[004引二檢測(cè)試劑盒
[0050] 價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適合臨床大范圍普及推廣。
[0051] Ξ、檢測(cè)方法
[0052] 方法操作簡(jiǎn)便，只需一步加樣，兩小時(shí)內(nèi)就可給出檢測(cè)結(jié)果；同時(shí)，僅需普通的水 浴鍋就可W開展檢測(cè)，又極大的節(jié)約了成本，非常值得推廣。
【附圖說明】
[0053] 圖1是rsl800497的序列圖；
[0054] 圖2是對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行電泳后得到的電泳圖；
[0055] 圖3是Ml的測(cè)序圖譜；
[0056] 圖4是M2的測(cè)序圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0057]W下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。
[0058] 一、準(zhǔn)備檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)體系A(chǔ)
[0059] 反應(yīng)體系A(chǔ)為25 μ L其內(nèi)的組分及含量見表1。
[0060] 表1反應(yīng)體系A(chǔ)的組分及含量
[0061]
[0062] 在反應(yīng)體系A(chǔ)中，4條引物的序列分別為：
[0063]F3AGCTTAGAACCACCCAGAGTG；
[0064]B3ATGTCCACGCCCGCAA；
[00巧]FIPAACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC;
[0066]ΒΙΡΑTGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG。
[0067] 其中，ΒΙΡΑ是檢測(cè)A等位基因的特異性引物。
[0068] 二、準(zhǔn)備檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)體系G
[0069] 反應(yīng)體系G也為25μ以其內(nèi)的組分及含量見表2。
[0070] 表2反應(yīng)體系G的組分及含量
[0071]
[0072]
[0073] 在反應(yīng)體系G中，4條引物的序列分別為：
[0074]F3GTGCCCTGCTTTCGGCT；
[00巧]B3GGTCCACGCCCGCAAC;
[0076]FIPGGCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC；
[0077]BIPGCGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG。
[007引其中，BIPG是檢測(cè)G等位基因的特異性引物。
[0079]Ξ、利用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)rsl800497
[0080] 抽取2人1ml靜脈血W邸ΤΑ抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者其它 公司的DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書提取全基因組DNA作為檢測(cè)的模板，分別標(biāo)記為 Ml和M2,另有兩個(gè)W超純水代替模板的陰性對(duì)照，分別標(biāo)記為M3和M4。
[0081] 將Ml、M2、M3和M4都分成兩份，一份針對(duì)A等位基因（記為A組），另一份針對(duì)G 等位基因（記為G組），在A組中取30ng(20-100ng均可）Ml、M2、M3、M4,分別加入到四個(gè) 反應(yīng)體系A(chǔ)中，在G組中也取30ngMl、M2、M3、M4,分別加入到四個(gè)反應(yīng)體系G中，于60°C 下反應(yīng)80min，之后升溫至80°C滅活20min，觀察體系顏色變化即可。
[0082] 反應(yīng)按照上述的檢測(cè)方法進(jìn)行，反應(yīng)前，體系顏色均為紫羅蘭色，反應(yīng)后，各組別 反應(yīng)體系的顏色及基因型判斷如表1所示：
[0083] 表1
[0084]
[00財(cái) 四、評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果
[0086] 為驗(yàn)證反應(yīng)的準(zhǔn)確性，對(duì)上述組別的LAMP產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用2%的瓊脂糖凝膠電 泳鑒定，6v/cm電壓下電泳30min。
[0087] 電泳結(jié)果參見圖2。其中，Μ為l(K)bp的DMladder,從上致下依次為5000bp、 SOOObp、2000bp、1500bp、lOOObp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和 10化p。第1組和第2組的反應(yīng)體系A(chǔ)和反應(yīng)體系G都呈現(xiàn)典型的梯狀條帶，第3組（C組） 沒有條帶。電泳檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明的檢測(cè)方法的結(jié)果相同。
[0088] 為進(jìn)一步驗(yàn)證反應(yīng)的準(zhǔn)確性，將上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)組別的模板分別用PCR-測(cè)序法進(jìn)行 分型，得到的測(cè)序圖譜參見圖3和圖4。
[0089] 對(duì)比基因測(cè)序圖譜和本發(fā)明提供的檢測(cè)引物組的檢測(cè)結(jié)果可知，二者的檢測(cè)吻合 率100%，驗(yàn)證了本發(fā)明的結(jié)果精準(zhǔn)。
[0090] 五、小結(jié)
[0091] 綜上所述，本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒能夠準(zhǔn)確的判斷反應(yīng)樣本的基因型，并且使 用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，還具有W下諸多優(yōu)勢(shì)：
[0092] 1、步驟簡(jiǎn)單：擴(kuò)增DNA只需反應(yīng)體系配置完畢后放置在恒溫水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò) 增即可，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應(yīng)中的反復(fù)變性、退火、延伸 等變溫過程；
[0093] 2、擴(kuò)增反應(yīng)快速、高效、特異性高：整個(gè)擴(kuò)增比即可完成，且產(chǎn)率高；
[0094] 3、鑒定簡(jiǎn)便：反應(yīng)完成后通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，且結(jié)果的可視觀 察可W脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上擴(kuò)增是等溫進(jìn)行，不用依賴PCR儀復(fù)雜 的循環(huán)溫度變化來完成，在水浴鍋中就能進(jìn)行，使該檢測(cè)試劑盒有著更廣闊的應(yīng)用前景。
[0095] 需要說明的是，上述實(shí)施例不W任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變 換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)rsl800497的A等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物由 4條引物組成，所述4條引物的序列分別為： F3A GCTTAGAACCACCCAGAGTG B3A TGTCCACGCCCGCAA FIPA ACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC ΒΙΡΑ TGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG, 其中，ΒΙΡΑ是檢測(cè)Α等位基因的特異引物。2. -種用于檢測(cè)rsl800497的G等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物由 4條引物組成，所述4條引物的序列分別為： F3G TGCCCTGCTTTCGGCT B3G GTCCACGCCCGCAAC FIPG GCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC BIPG CGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG， 其中，BIPG是檢測(cè)G等位基因的特異性引物。3. -種用于檢測(cè)rsl800497的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該檢測(cè)試劑盒由反應(yīng)體系A(chǔ)和 反應(yīng)體系G組成， 所述反應(yīng)體系A(chǔ)的組分及含量為：4條引物的序列分別為： F3A GCTTAGAACCACCCAGAGTG B3A TGTCCACGCCCGCAA FIPA ACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC ΒΙΡΑ TGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG ； 所述反應(yīng)體系G的組分及含量為：4條引物的序列分別為： F3G TGCCCTGCTTTCGGCT B3G GTCCACGCCCGCAAC FIPG GCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC BIPG CGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG。4. 一種用于檢測(cè)rsl800497的方法，其特征在于，該檢測(cè)方法基于權(quán)利要求3所述的檢 測(cè)試劑盒，包括以下步驟： 一、 抽取靜脈血以Η)ΤΑ抗凝管保存，每管取200ul血液，用DNA提取試劑盒提取全基因 組DNA作為檢測(cè)的模板，以超純水代替模板做陰性對(duì)照； 二、 將模板或超純水分別加入到反應(yīng)體系A(chǔ)和反應(yīng)體系G中，于60°C下反應(yīng)80min，之 后升溫至80°C滅活20min，觀察體系顏色變化即可。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測(cè)rs1800497的引物組合物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，其中，將特異性引物設(shè)計(jì)在B1c的5’端，同時(shí)，又在其5’端的第三位人為引進(jìn)一個(gè)突變，進(jìn)一步加強(qiáng)了引物的特異性，有效防止了假陽性的產(chǎn)生；利用前述特異性引物組合物制作而成的檢測(cè)試劑盒，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適合臨床大范圍普及推廣；基于前述檢測(cè)試劑盒和Allele-Specific？LAMP技術(shù)的檢測(cè)rs1800497的方法，操作簡(jiǎn)便，只需一步加樣，兩小時(shí)內(nèi)就可給出檢測(cè)結(jié)果，并且僅需普通的水浴鍋就可以開展檢測(cè)，又極大的節(jié)約了成本，非常值得推廣。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105331692
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510731908
【發(fā)明人】張井存, 汪大為
【申請(qǐng)人】北京晉祺生物科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年11月2日