專利名稱：光致細胞脫附的方法及其所使用的細胞培養(yǎng)器具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種光致細胞脫附的方法及其所使用的細胞培養(yǎng)器具。
背景技術(shù)：
體外細胞培養(yǎng)(in vitro cell culture)是目前生物醫(yī)藥技術(shù)、生物材料方面的研究必不可少的技術(shù)。在體外細胞培養(yǎng)中如何減少外界不確定因素對細胞行為的不利影響、使之有效附著、增殖、分化，并在需要的時候與培養(yǎng)基分離，從而細胞水平上體現(xiàn)對藥物或材料的響應(yīng)，這些直接影響新藥物與新型醫(yī)用材料的研發(fā)。在體外細胞培養(yǎng)所涉及的細胞中，很多為貼壁細胞。通常采用在聚苯乙烯的細胞培養(yǎng)器具中進行細胞培養(yǎng)，貼壁細胞一般通過細胞外基質(zhì)(ECM)和整合素等較為牢固地附著在細胞培養(yǎng)器具表面。研究發(fā)現(xiàn)，基底材料表面的宏觀親水憎水特性也對細胞能否附著以及增殖和分化等行為有著非常重要的影響。細胞傾向于附著在微憎水的表面上，而不易于附著于親水的表面之上。在涉及到對一些細胞相關(guān)酶活性表征時，需要先要使細胞從表面上脫離下來?，F(xiàn)有的脫附方法一種是通過鏟刀以機械力剝離細胞；另一種是采用以胰酶為代表的消化酶將連接細胞與培養(yǎng)基材的細胞外基質(zhì)和整合素等消化，使細胞脫離基材表面。前一種方式中以機械力剝離細胞肯定會對細胞造成一定的損傷，而后一種方式中胰酶的用量和作用時間則需要較為精確的控制，否則可能同時將細胞膜蛋白消化，從而損傷細胞。而且，由于ECM等本身即具有一定的生物學功能，完全脫離了 ECM的細胞能否完整、可靠地反映出所要表征的效應(yīng)，也還存在疑問。近年來，OKANO等采用溫敏聚合物利用其憎水親水特性可隨溫度變化的特性成功地通過溫度變化實現(xiàn)了細胞從細胞培養(yǎng)器皿上分離[N. Matsuda, T. Shimizu, M. Yamato, T. Okano，Tissue Engineering Based on Cell Sheet Technology, Advanced Materials， 2007，19,3089-3099]。但是，以溫度作為外場仍需要較長的時間，而所需的低溫過程在一定程度可損傷細胞的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附的方法及其所使用的細胞培養(yǎng)器具，可最大程度減小在細胞脫附時對細胞的損傷。一種用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附的方法，包括以下步驟(I)在進行體外細胞培養(yǎng)前，在細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面，所述光敏半導體為具有光至憎水-親水轉(zhuǎn)換特性的光敏半導體，所述光敏半導體結(jié)構(gòu)層為光敏半導體薄膜或光敏半導體微納點陣，其中，所述光敏半導體薄膜的晶粒尺寸為2 lOOnm，厚度為50nm 2000nm，所述光敏半導體微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. OX 101° I X IO1Vcm2，點尺寸范圍在IOnm 500nm ;(2)在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面上進行并完成體外細胞培養(yǎng)后，通過紫外光或可見光照射處理使生長于所述細胞培養(yǎng)表面的細胞從所述細胞培養(yǎng)器皿脫附。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述光敏半導體為氧化鈦、氧化鋅、氧化錫、氧化鐵或氧化鋯。 即，所述光敏半導體薄膜為氧化鈦薄膜、氧化鋅薄膜、氧化錫薄膜、氧化鐵薄膜或氧化鋯薄膜；所述光敏半導體微納點陣為氧化鈦微納點陣、氧化鋅微納點陣、氧化錫微納點陣、氧化鐵微納點陣或氧化鋯微納點陣。其中，所述的紫外光或可見光照射處理的過程為將波長為300 400納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射I 40分鐘；或者，將波長為400 700納米的可見光從細胞培養(yǎng)器皿細胞培養(yǎng)表面或底部入射，照射10 60分鐘。一種用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附時所使用的細胞培養(yǎng)器具，包括細胞培養(yǎng)器皿，其中，在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備有光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面，所述光敏半導體為具有光至憎水-親水轉(zhuǎn)換特性的光敏半導體，所述光敏半導體結(jié)構(gòu)層為光敏半導體薄膜或光敏半導體微納點陣，其中，所述光敏半導體薄膜的晶粒尺寸為2 lOOnm，厚度為50nm 2000nm，所述光敏半導體微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. OXlO10 lX1012/cm2，點尺寸范圍在IOnm 500nm ；優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述光敏半導體為氧化鈦、氧化鋅、氧化錫、氧化鐵或氧化鋯。 即所述光敏半導體薄膜為氧化鈦薄膜、氧化鋅薄膜、氧化錫薄膜、氧化鐵薄膜或氧化鋯薄膜；所述光敏半導體微納點陣為氧化鈦微納點陣、氧化鋅微納點陣、氧化錫微納點陣、氧化鐵微納點陣或氧化鋯微納點陣。本發(fā)明中所述細胞為在體外模擬生理環(huán)境下培養(yǎng)的貼壁細胞。所述細胞培養(yǎng)器皿為常用的細胞培養(yǎng)器皿，可從市場購得，通常由硅酸鹽玻璃、石英、聚苯乙烯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚丙烯酸酯制成。所述光敏半導體薄膜可以采用常規(guī)的溶膠-凝膠法、化學氣相沉積或物理氣相沉積等方法制備。所述光敏半導體微納點陣可以通過現(xiàn)有技術(shù)中的分相自組裝法、液相模板沉積、 氣相模板沉積、薄膜光刻法、水熱法或打印等方法制備。本發(fā)明中，利用細胞易于附著于較為憎水的表面而不易于附著于親水的表面等特性，選擇在光照射下表面可發(fā)生憎水向親水的轉(zhuǎn)變的光敏半導體材料，并在細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面形成光敏半導體薄膜或微納點陣作為細胞培養(yǎng)表面，這樣，所培養(yǎng)的細胞在經(jīng)光照射后，表面潤濕性發(fā)生變化，細胞自發(fā)從培養(yǎng)器具表面脫離，實現(xiàn)細胞脫附。因此，本發(fā)明中，所述光敏半導體薄膜或光敏半導體微納點陣也可以由光敏半導體的其他表面納米結(jié)構(gòu)替代，如納米棒陣列或納米棒薄膜、納米花陣列或納米花薄膜等。所述的光敏半導體優(yōu)選為氧化鈦、氧化鋅、氧化錫、氧化鐵或氧化鋯。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明方法具有細胞脫離效率高、對細胞損傷小、操作簡便、適用細胞范圍廣等特點，具有很強的實用性。本發(fā)明細胞培養(yǎng)器具只需對現(xiàn)有技術(shù)中的細胞培養(yǎng)器皿進行很小的改進，成本低，易于實現(xiàn)，便于推廣應(yīng)用。


圖I為采用倒置生物顯微鏡觀察實施例I中培養(yǎng)細胞在紫外光照前的倒置顯微圖。圖2為采用倒置生物顯微鏡觀察實施例I中培養(yǎng)細胞在紫外光照后的倒置顯微圖。圖3為采用MTS檢測法得到的實施例I和對照組中的脫離的細胞的MTS活性值對比圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實施例I以分相自組裝法在石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鈦微納點陣，過程如下按乙醇去離子水乙酰丙酮=0.3 I I (以摩爾比計)配制溶液，并按 O. 02mol/L加入鈦酸四正丁酯、按40g/L加入聚乙烯基吡咯烷酮(K-30)，形成前驅(qū)體溶液， 滴加到石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上，以6000轉(zhuǎn)每秒的速度旋涂40s，然后在 500°C下熱處理兩小時得到氧化鈦微納點陣作為細胞培養(yǎng)表面。該氧化鈦微納點陣中納米點的密度為I. OXlO1Vcm2,點尺寸為200nm 500nm。在上述石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面上進行骨細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為350納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射30分鐘，即可使91 %細胞從表面脫離。圖I和圖2分別為采用倒置生物顯微鏡所觀察到的實施例I中培養(yǎng)細胞在紫外光照前、后的倒置顯微圖。對比圖I和圖2，可以看出經(jīng)紫外光照射后大量細胞由梭形變成類球形，說明大量細胞即將脫離。采用MTS檢測法對實施例I和同樣條件下在標準細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)的對照組中的脫離的細胞的活性進行檢測，實施例I和對照組中的脫離的細胞的MTS活性值對比如圖3 所示，從圖3中可以看出，實施例I中脫離的細胞的活性值(0D值,optical density值,又稱吸光值)明顯高于同樣條件下在標準細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)的對照組中所脫離的細胞的活性值，說明光致脫離具有的很好的安全性，脫離的細胞仍具有很好的活性，其活性甚至高于對照組中所脫離的細胞的活性。上述MTS檢測法為本領(lǐng)域中常用的細胞活性檢測方法，其中所采用的MTS試劑也為常規(guī)試劑，可從Promega公司等生產(chǎn)廠家購得。MTS的化學名稱如下3- (4，5-dimethylthiazol-2-yl) _5_ (3-carboxymethoxyphenyl) ~2~ (4-sulfophe ny I)-2H_tetrazolium, inner salt。實施例2以化學氣相沉積法在硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鋅薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鋅薄膜晶粒尺寸為2 10nm，厚度為50nm。在上述硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為300納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射I分鐘，即可使70%細胞從表面脫離。
實施例3以物理氣相沉積法在聚乳酸細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鈦薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鈦薄膜晶粒尺寸為10 30nm，厚度為lOOOnm。在上述聚乳酸細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為365納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射25分鐘，即可使74%細胞從表面脫離。實施例4以液相模板沉積法在硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鐵微納點陣作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鐵微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. OX IO12/ cm2,點尺寸范圍在IOnm lOOnm。在上述娃酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為700納米的可見光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射25分鐘，即可使90% 細胞從表面脫離。實施例5以氣相模板沉積在聚羥基乙酸細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化錫薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化錫薄膜晶粒尺寸為20 80nm，厚度為2000nm。在上述聚羥基乙酸細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行上皮細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為300納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射5分鐘，即可使80%細胞從表面脫離。實施例6以溶膠-凝膠法在石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鐵薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鐵薄膜晶粒尺寸為50 lOOnm，厚度為800nm。在上述石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為420納米的可見光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射10分鐘，即可使72%細胞從表面脫離。實施例7以打印法在硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鈦微納點陣作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鈦微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. I X IO1Vcm2,點尺寸范圍在400nm 500nm。在上述硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行心肌細胞體外培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后，以波長為365納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射30分鐘，即可使66%細胞從表面脫離。實施例8以溶膠-凝膠法在聚丙烯酸酯細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鋯薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鋯薄膜晶粒尺寸為2 20nm，厚度為1500nm。在上述聚丙烯酸酯細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后，以波長為365納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射30分鐘，即可使85 %細胞從表面脫離。實施例9
以薄膜光刻法在具有氧化鈦薄膜的石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鈦微納點陣作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鈦微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在 I. OXlO1Vcm2,點尺寸范圍在300 500nm。在上述石英玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為320納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射10分鐘，即可使76%細胞從表面脫離。實施例10以水熱法在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鈦薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鈦薄膜晶粒尺寸為20 70nm，厚度為1200nm。在上述聚苯乙烯細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為300納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射15分鐘，即可使70%細胞從表面脫離。實施例11以溶膠-凝膠法在硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備氧化鋅薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，該氧化鋅薄膜晶粒尺寸為10 70nm，厚度為1800nm。在上述硅酸鹽玻璃細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后，以波長為300納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射I分鐘，即可使70%細胞從表面脫離。
權(quán)利要求
1.一種用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在進行體外細胞培養(yǎng)前，在細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面，所述光敏半導體為具有光至憎水-親水轉(zhuǎn)換特性的光敏半導體，所述光敏半導體結(jié)構(gòu)層為光敏半導體薄膜或光敏半導體微納點陣，其中，所述光敏半導體薄膜的晶粒尺寸為2 lOOnm，厚度為50nm 2000nm，所述光敏半導體微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. OX IOici I X IO1Vcm2,點尺寸范圍在IOnm 500nm ；(2)在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面上進行并完成體外細胞培養(yǎng)后，通過紫外光或可見光照射處理使生長于所述細胞培養(yǎng)表面的細胞從所述細胞培養(yǎng)器皿脫附。
2.如權(quán)利要求I所述的用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附的方法，其特征在于，所述光敏半導體為氧化鈦、氧化鋅、氧化錫、氧化鐵或氧化鋯。
3.如權(quán)利要求I或2所述的用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附的方法，其特征在于，所述的紫外光或可見光照射處理的過程為將波長為300 400納米的紫外光從細胞培養(yǎng)器皿底部入射，照射I 40分鐘；或者，將波長為400 700納米的可見光從細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面或底部入射， 照射10 60分鐘。
4.一種用于體外細胞培養(yǎng)中光致細胞脫附時所使用的細胞培養(yǎng)器具，包括細胞培養(yǎng)器皿，其特征在于，在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備有光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面，所述光敏半導體為具有光至憎水-親水轉(zhuǎn)換特性的光敏半導體，所述光敏半導體結(jié)構(gòu)層為光敏半導體薄膜或光敏半導體微納點陣，其中，所述光敏半導體薄膜的晶粒尺寸為2 lOOnm，厚度為50nm 2000nm，所述光敏半導體微納點陣中的半導體納米點的密度范圍在I. OXlO10 I X IO1Vcm2，點尺寸范圍在IOnm 500nm。
5.如權(quán)利要求4所述的細胞培養(yǎng)器具，其特征在于，所述光敏半導體為氧化鈦、氧化鋅、氧化錫、氧化鐵或氧化鋯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光致細胞脫附的方法及其所使用的細胞培養(yǎng)器具。該方法包括在進行體外細胞培養(yǎng)前，在細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面；再在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞培養(yǎng)表面上進行體外細胞培養(yǎng)；在體外細胞培養(yǎng)完成后，通過紫外光或可見光照射處理使生長于所述細胞培養(yǎng)表面的細胞從所述細胞培養(yǎng)器皿脫附。該方法可最大程度減小再細胞脫附時對細胞的損傷。該方法中所使用的細胞培養(yǎng)器具包括細胞培養(yǎng)器皿，并在所述細胞培養(yǎng)器皿的細胞接觸表面上制備有光敏半導體結(jié)構(gòu)層作為細胞培養(yǎng)表面。該器具只需對現(xiàn)有技術(shù)中進行很小的改進即可實現(xiàn)，成本低，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N5/00GK102586169SQ201210013668
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者洪逸, 程逵, 翁文劍 申請人:浙江大學