 2 μ Μ。
[0050] 所述熱啟動(dòng)Taq酶的終始濃度為2. 0U/20 μ L ;所述dNTP的終始濃度為5 μ M ;所述 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的終始濃度為5ng ;所述對(duì)照品的終始濃度為5ng。
[0051] 本發(fā)明的一種牛白血病的熒光定量PCR的擴(kuò)增檢測(cè)體系，所述擴(kuò)增檢測(cè)體系包括 20 μ 1的PCR擴(kuò)增檢測(cè)體系：DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑10 μ I、IxPCR緩沖液、1 μ M上游引 物、1 μ M下游引物、0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的LCRed640探針、2個(gè)單位的Taq酶和 200 μ M dNTP〇
[0052] 本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行牛白血病的熒光定量PCR的檢測(cè)方法，在孔板中加入試 齊U，加樣完畢后，將孔板放入系統(tǒng)中，設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性、18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循 環(huán)、30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)、1個(gè)持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個(gè)降溫循環(huán)；
[0053] 預(yù)變性：l*2min@95°C ;18 個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)：6*lsec@95°C，12sec@70°C， 8seci72〇C ；9*lseci95〇C, 12seci68〇C, 8seci72〇C ；3*lseci95〇C, 12seci66〇C , 8seci72〇C ；
[0054] 30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)：30*lsec@95 °C，30sec@56 °C (在此收集熒 光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個(gè)熔解循環(huán)：l*lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù) 收集熒光；I個(gè)降溫循環(huán)：l*lsec@38°C。
[0055] 所述孔板為96孔板,所述系統(tǒng)為羅氏LightCyc〗er?480II系統(tǒng)；加入檢測(cè)牛白血 病的熒光定量PCR的試劑盒10 μ 1，所述試劑盒包括IxPCR緩沖液、1 μ M FRET-上游引物、 1 μ M FRET-下游引物、0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的LCRed640探針、2個(gè)單位的Taq酶、 200 μ M dNTP、超純水，10 μ 1樣品DNA模板或者定量試劑。
[0056] 本發(fā)明提供了一種操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高的牛白血病的實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測(cè)試劑盒。利用該試劑盒，可以對(duì)牛、綿羊、水牛全血樣品以及牛奶、羊奶樣品中病毒的 核酸片段進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，篩選出牛白血病病毒DNA陽性動(dòng)物。本發(fā)明具有如下優(yōu) 占·
[0057] (1)本發(fā)明可以特異性地檢測(cè)牛白血病DNA。本發(fā)明依托牛白血病病毒DNA序列， 選擇相對(duì)保守的區(qū)間巧妙的設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針檢測(cè)牛白血病病毒。
[0058] (2)本發(fā)明具有較高的靈敏度，單個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)可以擴(kuò)增10個(gè)拷貝的牛白血病病毒 DNA。對(duì)牛白血病病毒早期感染的篩查診斷有顯著意義。
[0059] (3)本發(fā)明操作便捷，適合于檢測(cè)大量樣本。在實(shí)際應(yīng)用中，如流行病學(xué)調(diào)查或檢 測(cè)大量送檢樣品，對(duì)于普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳等方法需要極大的工作量。而本發(fā)明 可以從大量樣本中篩選出含有牛白血病病毒核酸的樣本，從而判斷出被感染的動(dòng)物。
[0060] 實(shí)施例1
[0061] 奶牛全血樣品牛白血病病毒DNA檢測(cè)
[0062] (1)樣品DNA的提取
[0063] 奶牛全血樣品為EDTA真空采血管采集，取200 μ 1，用商品化試劑盒羅氏High Pure PCR Template Preparation Kit 提取核酸，稀釋到 200 μ 1。
[0064] (2)樣品檢測(cè)
[0065] 在96孔板中加入熒光定量PCR混合試劑IOyl(包含IxPCR緩沖液、IyM FRET-上游引物、1 μ M FRET-下游引物、0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的LCRed640探 針、2個(gè)單位的Taq酶、200μΜ dNTP、超純水），10μ1樣品DNA模板或者定量試劑。操 作中注意無菌、避光。加樣完畢后，將96孔板放入羅氏LightCycler?480II系統(tǒng)中， 設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性、18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)、30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)、 1個(gè)持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個(gè)降溫循環(huán)。預(yù)變性：l*2min@95°C ;18個(gè)溫度遞 減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)：6*lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C ;9*lsec@95 °C，12sec@68 ?， 8sec@72 °C ;3*lsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72 °C ;30 個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)： 30*lsec@95°C，30sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個(gè)熔解循 環(huán)：l*lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù)收集熒光；降溫循環(huán)：l*lsec@38°C。
[0066] 檢測(cè)結(jié)果如圖5和圖6所示，93份奶牛全血核酸樣品中，標(biāo)準(zhǔn)陽性模板9份，陰性 樣品84份，標(biāo)準(zhǔn)陽性模板呈陽性，陰性對(duì)照呈陰性，空白孔呈陰性。
[0067] 如圖1至圖4所不，從GenBank(www. ncbi. nlm. nih. gov)獲取如下牛白血病病 毒的基因序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對(duì)所有序列進(jìn)行 比 對(duì)：Bovine leukemia virus (AF257515), Bovine leukemia virus (D00647), Bovine leukemia virus (EF600696) , Bovine leukemia virus (FJ914764) , Bovine leukemia virus (HE967 301) , Bovine leukemia virus (HE967 303) , Bovine leukemia virus (K02120)，Bovine leukemia virus (NC001414), Bovine leukemia virus(AF033818)，Bovine leukemia virus(HE967302)，Bovine leukemia virus(M10987)。 據(jù)此，設(shè)計(jì)的定量FRET-PCR引物和探針。
[0068] 本發(fā)明選擇牛白血病前病毒DNA的gag基因作為目標(biāo)基因，并選擇其相對(duì)保守的 區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。總體的思路是：巧妙地設(shè)計(jì)FRET-qPCR的引物和探針，可以特異地?cái)U(kuò) 增牛白血病病毒的核酸，從而快速地從大量樣本中的判斷出牛白血病DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0069] 上游引物：5'-CCTCAATTCCCTTTAAACTAGAACG-3'
[0070] 下游引物：5,-ATGGGCTTTGTAAGAGCATTTGTA-3'
[0071] 6-FAM 探針：5' -GACGGGCCAGGCAATAATCCAGT-6-FAM-3'
[0072] LCRed640 探針：5' -LCRed640-TTCCCGGTACGGAAACCAAATGG-磷酸-3'
[0073] 實(shí)施例2
[0074] 實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于：樣品性質(zhì)由血液樣品變?yōu)槿橐簶悠贰?br> [0075] 牛奶樣品牛白血病病毒檢測(cè) [0076] (1)樣品DNA的提取
[0077] 牛奶樣品為50ml無菌離心管采集，取IOml牛奶樣品加入15ml離心管中，使用冷 凍離心機(jī)，KTC，5, 000g，10分鐘。棄去脂肪層和懸浮層，沉淀物用PBS勻速吹打15分鐘。
[0078] (2)檢測(cè)結(jié)果
[0079] 如圖7和圖8所示，50份牛奶核酸樣品中，標(biāo)準(zhǔn)陽性模板7份，陰性樣品43份，標(biāo) 準(zhǔn)陽性模板呈陽性，陰性對(duì)照呈陰性，空白孔呈陰性。
[0080] 實(shí)施例3
[0081] 如圖9和圖10所示，本發(fā)明的檢測(cè)牛白血病病毒DNA的敏感性試驗(yàn)。將計(jì)數(shù)后 的牛白血病病毒DNA陽性質(zhì)粒酶切后稀釋到1*10 5拷貝/yL, 1*104拷貝/yL, 1*103拷貝 / μ L，1*102拷貝/ μ L，10拷貝/ μ L，1拷貝/ μ L，從每個(gè)濃度DNA中取10 μ L用熒光定量 PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行反應(yīng)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。通過6個(gè)濃度梯度的 質(zhì)粒DNA的突光PCR反應(yīng)，并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖9、圖10所示。圖9所示，所有稀釋梯度的 陽性質(zhì)粒均能被檢出，各梯度的擴(kuò)增曲線緊密。圖10所示，Ct值和稀釋度的線性關(guān)系統(tǒng)計(jì) 圖中，R 2 = 0· 9702,回歸效果顯著。
[0082] 實(shí)施例4
[0083] 本發(fā)明的檢測(cè)牛白血病病毒DNA的試劑盒的重復(fù)性試驗(yàn)。以1*105/ μ L濃度的標(biāo) 準(zhǔn)質(zhì)粒作為起始模板，并以10倍梯度稀釋成4個(gè)不同梯度（1*104/μ?，1*103/μ?，1*10 2/ μ L)，重復(fù)10次反應(yīng)，結(jié)果見下表1。
[0084] 表 1
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，包括FRET-PCR引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)陽性 模板，其特征在于：所述FRET-PCR引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探針和 LCRed640 探針； 所述上游引物具有SEQIDNo. 1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQIDNo. 2的核苷酸序列； 所述6-FAM探針具有SEQIDNo. 3的核苷酸序列； 所述LCRed640探針具有SEQIDNo. 4的核苷酸序列； 所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板具有SEQIDNo. 5的核苷酸序列。
2. -種檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括： FRET-PCR引物、6-FAM探針、LCRed640探針、PCR緩沖液、熱啟動(dòng)Taq酶、dNTP、標(biāo)準(zhǔn)陽性模 板、對(duì)照品；所述對(duì)照品為超純水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于：所述 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探針對(duì)牛白血病前病毒DNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得的 擴(kuò)增核苷酸片段插入PUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于：所述 FRET-PCR引物的終始濃度為0. 2μM;所述6-FAM探針的終始濃度為0. 2μM;所述LCRed640 探針的終始濃度為0.2μΜ。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于：所述 熱啟動(dòng)Taq酶的終始濃度為2. 0U/20μL;所述dNTP的終始濃度為5μM;所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板 的終始濃度為5ng;所述對(duì)照品的終始濃度為5ng。
6. -種牛白血病的熒光定量PCR的擴(kuò)增檢測(cè)體系，其特征在于：所述擴(kuò)增檢測(cè)體系包 括20μ1的PCR擴(kuò)增檢測(cè)體系：DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑10μI、IxPCR緩沖液、1μM上游 弓丨物、1μM下游引物、0. 2μM的6-FAM探針、0. 2μM的LCRed640探針、2個(gè)單位的Taq酶和 200μMdNTP〇
7. 利用權(quán)利要求2-5所述的試劑盒進(jìn)行牛白血病的熒光定量PCR的檢測(cè)方法，其特征 在于：在孔板中加入試劑，加樣完畢后，將孔板放入系統(tǒng)中，設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性、18個(gè) 溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)、30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)、1個(gè)持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個(gè) 降溫循環(huán)； 預(yù)變性：l*2min@95°C;18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)：6*lsec@95°C，12sec@70°C， 8seci72〇C；9*lseci95〇C, 12seci68〇C, 8seci72〇C；3*lseci95〇C, 12seci66〇C, 8seci72〇C； 30個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)：30*lsec@95 °C，30sec@56°C(在此收集熒 光），30sec@67°C，and30sec@72°C;1 個(gè)熔解循環(huán)：l*lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù) 收集熒光；I個(gè)降溫循環(huán)：l*lsec@38°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒進(jìn)行牛白血病的熒光定量PCR的檢測(cè)方法，其特征在 于：所述孔板為96孔板,所述系統(tǒng)為羅氏LightCycler? 480II系統(tǒng)；加入檢測(cè)牛白血病的 熒光定量PCR的試劑盒10μ1，所述試劑盒包括IxPCR緩沖液、1μMFRET-上游引物、1μM FRET-下游引物、0. 2μM的6-FAM探針、0. 2μM的LCRed640探針、2個(gè)單位的Taq酶、200μM dNTP、超純水，10μ1樣品DNA模板或者定量試劑。
9. 權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)牛白血病的熒光定量PCR的試劑盒在檢測(cè)牛白血病 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313185SQ201410597176
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】王成明, 楊奕, 陸光武, 楊章平, 毛永江, 郭偉娜, 危藍(lán)菁, 張繼壘, 李靜 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)