用于檢測rs1800497的引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法，具體設(shè)及用于檢測rsl800497 的A等位基因和G等位基因的引物組合物、基于前述兩種引物組合物的檢測試劑盒W及基 于前述檢測試劑盒的檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多己胺值opamine，DA)，是在人體大腦內(nèi)含量最為豐富的兒茶酪胺類神經(jīng)遞質(zhì)，可 調(diào)控人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，并且與多種神經(jīng)精神類疾?。ㄈ缇?神分裂、帕金森病等）的發(fā)生密切相關(guān)。因此，近年來關(guān)于多己胺的分泌調(diào)控及其受體編碼 基因的研究，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點。
[0003]DA在進行神經(jīng)內(nèi)分泌功能調(diào)控作用時，主要通過其相應(yīng)的膜受體來發(fā)揮功能。研 究者們已成功分離出五種多己胺受體（DA2R),根據(jù)受體的生物化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可分為 D1和D2兩類受體。其中，D1類受體包括D1和D5兩種類型，而D2類受體包括D2、D3和D4 Ξ種受體。
[0004]目前，多己胺受體基因多態(tài)性與神經(jīng)性精神病的相關(guān)性研究工作的重點主要集中 在D2受體上，D2受體由位于11號染色體llq23. 2的多己胺受體D2 (dopamine rec巧tor D2, D畑2)基因D畑2編碼，與D畑2基因相鄰的錯蛋白重復(fù)和激酶域1 (ankyrin repeat and kinase domain containing Ι,ΑΝΚΚΙ)基因近來同樣受到了臨床研究者們的關(guān)注。ANKKl 基因與DRD2基因存在片段重疊和共享單倍型區(qū)域，其8號外顯子上存在1個單核巧酸多態(tài) 性位點（SNP)rsl800497(c. 2317G〉A(chǔ)，Glu71：3Lys)，又稱D畑2TaqlA多態(tài)性。有證據(jù)顯示，攜 帶該SNP位點的等位基因可使大腦紋狀體內(nèi)的DRD2密度下降，攜帶DRD化S1800497A等位 基因的患者在應(yīng)用第二代抗精神病藥治療期間靜坐不能不良反應(yīng)的發(fā)生率顯著高于該位 點GG基因型患者。所WCFDA發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用祀點基因檢測技術(shù)指南（試 行）》指出，"攜帶rsl800497A等位基因的患者應(yīng)用第二代抗精神病藥時靜坐不能不良反應(yīng) 的發(fā)生風(fēng)險增加，應(yīng)注意。"
[0005] 目前，研究者們測定類多己胺D2受體的基因型時，采用的方法主要是PCR-RFLP 法、測序法運兩種。然而，運兩種方法操作繁瑣，需要反復(fù)開管操作，容易造成交叉污染，并 且測序法需要依賴非常昂貴的進口設(shè)備及試劑，更加難W大規(guī)模推廣。所W，開發(fā)一種價格 低廉，并且操作簡便，適合臨床大范圍普及推廣的DBD2等位基因的基因檢測試劑盒，對于 神經(jīng)精神類疾病患者臨床藥物檢測方面的工作來講，具有非常大的價值。
[0006]環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)是日本 科學(xué)家于2000年提出的一種核酸恒溫擴增技術(shù)，其主要特點是針對祀基因的6個區(qū)域設(shè)計 4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶度StDNApolymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需 15-90分鐘即可產(chǎn)生109-1〇1°數(shù)量級的產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼直接觀察體系狀態(tài)的改 變來判定待測樣本的基因型，無需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可W有效避免樣 本交叉污染，而且，僅需普通水浴鍋即可開展檢測，又節(jié)約了大量的檢測成本。
[0007] LAMP相對于其他W PCR為基礎(chǔ)的檢測手段而言，具有W下優(yōu)越性：
[0008] (1)靈敏度高：LAMP擴增模板可低至6個拷貝，比傳統(tǒng)PCR法高出1000倍，具有與 實時化qman PCR同樣的靈敏度；
[0009] (2)特異性好：LAMP反應(yīng)需要針對待擴增模板6個區(qū)域設(shè)計4條引物，只有運4條 引物都能完全與模板配對才能引發(fā)后續(xù)的擴增；
[0010] (3)操作簡便、成本低廉：LAMP只需配置好反應(yīng)體系并置于等溫條件的水浴鍋或 者其他恒溫設(shè)備即可，無需任何昂貴的設(shè)備儀器，大大降低檢測成本；
[0011] (4)結(jié)果易于判定：LAMP反應(yīng)的結(jié)果檢測甚至無需電泳，只需通過肉眼直接觀察 擴增管的濁度或者反應(yīng)體系的顏色變化來判定結(jié)果即可。
[0012] 因此，LAMP是一種非常值得推廣的檢測手段。
[001引本發(fā)明在LAMP的基礎(chǔ)上，采用等位基因特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Allele-Specific LAMP)技術(shù)，在特異性要求最為嚴格的Flc或者Blc的5'端（參照圖 1)，針對rsl800497的A等位基因和G等位基因設(shè)計特異引物W及檢測用的組合物及方法， 用于指導(dǎo)第二代抗精神病藥的個體化用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于：提供一種用于檢測rsl800497的A等位基因和G等位基因 的引物組合物，并提供一種基于前述兩種引物組合物的用于檢測rsl800497的檢測試劑 盒，同時在LAMP的基礎(chǔ)上提供一種基于該檢測試劑盒和等位基因特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 (Allele-Specific LAMP)技術(shù)的用于檢測rsl800497的方法，用于指導(dǎo)第二代抗精神病藥 的個體化用藥。
[0015] 為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0016] 一種用于檢測rsl800497的A等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物 由4條引物組成，前述4條引物的序列分別為：
[0017] F3A GCTTAGAACCACCCAGAGTG
[0018] B3A TGTCCACGCCCGCAA
[0019] FIPA ACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC
[0020] ΒΙΡΑ TGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG,
[002。其中，ΒΙΡΑ是檢測A等位基因的特異引物。
[0022] 一種用于檢測rsl800497的G等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物 由4條引物組成，前述4條引物的序列分別為：
[0023] F3G TGCCCTGCTTTCGGCT
[0024] B3G GTCCACGCCCGCAAC
[00巧]FIPG GCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC
[0026] BIPG CGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG,
[0027] 其中，BIPG是檢測G等位基因的特異性引物。
[0028] 一種用于檢測rsl800497的檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒由反應(yīng)體系A(chǔ) 和反應(yīng)體系G組成，
[0029] 前述反應(yīng)體系A(chǔ)的組分及含量為：
[0030]
[0031] 4條引物的序列分別為：
[0032]F3AGCTTAGAACCACCCAGAGTG
[0033]B3ATGTCCACGCCCGCAA
[0034]FIPAACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC
[0035]ΒΙΡΑTGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG；
[0036] 前述反應(yīng)體系G的組分及含量為：
[0037]
[003引4條引物的序列分別為：
[0039]F3GTGCCCTGCTTTCGGCT
[0040]B3GGTCCACGCCCGCAAC
[0041]FIPGGCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC
[0042]BIPGCGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG。
[0043] 一種用于檢測rsl800497的方法，其特征在于，該檢測方法基于前述的檢測試劑 盒，包括W下步驟：
[0044] -、抽取靜脈血W邸TA抗凝管保存，每管取200ul血液，用DNA提取試劑盒提取全 基因組DNA作為檢測的模板，W超純水代替模板做陰性對照；
[0045] 二、將模板或超純水分別加入到反應(yīng)體系A(chǔ)和反應(yīng)體系G中，于60°C下反應(yīng) 80min，之后升溫至80°C滅活20min，觀察體系顏色變化即可。
[0046] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0047] -、引物組合物
[0048] LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵在于初始階段形成的由Blc為5'端，F(xiàn)1為3'端的啞鈴狀結(jié)構(gòu)， 運個結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形成是發(fā)生后續(xù)LAMP反應(yīng)的前提，本發(fā)明針對運一特征，結(jié)合待測DNA的 序列特點，將特異性引物設(shè)計在Blc的5'端，同時，又在其5'端的第Ξ位人為引進一個突 變，進一步加強了引物的特異性，有效防止了假陽性的產(chǎn)生。