專利名稱：確定不同調(diào)控機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因貢獻(xiàn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可系統(tǒng)識(shí)別雙等位封閉基因。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生物被定義為在単一生物中，存在一系列基因組相同但生理功能不同的細(xì)胞。這通常是通過多潛能干細(xì)胞逐步分化和多祥化成功能專ー的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。作為ー個(gè)基本規(guī)則，盡管細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生波動(dòng)，但是分化后的細(xì)胞還是可以穩(wěn)定地保持其表型特征。在生物學(xué)中，細(xì)胞的特征在分子水平是如何維持的，是ー個(gè)核心的卻又知之甚少的問題。ー種可能的解釋是分化細(xì)胞的表型特征通過譜系不恰當(dāng)基因-如促進(jìn)其他不正常表達(dá)導(dǎo)致錯(cuò)誤細(xì)胞型出現(xiàn)的譜系基因的穩(wěn)定沉默得以維持。這ー解釋與人們對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄輸出是兩個(gè)不同輸入聯(lián)合產(chǎn)物認(rèn)識(shí)的增長(zhǎng)相一致。 第一個(gè)輸入是細(xì)胞的反式作用環(huán)境，定義為通過共同影響基因調(diào)節(jié)序列，促進(jìn)或抑制基因表達(dá)的所有擴(kuò)散性因子。第二個(gè)輸入是基因本身染色質(zhì)狀態(tài)的順式作用，定義為在基因位點(diǎn)上所有的染色質(zhì)標(biāo)記，如DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)因子的結(jié)合，這些因素共同確定基因位點(diǎn)如何應(yīng)答其環(huán)境。在染色質(zhì)沉默位點(diǎn)富有特定的染色質(zhì)標(biāo)記，如DNA甲基化和組蛋白去乙?；?。然而，大多數(shù)情況下，這些染色質(zhì)標(biāo)記對(duì)沉默狀態(tài)的確切貢獻(xiàn)不能與環(huán)境因素的影響區(qū)分開。因?yàn)楹茈y知道染色質(zhì)標(biāo)記是沉默的原因還是結(jié)果；或環(huán)境變化吋， 基因的沉默狀態(tài)及其相應(yīng)的染色質(zhì)標(biāo)記的可逆程度有多少。因此，是否基于染色質(zhì)的順式機(jī)制的基因沉默，在維持細(xì)胞類型特征時(shí)起關(guān)鍵作用仍需解決。單等位基因沉默如X染色體失活和遺傳印記，是以上不確定解釋的ー個(gè)明顯例外。在此，可以毫無疑問地確定沉默是不依賴于環(huán)境的染色質(zhì)順式作用機(jī)制的結(jié)果。單等位基因沉默的特征是在相同細(xì)胞內(nèi)，ー個(gè)基因的兩個(gè)拷貝的表達(dá)不同-一個(gè)沉默，ー個(gè)激活。激活的拷貝作為陽性對(duì)照，證明了有利于基因表達(dá)的環(huán)境是存在的。在這種情況下，處于同樣環(huán)境下的沉默拷貝，肯定是通過染色質(zhì)狀態(tài)的順式效應(yīng)來阻斷環(huán)境的影響。因此，至少在單等位基因沉默的情況下，ー個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄能力可以被確定為兩種狀態(tài)的ー種。ー種是“能動(dòng)的(competent) ”狀態(tài)，基因可以應(yīng)答細(xì)胞環(huán)境，如果適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄激活因子存在時(shí)基因激活，激活因子缺失或阻遏物存在時(shí)基因沉默；另一種可以被稱為“封閉的(occluded)” 狀態(tài)，基因不再能應(yīng)答細(xì)胞環(huán)境，即便存在有利于轉(zhuǎn)錄的環(huán)境，基因仍然保持沉默在發(fā)育過程中，ー些基因可能通過類似單等位基因沉默機(jī)制，逐漸雙等位封閉。這ー過程在維持細(xì)胞表型特征中可能起到了ー個(gè)必不可少的作用。驗(yàn)證這個(gè)模型的關(guān)鍵是雙等位封閉基因的識(shí)別。然而，陽性對(duì)照-相當(dāng)于單等位基因沉默中的激活拷貝-的缺乏使確定雙等位封閉基因的存在技術(shù)挑戰(zhàn)。沒有這樣ー個(gè)對(duì)照，不可能明確地區(qū)分ー個(gè)基因是處于封閉狀態(tài)，還是有轉(zhuǎn)錄能力但是因?yàn)檎T導(dǎo)環(huán)境的缺乏沒有表達(dá)。此外，可能以順式作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)的染色質(zhì)生化修飾是極其復(fù)雜的(如已有超過100種已知的染色質(zhì)標(biāo)記)，因此限制了利用“自下而上”的方法區(qū)分將順式與反式調(diào)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可系統(tǒng)識(shí)別雙等位封閉基因。在此描述的方法是融合至少兩種迥異不相近似的細(xì)胞，在融合細(xì)胞中捜索在一基因組中沉默但在另一基因組中激活的(表達(dá)的)基因。這些“迥異”或“不相近似”的細(xì)胞包括來自不同物種的細(xì)胞或來自同一物種的不同類型細(xì)胞。例如，一種重編程細(xì)胞可以提供與應(yīng)答細(xì)胞的環(huán)境不同的轉(zhuǎn)錄環(huán)境。不相似或迥異度可能不同，取決于使用細(xì)胞的類型。尤為適用于這種實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是那些容易培養(yǎng)的細(xì)胞，因?yàn)槭褂眉?xì)胞數(shù)量的増加可以提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度。與單等位基因沉默類似，激活的拷貝作為陽性對(duì)照，與之相比較，沉默拷貝的封閉狀態(tài)就可以得以確定。應(yīng)答細(xì)胞的封閉狀態(tài)與其相應(yīng)的重編程細(xì)胞有關(guān)。多種不同的重編程細(xì)胞可以類似地與應(yīng)答細(xì)胞融合，以識(shí)別該應(yīng)答細(xì)胞中大量的封閉基因。也可以使用具有轉(zhuǎn)錄環(huán)境的人造細(xì)胞脂質(zhì)體(或任何其它細(xì)胞融合組件)。該脂質(zhì)體可以包含編碼ー個(gè)或多個(gè)由其固有轉(zhuǎn)錄控制元件和表達(dá)所需反式因子控制的待分析基因的核苷酸鏈。合成的轉(zhuǎn)錄環(huán)境也可用于識(shí)別順式沉默基因。反式互補(bǔ)識(shí)別順式沉默(封閉)基因的方法包括
(a)選擇第一類和第二類細(xì)胞，此處細(xì)胞遺傳上不相近似；
(b)融合第一類和第二類細(xì)胞產(chǎn)生ー個(gè)或多個(gè)的融合細(xì)胞，此處細(xì)胞被不同地標(biāo)記；
(c)對(duì)融合細(xì)胞中表達(dá)的多個(gè)基因進(jìn)行基因表達(dá)分析；并
(d)通過比較融合前后基因的表達(dá)識(shí)別第一類細(xì)胞中的順式沉默(封閉)基因，順式沉默基因是第二類細(xì)胞基因組中融合前后均表達(dá)，但第一類細(xì)胞基因組中融合前后均不表達(dá)的基因。第一類細(xì)胞可被稱為應(yīng)答細(xì)胞，第二類細(xì)胞則稱為重編程細(xì)胞。重編程細(xì)胞可以沒有細(xì)胞核。第一類細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。細(xì)胞可以源自不同的組織或物種。多細(xì)胞類型也在公開的范圍內(nèi)。具體的異種細(xì)胞包括C3H鼠的mS^和BG鼠的mDF。一類細(xì)胞的封閉基因組(occludome)定義為順式沉默基因的集合，順式沉默基因不具有被不相似細(xì)胞的適當(dāng)反式激活因子所激活的能力。在目標(biāo)基因組中，確定與反式機(jī)制相比，順式機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因有關(guān)貢獻(xiàn)的方法，方法包括
(a)在體外融合至少兩類不同的細(xì)胞；
(b)捜索在融合細(xì)胞和未融合細(xì)胞基因組之間表達(dá)不同的目標(biāo)基因，引入并共享融合細(xì)胞的順式封閉基因不能應(yīng)答反式信號(hào)；并
(c)比較順式基因和反式基因。確定與反式機(jī)制相比，順式機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因有關(guān)貢獻(xiàn)的方法，方法包括
(a)在體外融合至少兩類不同的細(xì)胞；
(b)比較來自不同細(xì)胞基因組的目標(biāo)基因在未融合和融合細(xì)胞中的表達(dá)水平，相關(guān)貢獻(xiàn)與目標(biāo)基因?qū)Ρ灰肴诤霞?xì)胞的共享環(huán)境中的反式信號(hào)的相關(guān)響應(yīng)性有關(guān)。識(shí)別封閉基因的方法，包括
(a)融合不同種類的細(xì)胞，其中ー類細(xì)胞作為“應(yīng)答細(xì)胞”，另ー類細(xì)胞作為“重編程細(xì)胞”；
(b)用與重編程細(xì)胞不同的標(biāo)記標(biāo)記應(yīng)答細(xì)胞； (C)通過雙標(biāo)記的存在確定融合細(xì)胞；
(d)檢測(cè)融合細(xì)胞以確定表達(dá)形式；并
(e)識(shí)別在應(yīng)答細(xì)胞基因組中沉默但在重編程細(xì)胞基因組中激活的基因。在一些實(shí)例中，表達(dá)形式可通過微陣列分析或RT-PCR確定。在特定實(shí)例中，表達(dá)形式需通過微陣列分析以及RT-PCR才能確定。物種的實(shí)例包括鼠和人。應(yīng)答細(xì)胞實(shí)例包括人肺成纖維細(xì)胞hLF ；重編程細(xì)胞實(shí)例包括鼠骨骼肌成肌細(xì)胞 mSMM。按照本說明書所描述的方法，以人肺成纖維細(xì)胞為應(yīng)答細(xì)胞和鼠骨骼肌成肌細(xì)胞作為重編程細(xì)胞，通過微陣列分析確定了大約300個(gè)候選基因，在后續(xù)的驗(yàn)證中確認(rèn)52個(gè)基因是封閉的。部分封閉基因在鼠/鼠、人/人和黑猩猩/人細(xì)胞融合體內(nèi)進(jìn)行了測(cè)試，在絕大多數(shù)情況下確認(rèn)了其封閉狀態(tài)，表明該封閉不是鼠人細(xì)胞雜交的人為結(jié)果。后續(xù)的長(zhǎng)期培養(yǎng)和雜交細(xì)胞的核融合表明基因的封閉狀態(tài)是穩(wěn)定的。部分肌肉相關(guān)的封閉基因在mSMM和其它類人體細(xì)胞如HeLa、間質(zhì)干細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞的融合體中是封閉的。此外，一種可選的方法被應(yīng)用于檢測(cè)hLF和鼠肝細(xì)胞單獨(dú)與鼠神經(jīng)瘤系細(xì)胞融合細(xì)胞中的基因封閉。發(fā)現(xiàn)2個(gè)在肝細(xì)胞表達(dá)、在hLF封閉基因在肝融合細(xì)胞中封閉，如同一個(gè)在成神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)、在hLF封閉基因，表明封閉狀態(tài)在響應(yīng)不同潛能重編程細(xì)胞時(shí)通常能夠維持。封閉的分子基礎(chǔ)如DNA甲基化，同樣進(jìn)行了分析。運(yùn)用亞硫酸氫鹽測(cè)序了部分封閉和未封閉基因，以確定與mSMM相比hLF中潛在的甲基化差異。少量的封閉基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近顯示有不同的甲基化。用去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理hLF并未顯著地改變封閉基因的表達(dá)，但細(xì)胞融合后，觀察到很多這種基因有低水平的激活，表明封閉狀態(tài)至少已經(jīng)部分削弱(需要注意的是許多這種基因并未顯示不同的甲基化形式)。在類似的實(shí)驗(yàn)中同樣研究了 HDAC抑制劑TSA的影響，但是發(fā)現(xiàn)影響甚微。檢測(cè)了封閉狀態(tài)的穩(wěn)定性對(duì)生理?xiàng)l件變化(低營養(yǎng)、缺氧等)的響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)與反式激活控制的基因相比，封閉基因是極其穩(wěn)定的。這表明染色質(zhì)標(biāo)記將ー些基因，如封閉基因，與ー個(gè)給定類型細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄環(huán)境相隔離，同時(shí)其它基因?qū)Ψ词阶饔靡蜃用黠@更為開放。關(guān)鍵譜系決定子通常有染色質(zhì)修飾將其屏蔽以免譜系不恰當(dāng)?shù)丶せ睢?br>

圖1，封閉基因的識(shí)別㈧使用RT-PCR分析hLF_SMM融合細(xì)胞的表達(dá)；顯示有四類基因封閉的hLF基因、反式激活的hLF基因、消減的(extinguishecOmSMM基因和封閉的mSMM基因；每ー個(gè)基因都顯示有四個(gè)RT-PCR結(jié)果頂部的兩個(gè)以融合前后mSMM同源直系基因?yàn)槟繕?biāo)，而底部的兩個(gè)以融合前后hLF直系同源基因?yàn)槟繕?biāo)，已知的肌肉相關(guān)基因都在基因名字的上方用“ + ”標(biāo)記；(B)對(duì)基因在hLF、mDF和cDF細(xì)胞中是封閉(用O表示)還是反式激活⑴的總結(jié)；指明了每個(gè)基因中CpG島的存在與否，以及hLF和hSMM之間轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS的是否被不同地甲基化；也指明了每個(gè)基因在人胚胎干細(xì)胞中是否是 Polycomb的結(jié)合位點(diǎn)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞；mDF 鼠真皮成纖維細(xì)胞；cDF 黒猩猩真皮成纖維細(xì)胞；hSMM 人骨骼肌成肌細(xì)胞。圖2，mDF-mSMM融合細(xì)胞的RT-PCR表達(dá)分析和在hLF中封閉或反式激活基因的序列；(A)使用mDF和mSMM通用弓|物進(jìn)行的RT-PCR ；顯示了在mSMM和融合細(xì)胞中但在mDF中沒有的表達(dá)；(B)融合細(xì)胞RT-PCR產(chǎn)物的序列(電泳圖的最后ー排)；mDF的14個(gè)基因中有 11個(gè)是封閉的，因?yàn)槿诤霞?xì)胞中只有mSMM的等位基因表達(dá)；相比之下，Chrnd，Myog和Myl4 是反式激活的，因?yàn)閙DF和mS^的等位基因都表達(dá)；電泳圖的前兩排不是mSMM就是mDF的単獨(dú)序列，顯示這兩類細(xì)胞之間的不同等位基因。電泳圖中的箭頭所指的是mDF和mSMM之間的多態(tài)位置。mDF 鼠真皮成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞；hLF 人肺成纖維細(xì)胞。圖3，各培養(yǎng)條件下封閉基因表達(dá)狀態(tài)的對(duì)照；除了正常培養(yǎng)條件，還使用了 5個(gè)模擬生理改變的條件，包括低營養(yǎng)、低氧、低溫、高溫和干擾素-Y處理；選擇正常條件下沉默的基因作為對(duì)照基因(A) hLF中在各種培養(yǎng)條件下都穩(wěn)定沉默的封閉基因⑶一些在模擬生理改變培養(yǎng)條件下激活的對(duì)照基因；在ー個(gè)或多個(gè)條件下激活的基因用“*”標(biāo)示。圖4，封閉基因Myf5 (A)和反式激活基因Actal (B)的亞硫酸氫鹽法測(cè)序分析；在基因結(jié)構(gòu)的模式圖中，外顯子用實(shí)心的條帶表示，其中寬帶表示編碼區(qū)域而窄帶表示非編碼區(qū)域，標(biāo)示了通過生物信息法識(shí)別的CpG島，在保守圖中，峰的高度反映了跨物種保守的程度；亞硫酸氫鹽測(cè)序中的単獨(dú)擴(kuò)增子及其對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域用括號(hào)標(biāo)示；在每塊亞硫酸氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)內(nèi)，柱對(duì)應(yīng)于CpG位點(diǎn)，行對(duì)應(yīng)于測(cè)序過的克隆，實(shí)心環(huán)代表甲基化的CpG，點(diǎn)代表未甲基化的CpG。圖5，AdC和TSA處理對(duì)hLF中封閉基因的影響RT_PCR分析藥物處理的未融合的 hLF以及藥物處理過的并與mSMM融合的hLF的基因表達(dá)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖6，hLF中16個(gè)染色質(zhì)標(biāo)記的ChIP分析；分析選擇的基因可以分為沉默組和表達(dá)組兩組。而沉默組可以進(jìn)ー步分成封閉組和反式激活組= (A)PCR定量的單個(gè)基因ChIP ；每個(gè)條帶代表PCR擴(kuò)增子研究的區(qū)域；每個(gè)條帶的高度代表基因的富集度 (fold-enrichment)和相對(duì)輸入；P值由這些數(shù)據(jù)根據(jù)t檢驗(yàn)計(jì)算得到，表明兩組基因在研究的染色質(zhì)標(biāo)記上不同具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，誤差帶根據(jù)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到；(B) 16個(gè)染色質(zhì)標(biāo)記的主成分ChIP數(shù)據(jù)分析。NS 無意義；hLF 人肺成纖維細(xì)胞。圖7，基因組調(diào)節(jié)的不同觀點(diǎn)(A)提議的封閉基因組觀點(diǎn)認(rèn)為基因組的組成部分包括封閉部分和可轉(zhuǎn)錄部分；(B)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄基因組觀點(diǎn)認(rèn)為基因組由表達(dá)部分和沉默部分組成；與轉(zhuǎn)錄基因組說相比，封閉組說可以提供在分子上更基礎(chǔ)、在生理上更穩(wěn)定細(xì)胞類型的解釋。圖8，hLF和mSMM之間的融合㈧融合細(xì)胞FACS純化；融合前，分別用紅色和綠色熒光染料標(biāo)記hLF和mSMM ；化學(xué)誘導(dǎo)融合后，根據(jù)雙熒光來純化hLF_mSMM融合細(xì)胞。 左側(cè)是對(duì)照實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞儀圖，為未進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)融合的hLF和mSMM共培養(yǎng)，顯示為兩種不同的細(xì)胞群。右側(cè)是具有第三種，含有融合細(xì)胞的雙熒光細(xì)胞群的融合實(shí)驗(yàn)圖；(B) FACS-純化的細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡檢查；幾乎所有的細(xì)胞都有雙熒光，并且每個(gè)細(xì)胞都含有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核；(B)融合細(xì)胞中hLF與mSMM細(xì)胞核的比率大部分融合細(xì)胞具有同等數(shù)量的hLF和mSMM細(xì)胞核(要么是1 1，要么是2 2)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖9，hLF-mSMM融合細(xì)胞的時(shí)間過程分析；細(xì)胞融合后的第1、2、3、4、8或16日通過RT-PCR分析融合細(xì)胞中人和鼠的基因表達(dá)；hLF基因的封閉狀態(tài)在這些不同時(shí)間點(diǎn)始終保持沉默。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖10，mDF-mSMM融合細(xì)胞的時(shí)間過程分析。融合細(xì)胞中My f 5，Car 2，Cxcr4和Chrnd 的表達(dá)在融合后第2、4或8日，通過對(duì)各自基因RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行了分析；箭頭所指的是mDF和mSMM之間的多態(tài)位點(diǎn)；Myf5，Car2和Cxcr4在mDF細(xì)胞中始終封閉，而Chrnd到第四天明顯被反式激活。mDF 鼠真皮成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖11，通過RT-PCR和測(cè)序得到的cDF_hSMM融合細(xì)胞的表達(dá)分析；hLF的M個(gè)封閉基因和10個(gè)反式激活基因中，分別有12個(gè)和8個(gè)在cDF-hSMM融合細(xì)胞有表達(dá)，它們含有cDF和hSMM間的外顯子替代物，且在兩類細(xì)胞中的差異表達(dá)(A)使用cDF和hSMM通用引物對(duì)20個(gè)表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR，顯示了在hSMM和融合細(xì)胞中有，但是在cDF中沒有的表達(dá)；(B)融合細(xì)胞PT-PCR產(chǎn)物的序列(電泳圖的最后ー排)，表明ー個(gè)基因在cDF中要么是封閉的，因?yàn)槿诤霞?xì)胞中只有hSMM等位基因是表達(dá)的，要么是反式激活的，因?yàn)閏DF和mSMM 的等位基因都是表達(dá)的；電泳圖前兩道要么只是cDF要么只是hSMM，表明這兩類細(xì)胞之間不同的等位基因。電泳圖中的箭頭所指的是cDF和hSMM之間的核苷酸置換點(diǎn)。cDF 黑猩猩真皮成纖維細(xì)胞；hSMM 人骨骼肌成肌細(xì)胞；hLF 人肺成纖維細(xì)胞。圖12，DF-mSMM融合細(xì)胞有DNA合成和細(xì)胞核融合的證據(jù)。㈧融合和FACS純化 4天后，細(xì)胞核直徑増大(大約40%)的單核細(xì)胞；這ー階段絕單核細(xì)胞占細(xì)胞的絕大多數(shù)；(B)隨著時(shí)間增長(zhǎng)，BrdU標(biāo)記細(xì)胞的增加表明有DNA合成；(C)融合后四天BrdU結(jié)合的免疫熒光染色；(D)融合后四天mDF和mSMM兩個(gè)基因組在單核細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞核的存在； 在融合之前，分別用CldU和IdU標(biāo)記mDF和mSMM基因組，通過免疫熒光染色在融合細(xì)胞中可見。mDF 鼠真皮成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞；A和B中的誤差帶代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。圖13，在不同類型細(xì)胞封閉基因的中識(shí)別；三種非肌細(xì)胞，hMSC、hKe和Hela分別與mSMM融合，其結(jié)果分別如A、B、C所示；hLF-mSMM融合細(xì)胞中識(shí)別的M個(gè)hLF封閉基因在這些融合實(shí)驗(yàn)中同樣進(jìn)行了檢測(cè)；已知的與肌肉相關(guān)的基因在基因名字的上方用“ + ”標(biāo)示。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；hMSC 人間質(zhì)干細(xì)胞；hKe 人成角質(zhì)細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖 14，封閉的 hLF 基因 Myodl (A)、Cacngl (B)、Rapsn (C)和 iTnniZ(D)以及反式激活的111^基因1^呢伍、0011爾)、11111^1(6)和I1nncI (H)的亞硫酸氫鹽測(cè)序分析。在hLF和 hSMM之間進(jìn)行了比較；本圖沿用圖4的標(biāo)記約定。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。圖15，hLF中18個(gè)封閉基因和5個(gè)反式激活基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的亞硫酸氫鹽測(cè)序分析；在hLF和hSMM之間進(jìn)行了比較；Ncaml的TSS被2個(gè)擴(kuò)增子覆蓋；Cxcr4和 Myl4分別有兩個(gè)不同的TSS(用a和b表示)，分別地進(jìn)行分析；用“*”標(biāo)示的基因在hSMM 中不表達(dá)，所以這些基因在hSMM中是封閉的還是能動(dòng)的是未知的；所有其它基因在hSMM細(xì)胞有表達(dá)(因此是能動(dòng)的)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。
圖16，在hLF-mOst融合細(xì)胞中識(shí)別的hLF封閉基因；每ー個(gè)基因?qū)?yīng)有4個(gè) RT-PCR結(jié)果頂部的兩個(gè)以融合前后mOst中鼠的直系同源基因?yàn)槟繕?biāo)，而底部的兩個(gè)以融合前后hLF中人的直系同源基因目標(biāo)；在hLF-mSMM融合細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的同樣封閉基因中也標(biāo)示了 ；發(fā)現(xiàn)為人胚胎干細(xì)胞Polycomb結(jié)合位點(diǎn)的基因用“ Pc”標(biāo)示。hLF 人肺成纖維細(xì)胞； mOst 鼠成骨細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。 圖17，hLF-mHe (A)和hLF_mNeu⑶融合細(xì)胞的RT-PCR表達(dá)分析；每個(gè)基因?qū)?yīng)有四個(gè)RT-PCR結(jié)果頂部的兩個(gè)以融合前后鼠mHe㈧直系同源基因或mNeu (B)的直系同源基為目標(biāo)，而底部的兩個(gè)以融合前后人hLF的同源基因?yàn)槟繕?biāo)。hLF:人肺成纖維細(xì)胞；mHe: 鼠肝細(xì)胞；mNeu 鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤。圖18，應(yīng)答細(xì)胞與不同的重編程細(xì)胞融合時(shí)封閉狀態(tài)的穩(wěn)定性；在hLF-mSMM融合細(xì)胞中識(shí)別的hLF的M個(gè)封閉基因中，Spock2和Mnda在mHe中同樣表達(dá)，而Gnaol在 mNeu中同樣表達(dá)，提供了檢測(cè)與不同重編程細(xì)胞融合后這些基因在hLF細(xì)胞中是否封閉的條件(A) hLF-mHe融合時(shí)，hLF的Spock2和Mnda同樣是封閉；(B)hLF-mNeu融合時(shí)，hLF中的Gnaol也是封閉的；其它基因不能確定，因?yàn)樗鼈兗炔辉趍He也不在mNeu中表達(dá)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。mHe 鼠肝細(xì)胞；mNeu 鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤。圖19，應(yīng)答細(xì)胞與不同重編程細(xì)胞融合時(shí)其反式激活基因的穩(wěn)定性；在hLF-mSMM 融合細(xì)胞中識(shí)別的10個(gè)hLF反式激活基因中，Mfap5在mOst同樣表達(dá)，而Actal，Myl4和 Trmil在mHe中表達(dá)。提供了檢測(cè)當(dāng)與不同重編程細(xì)胞融合后這些基因在hLF是否也是反式激活的；(A)hLF-mHe融合吋，hLF中的Mfap5也是反式激活的；(B)hLF-mHe融合吋，hLF 中的Actal，Myl4和Trmil也是反式激活的；其它基因不能確定，因?yàn)樗鼈兗炔辉趍Ost也不在mHe中表達(dá)。hLF 人肺成纖維細(xì)胞；mSMM 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞；mOst 鼠成骨細(xì)胞；mHe 鼠肝細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式—個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄輸出是兩個(gè)輸入共同作用的產(chǎn)物細(xì)胞環(huán)境中的擴(kuò)散性因子反式作用，而染色質(zhì)狀態(tài)順式作用。確定與反式機(jī)制相比，順式機(jī)制對(duì)基因調(diào)節(jié)的相對(duì)貢獻(xiàn)稱為反式互補(bǔ)。這通過融合至少兩類不同的細(xì)胞并在融合細(xì)胞中捜索兩個(gè)基因組之間基因的差異表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)。任何差異表達(dá)都可以歸結(jié)于順式機(jī)制因?yàn)槿诤霞?xì)胞中的兩個(gè)基因組共享単一的反式作用環(huán)境?；蜣D(zhuǎn)錄能力被遮蔽的狀態(tài)稱為“封閉態(tài)”，通過阻斷基因?qū)?xì)胞中反式作用的應(yīng)答，受影響的基因由于順式作用機(jī)制而沉默。封閉基因在多種細(xì)胞中得到了確認(rèn)。在一種給定細(xì)胞類型的封閉基因傾向于含有細(xì)胞特征選擇的主觸發(fā)器。這些主觸發(fā)器是驅(qū)動(dòng)譜系特異程序激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，其封閉可以保持細(xì)胞的類型特征。而且，基因的封閉狀態(tài)在細(xì)胞分裂過程是穩(wěn)定的，在寬范的生理?xiàng)l件下也都極其穩(wěn)定。染色質(zhì)分析表明部分基因的封閉可能與DNA甲基化有關(guān)，并且封閉基因富含HPl-α結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)論ー 起支持了譜系不恰當(dāng)基因的封閉是細(xì)胞類型限制的關(guān)鍵機(jī)制的這ー觀點(diǎn)。通過在此公開的方法對(duì)封閉基因系統(tǒng)的描述，提供了新的細(xì)胞類型分子水平的的定義，并且提供了ー個(gè)全新的識(shí)別基因組中染色質(zhì)狀態(tài)功能的方法。細(xì)胞融合在過去已被用于基因調(diào)節(jié)的研究，通常集中于融合細(xì)胞內(nèi)組織特異性基因的反式激活和消減，顯示反式作用轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子的存在。細(xì)胞融合的ー個(gè)重要用處是應(yīng)用于反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。通過融合不同類型細(xì)胞并搜索融合細(xì)胞中兩個(gè)基因組之間差異表達(dá)的基因，這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以將順式作用機(jī)制和反式作用環(huán)境對(duì)基因沉默效應(yīng)的貢獻(xiàn)區(qū)分開。對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言，基于本發(fā)明方法，任何用于差異表達(dá)分析的合適方法都可被采用，這些方法包括但不限于微陣列分析，實(shí)時(shí)PCR，Northern分析和由半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得的cDNA的序列。物種特異性微陣列分析的使用，對(duì)來自不同種類的細(xì)胞融合后差異表達(dá)的基因的全局分析是極其有用的。利用這個(gè)實(shí)驗(yàn)，識(shí)別了ー類以封閉狀態(tài)存在的基因，封閉狀態(tài)定義為即使存在有利于轉(zhuǎn)錄的微環(huán)境，這個(gè)基因仍保持沉默的一種轉(zhuǎn)錄能力狀態(tài)?；虻姆忾]狀態(tài)可在細(xì)胞分裂期間維持并且在寬范的生理?xiàng)l件下高度穩(wěn)定。單等位基因沉默如X染色體失活和遺傳印記明顯符合封閉態(tài)的定義。雙等位封閉也是普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，影響不同類型細(xì)胞中的許多基因。實(shí)際上，單等位沉默可以認(rèn)為是基因封閉的ー個(gè)特例，單等位沉默是從原始的雙等位封閉狀態(tài)進(jìn)化而來似乎是可信的。通過可以穩(wěn)定地關(guān)閉譜系不恰當(dāng)基因否則會(huì)激活，雙等位封閉可能是確定和維持細(xì)胞表型特征的關(guān)鍵因素?；蚪M調(diào)節(jié)的“封閉組”觀點(diǎn)認(rèn)為ー類細(xì)胞的基因組包括兩部分，一部分是所有的封閉基因，另一部分是所有的能動(dòng)(活躍表達(dá)的)基因(圖7A)。在ー類細(xì)胞中活躍表達(dá)的基因具有全部活性，但沉默基因要么是能動(dòng)的要么是封閉的。這種觀點(diǎn)與目前基因組的 “轉(zhuǎn)錄基因組”認(rèn)為基因要么是表達(dá)的要么是沉默的觀點(diǎn)是不同的概念框架(將圖7A與7B 比較)。為了系統(tǒng)地描繪ー類細(xì)胞中的所有封閉基因，可將這類細(xì)胞與其它多種類型的細(xì)胞融合共同表達(dá)其整個(gè)基因組。與相當(dāng)易變的轉(zhuǎn)錄基因組相比，這樣ー個(gè)封閉組圖提供的細(xì)胞類型的定義生理上更一致，且可能分子水平上更基礎(chǔ)。通過比較不同譜系的細(xì)胞、具有相同基因組的干細(xì)胞和特化細(xì)胞、新細(xì)胞和老細(xì)胞、正常和病理細(xì)胞(如癌細(xì)胞)、以及不同物種的細(xì)胞之間的封閉組圖，可以更廣泛地深入理解發(fā)育、老化、疾病過程、進(jìn)化機(jī)制的基礎(chǔ)。而且，對(duì)于ー個(gè)給定類型的細(xì)胞，還比較了其封閉圖譜和全基因組圖的染色質(zhì)標(biāo)記， 如DNA甲基化和組蛋白修飾。這樣的比較可反映封閉狀態(tài)的生化基礎(chǔ)，更重要的是，提供了一個(gè)全新的識(shí)別遺傳密碼上復(fù)雜的染色質(zhì)編碼重疊的功能的方法。這里描述了基因封閉開/關(guān)的ニ元觀點(diǎn)。然而，封閉有時(shí)可以導(dǎo)致部分基因的部分沉默也是合理的，在這種情況下ー個(gè)基因在融合細(xì)胞中的兩個(gè)基因組之間可能顯示出表達(dá)量的不同而非量有/無的不同。只要基因在融合細(xì)胞的基因組之間顯示有不同的表達(dá) (假設(shè)混雜因素如種間不相容排除在外)，反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)就可用來掲示完全封閉和部分封閉?；虻姆忾]狀態(tài)定義要求ー個(gè)基因即使在存在有利于轉(zhuǎn)錄的環(huán)境中仍保持沉默 (或幾乎沉默)。然而，這種定義僅與特定的環(huán)境有關(guān)。ー個(gè)基因在一個(gè)環(huán)境中可能是封閉的但是在另ー個(gè)環(huán)境中是激活的。這是有可能發(fā)生的，如果第一個(gè)環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄因子被存在于基因的某些順式調(diào)節(jié)序列中的抑制性染色質(zhì)標(biāo)記所屏蔽，但是第二個(gè)環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄因子，與第一個(gè)中的不同，可以通過識(shí)別基因上另ー組未受抑制性染色質(zhì)影響的不同順式調(diào)節(jié)序列來驅(qū)動(dòng)表達(dá)?；蛘?，第二個(gè)環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄因子不同于第一個(gè)于環(huán)境中的，即便存在抑制性染色質(zhì)也可以識(shí)別其目標(biāo)序列。環(huán)境具有“去封閉”基因的能力-例如，消除與封閉狀態(tài)有關(guān)的染色質(zhì)標(biāo)記。這樣的消除可以影響單個(gè)基因或整個(gè)基因組，可以是ー個(gè)主動(dòng)的過程或是被動(dòng)的過程。體細(xì)胞通過核移植進(jìn)入卵細(xì)胞或與胚胎干細(xì)胞ESC、胚胎生殖細(xì)胞ESG融合而重編程，證明了這些類型的細(xì)胞具有消除體細(xì)胞在發(fā)育過程中建立的絕大部分，如果不是所有的染色質(zhì)標(biāo)記的能力。這樣的能力可以僅來源于少量的基因，這些基因的異常表達(dá)可以使成纖維細(xì)胞重編程形成多潛能的，類似ESC的細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞iPS。囊胚期 (ESC分裂期)過后不久，細(xì)胞就失去了去封閉基因組的能力，這可能是通過封閉在第一個(gè)時(shí)期內(nèi)與全基因去封閉有關(guān)的相同基因而達(dá)到。，細(xì)胞在隨后的發(fā)育階段中逐步分化，伴隨著不可逆或幾乎不可逆的，基因數(shù)量不斷増加的封閉，不同譜系中的不同組基因就逐步封閉了。譜系不恰當(dāng)基因的封閉可以保證多細(xì)胞有機(jī)體中各種類型細(xì)胞表型的穩(wěn)定性，抵抗細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)兩者的變化。而且，不同細(xì)胞類型的特征由不同的封閉組決定，也可以解釋為什么相同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在不同的細(xì)胞類型中常常引起不同組基因的激活這一多細(xì)胞生物發(fā)育過程中常見的現(xiàn)象。相同轉(zhuǎn)錄因子在不同類型細(xì)胞中發(fā)揮不同作用的能力使得多細(xì)胞生物在不增加基因組大小/復(fù)雜程度的情況下提高細(xì)胞類型的復(fù)雜程度。因此，將部分基因封閉的進(jìn)化可能是多細(xì)胞體進(jìn)化的先決條件。封閉狀態(tài)應(yīng)該是相當(dāng)穩(wěn)定的以賦予和維持生物體整體中細(xì)胞的特征，(生殖細(xì)胞是ー個(gè)例外，在生殖細(xì)胞中，對(duì)大部分基因而言封閉狀態(tài)要么尚未完全確定，要么在配子發(fā)育過程中被消除)。對(duì)于有些基因，正常條件下，體細(xì)胞中的封閉狀態(tài)基本上是不可逆的 (如X-失活和遺傳印記狀態(tài)下)。然而，通過刻意機(jī)制，有些類型的體細(xì)胞中的封閉基因可以去封閉，這對(duì)組織再生過程中細(xì)胞的去分化和轉(zhuǎn)分化有貢獻(xiàn)，尤其是在那些受傷后能再生整個(gè)部位的物種中。罕見情況下，基因的能動(dòng)/封閉狀態(tài)可以以ー種隨機(jī)的、不受調(diào)節(jié)的方式改變，這可能影響衰老和疾病如癌癥的進(jìn)展。因此利用反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)識(shí)別和表征封閉基因在健康和疾病的研究中有著廣泛的應(yīng)用。通過種間細(xì)胞融合識(shí)別封閉基因
為了識(shí)別特定細(xì)胞類型中的封閉基因，采取種間細(xì)胞融合的策略。待融合細(xì)胞類型中的ー種叫做“應(yīng)答細(xì)胞”，另ー種叫“重編程細(xì)胞”。目的是識(shí)別應(yīng)答細(xì)胞中的封閉基因，因?yàn)榉忾]基因在融合細(xì)胞中的應(yīng)答基因組中沉默，但在重編程基因組中激活(表1)得以確認(rèn)。 人肺成纖維細(xì)胞(在此縮寫為hLF)被用做應(yīng)答細(xì)胞，鼠骨骼肌成肌細(xì)胞mSMM作為重編程細(xì)胞。通過使用不同種類的，直系同源基因之間有序列差異的細(xì)胞可區(qū)分融合細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是重編程細(xì)胞還是應(yīng)答細(xì)胞基因組產(chǎn)生的。在一實(shí)施例中，用不同的熒光染料標(biāo)記兩個(gè)細(xì)胞群，使用聚乙ニ醇融合。占總細(xì)胞中很少一部分的雙熒光細(xì)胞通過熒光激活細(xì)胞分選法FACS被分離出來(圖8A)。顯微觀察確認(rèn)FACS分離的細(xì)胞主要(> 98% )是hLF和mSMM的融合細(xì)胞，因?yàn)檫@些融合細(xì)胞包含兩種不同形態(tài)的多倍細(xì)胞核(與mSMM相比，hLF細(xì)胞核更大且DAPI染色更弱)，(圖8B)。 對(duì)于細(xì)化實(shí)驗(yàn)，異型融合細(xì)胞(如hLF和mSMM之間的融合)可以通過使用抗生素清除未融合細(xì)胞或同型融合的細(xì)胞進(jìn)ー步富集(見材料和方法)。融合細(xì)胞中，超過70%的融合細(xì)胞具有等個(gè)數(shù)的hLF和mSMM細(xì)胞核，其中絕大部分含有ー個(gè)hLF細(xì)胞核和ー個(gè)mSMM細(xì)胞核， 而剩下的含有兩個(gè)hLF細(xì)胞核和兩個(gè)mSMM細(xì)胞核。少于30%的融合細(xì)胞顯示不等個(gè)數(shù)的hLF和mSMM細(xì)胞核，其中絕大部分含有過較多的mSMM細(xì)胞核(圖8C)。細(xì)胞培養(yǎng)不同的周期以便在新環(huán)境中的基因重新表達(dá)。不管培養(yǎng)周期和培養(yǎng)基配方如何改變，融合細(xì)胞保持為多核的異核細(xì)胞，表明它們?cè)谌诤现笫チ朔至训哪芰?。基因表達(dá)形式在融合后3天內(nèi)逐漸穩(wěn)定，融合后第四天是分析基因表達(dá)的時(shí)期。為了探究融合前后hLF和mSMM中的基因表達(dá)，人和鼠的Affymetrix微陣列被使用。盡管人和鼠基因組之間的序列有顯著差異(編碼區(qū)平均為16%)，但是融合細(xì)胞中人的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物仍然可以與鼠微陣列上的直系同源基因探針雜交，反之亦然，給定的微陣列不是為物屬特異性雜交而設(shè)計(jì)。為了檢測(cè)跨物種雜交是否存在問題，將來源于每類細(xì)胞的cRNA 與人和鼠微陣列進(jìn)行了雜交。當(dāng)來自正確物種的cRNA與微陣列雜交時(shí)，大約有45%的基因響應(yīng)為“存在”。做為對(duì)照，cRNA來自錯(cuò)誤物種時(shí)只導(dǎo)致大約10%的基因響應(yīng)為“存在”。 這表明在研究融合細(xì)胞中相當(dāng)一部分基因的表達(dá)時(shí)，微陣列仍有著充分的物種特異性。獲得了 4組陣列數(shù)據(jù)人陣列上的hLF、鼠陣列上的mSMM、人陣列上的融合細(xì)胞和鼠陣列上的融合細(xì)胞。為了確保這些分析的可靠性，選擇了一組經(jīng)陣列數(shù)據(jù)顯示的在融合之前在mSMM中激活但在hLF中沉默的基因。在融合細(xì)胞中，如果這些基因在mSMM基因組中保持活躍而在hLF基因組中保持沉默，那么這些基因?qū)⒘械絟LF封閉基因的候選清單中。通過這個(gè)分析獲得了ー個(gè)包含279個(gè)推定為封閉的hLF封閉基因候選清單，然后對(duì)清單上所有的候選基因進(jìn)行RT-PCR確認(rèn)。對(duì)于每ー個(gè)基因，都設(shè)計(jì)了鼠特異的和人特異的RT-PCR引物，并確定了這些引物可以獨(dú)立地用來研究融合細(xì)胞中鼠和人基因的表達(dá)。與先前的Affymetrix微陣列研相一致，RT-PCR分析顯示，在陣列數(shù)據(jù)中缺失響應(yīng)比存在響應(yīng)的可靠性低得多。因此，通過RT-PCR分析，大量來自陣列數(shù)據(jù)獲得的候選hLF封閉基因在融合前后的hLF中都具有可觀水平的表達(dá)。排除了這些和其它假象，通過RT-PCR確定了 M 個(gè)基因建立了與其在hLF中的封閉狀態(tài)相一致的表達(dá)形式(圖IA和表2)。在這些基因中， 有9個(gè)已知有肌肉相關(guān)功能(在圖IA中標(biāo)示)。用人特異性引物對(duì)融合細(xì)胞的基因組DNA 進(jìn)行PCR，成功擴(kuò)增出這些hLF基因的拷貝，表明融合細(xì)胞中它們表達(dá)缺失不是由hLF染色體的缺失引起的。事實(shí)上，在有絲分裂停止的異核細(xì)胞中是不大可能發(fā)生染色體丟失。應(yīng)用表1的標(biāo)準(zhǔn)，獲得了 1040個(gè)推定為反式激活的hLF基因候選清単。選擇其中 202個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR確認(rèn)。許多基因不能通過確認(rèn)是因?yàn)镽T-PCR檢測(cè)到在融合前后的 hLF細(xì)胞中都有可觀水平的表達(dá)，對(duì)于其中的許多基因，RT-PCR沒有顯示融合后表達(dá)增加了，但是按照本文件公開的反式激活的嚴(yán)格定義，不能被認(rèn)為是反式激活基因。這導(dǎo)致識(shí)別的10個(gè)反式激活的hLF基因，其中7個(gè)已知有肌肉相關(guān)功能(圖IA和表2)。這些基因中的3個(gè)(Ckm，Actal和Myll)，其反式激活與之前的報(bào)告相一致。對(duì)于在融合的細(xì)胞中hLF 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)增明顯少于mSMM轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式激活基因(如Myog，Actal和Raplgal)，額外的引物也證實(shí)了擴(kuò)增的不同，反映了人和鼠直系同源基因之間實(shí)際的基因表達(dá)的不同， 而不是PCR效率的不同?？傮w而言，融合細(xì)胞中觀察到的人和鼠之間基因表達(dá)的差異可以歸因于至少三個(gè)可能第一，基因可以部分封閉，這樣它們激活作為對(duì)有利于轉(zhuǎn)錄的環(huán)境的響應(yīng)，但這不是最大的可能。第二，hLF細(xì)胞群基因可能是異質(zhì)的，被研究的基因在部分細(xì)胞但不是所有細(xì)胞封閉。第三種可能是mSMM基因組產(chǎn)生的鼠轉(zhuǎn)錄因子和hLF基因組中的人順式調(diào)節(jié)序列不相客，導(dǎo)致這些基因僅部分激活。盡管封閉和反式激活基因在融合前的hLF細(xì)胞中都是沉默的，但它們顯然是以兩種不同的轉(zhuǎn)錄能力的狀態(tài)存在。封閉基因即使在有利于轉(zhuǎn)錄的環(huán)境中也不會(huì)變活躍。與之相反，反式激活基因以能動(dòng)的狀態(tài)(盡管是非激活的)存在，可以應(yīng)答環(huán)境中引入的反式作用因子。特別的RT-PCR分析還發(fā)現(xiàn)4個(gè)消減的mSMM基因和6個(gè)封閉的mSMM基因(圖 1A)。消減可以歸結(jié)于轉(zhuǎn)錄抑制因子的引入，或因?yàn)榧?xì)胞融合導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄激活因子的稀釋或消失。對(duì)于消減的mSMM基因，不能確定其在hLF細(xì)胞中的直系同源基因是否是封閉的。封閉的mSMM基因的存在表明給定的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)可用來識(shí)別融合雙方中的封閉基因。hLF封閉基因的識(shí)別以ー種系統(tǒng)且無偏見的方式進(jìn)行，也就是說所有通過陣列數(shù)據(jù)獲得的候選封閉基因都要進(jìn)行RT-PCR確認(rèn)。最后得出的MfhLF基因很可能代表了 hLF-mSMM反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中所有hLF封閉基因的很小一部分。相比之下，反式激活的hLF基因、消減的mSMM基因和封閉的mSMM基因的發(fā)現(xiàn)方法就沒那么系統(tǒng)了。肌原譜系的特化由四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Myodl，Myf5, Myog和Myf6控制。這些主肌化觸發(fā)器中，Myodl和Myf5在hLF細(xì)胞中是封閉的，Myog在hLF細(xì)胞中是反式激活的(因此是能動(dòng)的)，而Myf6在mSMM細(xì)胞中是消減的(因此在hLF細(xì)胞中要么是封閉的，要么是能動(dòng)的)。已知Myodl和Myf5是位于Myog和Myf6上游的驅(qū)動(dòng)肌源程序，而且它們還參與正向自身調(diào)節(jié)和正向交叉調(diào)節(jié)。在這樣ー個(gè)調(diào)節(jié)回路中，假設(shè)在非肌細(xì)胞中Myodl和Myf5沒有遭到封閉，那么由于細(xì)胞變化引起的這些基因的任何低水平的表達(dá)都可能通過反饋回路放大，反過來引起錯(cuò)誤的肌肉表型出現(xiàn)在非肌肉細(xì)胞中。所以Myodl和Myf 5在hLF細(xì)胞(和其它在本文件中展示的非肌肉類細(xì)胞)中封閉的事實(shí)支持了關(guān)鍵的譜系不恰當(dāng)基因的封閉可以保持細(xì)胞的類型特征以對(duì)抗異常轉(zhuǎn)分化這ー模型。長(zhǎng)期培養(yǎng)融合細(xì)胞中封閉基因的穩(wěn)定性
為了研究融合細(xì)胞中基因表達(dá)重啟是如何被培養(yǎng)時(shí)間影響的，細(xì)胞融合后培養(yǎng)1、2、3、 4、8或16天，然后用RT-PCR檢測(cè)列在圖IA中的基因的表達(dá)。結(jié)果顯示基因表達(dá)的重啟大部分發(fā)生在融合的前3天內(nèi)，隨后表達(dá)形式逐漸穩(wěn)定。不管融合后細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間有多長(zhǎng)， 封閉基因始終保持沉默(圖9)，表明了融合細(xì)胞中封閉基因的時(shí)間穩(wěn)定性。通過與其它類型細(xì)胞的融合進(jìn)ー步證實(shí)了這種時(shí)間穩(wěn)定性。觀察到基因封閉的不是由于種間不相容
盡管大量使用人的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)鼠報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)已經(jīng)顯示了人轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源鼠轉(zhuǎn)基因之間具有保守的表達(dá)形式，但是ー些看似是某些hLF基因的封閉現(xiàn)象實(shí)際上可能是種間不相容的結(jié)果-如mSMM基因組產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別hLF基因組中相應(yīng)的順式調(diào)節(jié)序列的失敗。為了確認(rèn)這種可能性，將兩種不同品系的鼠源的細(xì)胞類型融合，其中 ー種是C3H品系的mSMM，另ー種是B6品系的鼠真皮成纖維細(xì)胞mDF。探索B6和C3H鼠品系之間的序列多態(tài)性來確定融合細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的來源。在M個(gè)封閉和10個(gè)反式激活的hLF基因中，分別有11和3個(gè)基因在mDF_mSMM 融合中有表達(dá)，這就是說基于測(cè)序數(shù)據(jù)分析，這些基因在兩個(gè)品系之間具有外顯子多態(tài)性， 同時(shí)RT-PCR數(shù)據(jù)分析表明他們?cè)趍SMM中但不在mDF中表達(dá)。對(duì)于這些基因中的每ー個(gè)， RT-PCR引物的設(shè)計(jì)用于顯示品系間多態(tài)性位點(diǎn)的面。在mdDF-mSMM融合細(xì)胞中，mDF(B6品系)對(duì)mSMM(C3H品系)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相對(duì)豐度通過對(duì)RT-PCR產(chǎn)物的測(cè)序來評(píng)價(jià)。分析結(jié)果顯示，在hLF封閉的11個(gè)在融合細(xì)胞中有表達(dá)的基因中，除了一個(gè)，其他的在mDF中也封閉，這ー結(jié)論基于融合細(xì)胞中mSMM等位基因的獨(dú)有表達(dá)，獨(dú)有表達(dá)的基因包括主肌化觸發(fā)器Myodl和Myf5 (圖2 ；數(shù)據(jù)也總結(jié)在FIG. IB中)。唯一的例外是Chrnd，mSMM和mDF中的這一等位基因的水平表達(dá)大致相等，表明反式激活了。在hLF反式激活的3個(gè)在融合細(xì)胞中有表達(dá)的基因中，2個(gè)被發(fā)現(xiàn)在mDF中也是反式激活的，1個(gè)是封閉的(圖2 ；同樣總結(jié)在圖1B)。與以上描述的hDF-mSMM融合類似，發(fā)現(xiàn)在mDF封閉基因，在mDF-mSMM融合實(shí)驗(yàn)的融合細(xì)胞中保持封閉并不受培養(yǎng)時(shí)間影響(圖10)。因此，有表達(dá)的基因中，在hLF中封閉的在mDF幾乎全部封閉，并且在hLF中反式激活的在mDF中絕大部分也是反式激活的。這些結(jié)果強(qiáng)力地證明了種間不相容在識(shí)別hLF-mSMM融合細(xì)胞的封閉基因時(shí)所起的作用微不足道，盡管不相容可能影響了少量的基因。Chrnd在hLF表現(xiàn)為封閉但在mDF中反式激活的事實(shí)，表明在hLF-mSMM融合中，在hLF細(xì)胞中觀察到的這一基因的封閉狀態(tài)可能是種間不相容的結(jié)果。封閉狀態(tài)的跨物種保守性
hLF和mDF之間的比較表明給定類型細(xì)胞-此處為成纖維細(xì)胞-中的一組處于封閉狀態(tài)的基因在不同的物種之間是保守的。為了進(jìn)一歩研究這ー保守性，將黑猩猩真皮成纖維細(xì)胞cDF與人骨骼肌成肌細(xì)胞hSMM融合以檢測(cè)在hLF中封閉基因是否在cDF中也封閉。 人-黒猩猩基因組的差異大約是人和鼠基因組差異的1/30，事實(shí)上比許多物種的種內(nèi)多態(tài)性水平低。因此種間不相容在此可以忽略。24個(gè)封閉和10個(gè)反式激活的hLF基因中，分別有12和8個(gè)在cDF_hSMM融合中是有表達(dá)。對(duì)于這些基因，使用兩個(gè)物種通用但顯示人-黒猩猩核苷酸取代面的引物進(jìn)行 RT-PCR0 RT-PCR產(chǎn)物的測(cè)序表明，12個(gè)有表達(dá)的基因在hLF中封閉，在cDF中同樣封閉(圖 11 ；總結(jié)在圖IB中)。封閉的cDF基因包括Chrnd在mDF中反式激活，表明在hLF中這ー 基因的封閉狀態(tài)是真實(shí)的。8個(gè)在hLF有表達(dá)的反式激活基因中，在cDF中6個(gè)反式激活， 另外2個(gè)封閉(圖11，總結(jié)在圖IB中)。因此，hLF中基因的封閉或反式激活狀態(tài)與mDF和cDF大體上一致，這表明在ー個(gè)給定類型的細(xì)胞中處于封閉狀態(tài)的一組基因在物種之間是高度保守的。這種保守性說明譜系不恰當(dāng)基因的封閉是ー個(gè)具有重要生物學(xué)功能、被高度調(diào)節(jié)的過程。合成和細(xì)胞核融合對(duì)封閉狀態(tài)的影響
在mDF-mSMM融合實(shí)驗(yàn)中，盡管大部分細(xì)胞是異核細(xì)胞，但是融合和FACS純化后，培養(yǎng)幾天后，很快大部分細(xì)胞都變成了單核細(xì)胞。而且，這些單核細(xì)胞的平均細(xì)胞核直徑比単獨(dú)的mDF或mSMM細(xì)胞的大約40% (圖12)。這可以歸結(jié)為一個(gè)給定融合細(xì)胞中的多個(gè)細(xì)胞核形成單個(gè)細(xì)胞核(例如，核融合)。異核細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞核可以融合最可能的方式是細(xì)胞有絲分裂核膜崩解并重建。因此實(shí)現(xiàn)這ー過程，mDF-mSMM融合的細(xì)胞必須具有合成DNA和有絲分裂的能力。通過監(jiān)測(cè)胸腺嘧啶類似物5-溴-2’ -脫氧尿苷BrdU的摻入，發(fā)現(xiàn)大部分融合的mDF-mSMM細(xì)胞在融合的幾天之后重新開始DNA合成(圖12)。為了進(jìn)ー步確認(rèn)在單核化細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞核中確實(shí)含有mDF和mSMM兩者的基因組，mDF和mSMM的DNA在融合前，分別用胸腺嘧啶類似物5-氯-2’ -脫氧尿苷(CldU)和5-碘-2’ -脫氧尿苷(IdU)標(biāo)記。融合并FACS純化后的第四天，對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行CldU和IdU免疫共染色。發(fā)現(xiàn)在大部分單核化細(xì)胞中，細(xì)胞核都顯示出CldU和IdU雙陽性，與mDF和mSMM細(xì)胞核融合相符(圖 12)。
有絲分裂中染色體丟失的可能性増加了在融合細(xì)胞中識(shí)別封閉基因的復(fù)雜性。如果ー些染色體被選擇性地丟失，在融合的細(xì)胞中其量不足，使其攜帯的基因可能表現(xiàn)為封閉。對(duì)融合細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增位點(diǎn)包括使用RT-PCR研究過的相同多態(tài)性位點(diǎn)。物理散布在整個(gè)基因組的被研究基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，兩組等位基因存在的水平相當(dāng)。等位特異表達(dá)如圖2所示，不是染色體丟失所引起的。這些數(shù)據(jù)也說明在 mDF-mSMM融合細(xì)胞中觀察到的DNA合成應(yīng)該是mDF和mSMM兩個(gè)基因組復(fù)制造成的，因?yàn)槿绻麅蓚€(gè)基因組中只有ー個(gè)進(jìn)行了復(fù)制，復(fù)制基因組中等位基因的PCR產(chǎn)物相應(yīng)的應(yīng)該比未復(fù)制基因組的等位基因多，而事實(shí)不是。mDF-mSMM融合中的細(xì)胞可以進(jìn)行分裂，然而在其它融合實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞大部分以有絲分裂停止的異核細(xì)胞存在。盡管如此，即便異核細(xì)胞進(jìn)行了分裂，封閉基因仍保持封閉的事實(shí)說明基因的封閉狀態(tài)對(duì)DNA復(fù)制、細(xì)胞核融合和細(xì)胞周期狀態(tài)的改變穩(wěn)定。肌細(xì)胞相關(guān)的基因在不同非肌類細(xì)胞中的封閉
如果肌肉相關(guān)的基因，特別是Myodl和Myf5，確實(shí)有著保護(hù)hLF對(duì)抗肌化程序意外激活的作用，那么類似的肌肉相關(guān)的成組基因在其它非肌細(xì)胞譜系類型的細(xì)胞中應(yīng)該是封閉的。為了檢測(cè)這種可能性，將mSMM與不同譜系的非肌肉類細(xì)胞進(jìn)行融合，然后用RT-PCR檢測(cè)M個(gè)在hLF中封閉基因在這些類型細(xì)胞中是否同樣封閉。所用的非肌肉細(xì)胞包括人間質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)、人角質(zhì)化細(xì)胞(hKe)和人子宮頸癌細(xì)胞系Hela。這些細(xì)胞類型廣泛代表了干細(xì)胞和特化細(xì)胞、正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞和起源于不同胚層的細(xì)胞。9個(gè)已知與肌肉相關(guān)的基因在hLF中封閉，大多數(shù)在其他非肌肉類細(xì)胞中也封閉， 包括主肌化觸發(fā)器Myodl和Myf5 (FIG. 13)。剩下的15個(gè)已知與肌肉無關(guān)的hLF封閉基因中，大部分在至少ー種被研究的非肌肉類細(xì)胞中，要么融合前有表達(dá)要么融合后被反式激活。這些結(jié)果支持了譜系不恰當(dāng)基因，特別是譜系選擇的關(guān)鍵主觸發(fā)器的關(guān)閉，有助于保護(hù)細(xì)胞的類型特征的模型。封閉狀態(tài)在不同生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性
如果封閉狀態(tài)在保持細(xì)胞類型特征中確實(shí)至關(guān)重要，那么這一狀態(tài)在不同生理?xiàng)l件下應(yīng)該保持穩(wěn)定。為了研究封閉狀態(tài)在不同生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，將hLF在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)模擬各種生理壓力，包括低營養(yǎng)、缺氧、低溫和高溫。已知對(duì)各類細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞中許多基因的表達(dá)有顯著影響的干擾素-Y處理同樣包括在內(nèi)。檢測(cè)了這些培養(yǎng)條件下M 個(gè)hLF封閉基因的表達(dá)形式。不管培養(yǎng)條件如何改變，所有的這些基因都保持沉默(圖3A)。 作為對(duì)照，根據(jù)微陣列數(shù)據(jù)和RT-PCR驗(yàn)證確認(rèn)了正常培養(yǎng)條件下在hLF細(xì)胞中一組61個(gè)沉默基因。其表達(dá)形式在其他培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證。61個(gè)基因中總計(jì)有對(duì)個(gè)(39%)至少在ー種條件下變得活躍的(圖3B)，與M個(gè)封閉基因中無激活的情況相比，這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(按Fisher精度檢驗(yàn)ρ < 0. 00007)。這些結(jié)果表明了封閉狀態(tài)在變化的生理?xiàng)l件下的高度穩(wěn)定性，與基因組中其它基因轉(zhuǎn)錄的不穩(wěn)定性形成了鮮明的對(duì)比。研究者經(jīng)常用全基因組基因表達(dá)形式(例如轉(zhuǎn)錄基因組學(xué))作為定義細(xì)胞類型特征的方法。然而，一類細(xì)胞在不同生理?xiàng)l件下具有產(chǎn)生相當(dāng)不同的基因表達(dá)形式的潛能，使得轉(zhuǎn)錄基因組因?yàn)檫^于不穩(wěn)定而不能確切的定義細(xì)胞類型。與生理不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄基因組相比，在此描述的結(jié)果說明全基因組中基因的封閉形式 (如封閉基因組)可以更為確切的定義細(xì)胞類型。
探索封閉狀態(tài)的生化基礎(chǔ)
對(duì)封閉狀態(tài)的生化基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，集中于染色質(zhì)修飾。通常伴隨著基因沉默的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子DNA甲基化進(jìn)行了檢測(cè)。生物信息學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)hLF的對(duì)個(gè)封閉基因中的18個(gè)，10個(gè)反式激活基因中的4個(gè)有CpG島(總結(jié)在圖1B)。封閉基因因此表現(xiàn)為富含CpG島，盡管這只具有邊際顯著意義(按Fisher精度檢驗(yàn)ρ < 0. 06)。運(yùn)用大量的亞硫酸氫鹽法測(cè)序分析5個(gè)封閉的和5個(gè)反式激活的hLF基因的甲基化形式(在此分析的封閉基因中的3個(gè)和反式激活基因中的2個(gè)含有CpG島)。分析在hLF和hSMM兩類細(xì)胞中進(jìn)行。RT-PCR確認(rèn)所有10個(gè)基因在hSMM中都表達(dá)，表明在這類細(xì)胞中它們是能動(dòng)的。由于大部分基因?qū)喠蛩釟潲}測(cè)序法而言太大，推定的順式調(diào)節(jié)區(qū)域是通過跨物種序列保守性識(shí)別的。分析還包括了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS周圍的區(qū)域和實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的與保守性無關(guān)的增強(qiáng)子元件。圖4顯示了一個(gè)封閉基因(MyK)和一個(gè)反式激活基因(Actal)甲基化分析代表性的結(jié)果。其余8個(gè)基因的結(jié)果如圖14所示。在hLF和hSMM之間觀察到，5個(gè)封閉基因中的3個(gè)(Myf5,Cacngl和Rapsn)的甲基化顯著不同，至少在取樣的部分區(qū)域內(nèi)，hLF KhSMM中的甲基化程度要高。在剩下的兩個(gè)封閉基因中，Myodl在TSS的遠(yuǎn)上游增強(qiáng)子中顯示出少量不同的甲基化，而Tnni2在任何取樣的區(qū)域都沒有顯示出不同的甲基化。與封閉基因相反，反式激活基因在hLF和hSMM之間都沒有顯示明顯不同的甲基化。對(duì)于Myf5和Cacngl而言，在hLF中至少有部分甲基化區(qū)域落入CpG島內(nèi)。盡管通常認(rèn)為CpG島是非甲基化的，但還是存在明顯的例外，包括X-失活的許多基因、部分印記基因和癌細(xì)胞中異常沉默的基因。此外，普通的CpG甲基化偶爾可以在非印記、非X-失活的基因中發(fā)現(xiàn)，通常以組織特異化的形式存在。因此一些封閉基因CpG島內(nèi)的甲基化可能代表了另一個(gè)這樣的特例。對(duì)于在hLF和hSMM之間存在顯著差異甲基化的3個(gè)hLF封閉基因，TSS附近的區(qū)域是甲基化差異區(qū)域的一部分。使用亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)其余23個(gè)基因(不包括Ly75，因?yàn)樵诩夹g(shù)上無法對(duì)其進(jìn)行亞硫酸氫鹽測(cè)序)的TSS的甲基化狀態(tài)。hLF和hSMM之間的這些基因只存在很小或者沒有甲基化差異，不管它們?cè)趆LF中是否封閉(圖15，TSS甲基化分析的數(shù)據(jù)也總結(jié)在圖IB中)。對(duì)于部分基因，封閉狀態(tài)特征在于能動(dòng)狀態(tài)甲基化的增加，特別是TSS周圍。然而，許多在hLF中封閉而在hSMM中能動(dòng)的基因之間，在TSS中沒有顯示出明顯的甲基化差異，表明甲基化要么不參與這些基因的封閉狀態(tài)，要么即使是參與的，也是在其它而不是TSS區(qū)域中發(fā)揮作用。至少對(duì)于部分基因來說，此處的數(shù)據(jù)與后一種可能相吻合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化是否會(huì)導(dǎo)致封閉狀態(tài)的產(chǎn)生，在細(xì)胞融合前使用去甲基試劑5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷(AdC)處理hLF。除了 Msln被試劑非常輕微地激活外，處理本身是不會(huì)開啟封閉的hLF基因。然而，在與mSMM融合中，大約一半hLF封閉基因顯示出不同水平的反式激活(圖5A)。當(dāng)然，這些基因中的絕大部分，hLF拷貝的表達(dá)水平明顯低于mSMM拷貝。這可能反映了細(xì)胞對(duì)藥物處理的異質(zhì)反應(yīng)，或部分封閉基因的去封閉的事實(shí)。值得注意的是AdC處理可以改變那些在hLF和hSMM之間未顯示出明顯TSS甲基化差異基因的封閉狀態(tài)。這表明DNA甲基化在維持這些基因的封閉狀態(tài)中發(fā)揮了一定的作用，但是它是通過影響TSS鄰近區(qū)外的調(diào)節(jié)區(qū)域而發(fā)揮作用。AdC處理改變這些基因中一部分的封閉狀態(tài)也有可能不是通過DNA的去甲基化，而是藥物對(duì)染色質(zhì)狀態(tài)其它未知的影響。但是這些結(jié)果，輔以亞硫酸氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)，說明至少對(duì)于部分基因而言，DNA甲基化可能是ー個(gè)促成其封閉的因素，在這里面可能還有其它機(jī)制起的作用。除了 DNA甲基化，許多染色質(zhì)標(biāo)記在基因組的沉默位點(diǎn)或被認(rèn)為是異染色質(zhì)的區(qū)域(例如失活的X染色體和著絲點(diǎn))不是偏高就是偏低。因此這些標(biāo)志可以作為尋找封閉狀態(tài)潛在生化機(jī)制的上好候選對(duì)象。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和PCR檢測(cè)了 16個(gè)這樣的標(biāo)志。包括 7 個(gè)組蛋白修飾((H3K9Ac、H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me3、H4K20mel 和 H4K20me3)，5 個(gè)組蛋白變體(H2A. X、macroH2A、H2A. Ζ、Η2Α. Bbd 和 CENPA)，以及 4 個(gè)染色質(zhì)結(jié)合的蛋白(Polycomb抑制是Drosophila異染色質(zhì)protin-Ι的哺乳動(dòng)物同源物的復(fù)合蛋白SUZ12和EZH2，以及HPl-α和HPl-Y)。在hLF的三類基因中檢測(cè)了這些標(biāo)志如圖IA描述的M個(gè)封閉基因和10個(gè)反式激活基因，和一組17個(gè)通過微陣列數(shù)據(jù)隨機(jī)篩選并由RT-PCR確認(rèn)的活躍表達(dá)的基因(表;3)。對(duì)于所有這些基因，染色質(zhì)分析的焦點(diǎn)在TSS 附近，因?yàn)樗桥c基因活性相關(guān)的不同染色質(zhì)修飾的主要位點(diǎn)。對(duì)于少部分基因，已確認(rèn)的增強(qiáng)子也包括在分析之內(nèi)。對(duì)于這些標(biāo)記中的大部分，沉默基因(包括封閉和反式激活基因)和表達(dá)基因之間在某種程度上有顯著的區(qū)別(圖6A)。特別是H3K9Ac，H;3Mme3和H2A. Z這三個(gè)標(biāo)志，相對(duì)于沉默基因，在表達(dá)基因中顯著富集，其中富集最顯著的是H3Mme3。相反，另外11個(gè)標(biāo)志，H3K9me2、H3K9me3、H3K27m3、H4K20me1、H4K20me3、H2A. X、macroH2A、CENPA、SUZ12、EZH2 和HPl-α，顯示了相反的趨勢(shì)相對(duì)于表達(dá)基因它們?cè)诔聊蛑酗@著富集，其中富集最顯著的是 H3K9me2，H3K9me3，H3K27me3 和 H4K20me3。兩個(gè)標(biāo)志，H2A. Bbd 和 HPl- Y，在沉默基因和表達(dá)基因之間沒有顯著的區(qū)別。然而，僅有ー個(gè)標(biāo)志，HPl-α，在兩類基因中顯示有顯著不同，相對(duì)于反式激活基因，富集在封閉基因中。為了在視覺上更直觀地表示基因間染色質(zhì)標(biāo)記間隔，使用主成分分析以將來自16 個(gè)標(biāo)記的16-維數(shù)據(jù)減少到2維。正如預(yù)期的，封閉基因和反式激活基因緊密地簇集在一起，而表達(dá)的基因是獨(dú)立成簇的(圖6Β)。這些數(shù)據(jù)表明，被調(diào)查的染色質(zhì)標(biāo)記中，沉默基因 (包括封閉和反式激活基因)和表達(dá)的基因之間非常不同，而封閉基因和反式激活基因相當(dāng)近似。不過，與反式激活基因相比，封閉基因表現(xiàn)富含ΗΡΙ-α結(jié)合位點(diǎn)，表明ΗΡΙ-α可能與封閉機(jī)制有關(guān)。ChIP數(shù)據(jù)不能確定封閉狀態(tài)和反式激活狀態(tài)之間的組蛋白乙?；瘏^(qū)別。為了進(jìn)一步探索組蛋白乙?；欠衽c基因的封閉有關(guān)，在細(xì)胞融合之前用組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾谹(trich0Statin A，TSA)處理hLF細(xì)胞。這個(gè)處理本身對(duì)封閉基因的沉默狀態(tài)沒有長(zhǎng)期影響。在融合之后，hLF基因組中僅有兩個(gè)基因Myodl and Rcan2，顯示出非常弱的反式激活(圖5B)。這些結(jié)果表明，與ChIP數(shù)據(jù)一祥，組蛋白乙酰化的水平不是建立封閉狀態(tài)的主要原因，盡管組蛋白低乙?；c表達(dá)的缺乏極其相關(guān)。識(shí)別人肺成纖維細(xì)胞中的其他封閉基因
盡管在hLF-mSMM融合實(shí)驗(yàn)中尋找封閉的hLF基因是以無偏見、系統(tǒng)的方式進(jìn)行，但是只有在mSMM中表達(dá)的基因可以研究。因此在hLF-mSMM融合中識(shí)別的hLF封閉基因絕大部分是肌肉相關(guān)的基因。然而，為了探査hLF中更多組的基因的封閉狀態(tài)，將hLF與其它類型的細(xì)胞包括鼠成骨細(xì)胞(mOst)、鼠肝細(xì)胞(mHe)和形成神經(jīng)元前體的鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤系 (mNeu)融合。和mSMM—起，這些細(xì)胞類型代表了全部三個(gè)胚層。對(duì)hLF和mOst之間的融合，重復(fù)用于hLF-mSMM融合的系統(tǒng)方法-如用微陣列分析確定候選封閉基因，接著用RT-PCR確認(rèn)。RT-PCR分析中還包括了在hLF-mSMM融合中識(shí)別的M個(gè)hLF封閉基因。通過這些方法，識(shí)別了 36個(gè)在mOst中表達(dá)但在hLF中封閉的基因，其中9個(gè)在hLF-mSMM融合表現(xiàn)為封閉(圖16)。在這些封閉基因中，需要特別注意的是Rimx2，它是ー個(gè)功能為成骨化主觸發(fā)器的轉(zhuǎn)錄因子。這類似于hLF-mSMM融合中發(fā)現(xiàn)的 hLF中肌化主調(diào)節(jié)子Myodl和Myf5的封閉。hLF-mSMM融合和hLF-mOst融合一起在hLF中識(shí)別出了 51個(gè)封閉基因。其中 11個(gè)之前顯示在人胚胎干細(xì)胞中結(jié)合有Polycomb抑制復(fù)合體2 (Polycomb Repressive Complex2PRC2)(這些Polycomb結(jié)合基因標(biāo)示在圖IB和圖16中)。這個(gè)數(shù)字明顯高于隨機(jī)期望(P < 0. 003)，因?yàn)樵谙惹暗难芯恐校?2500個(gè)被調(diào)查的基因中僅有1896個(gè)是Polycomb的結(jié)合目標(biāo)。這ー發(fā)現(xiàn)顯示出在多潛能ES細(xì)胞中Polycomb結(jié)合到某些基因和當(dāng)ES細(xì)胞分化成特異的細(xì)胞類型后這些基因的封閉之間可能存在ー個(gè)必然的 (mechanistic)聯(lián)系。將封閉基因清單與先前在鼠ES細(xì)胞中識(shí)別的雙價(jià)基因及啟動(dòng)子甲基化的基因(包括或不包括CpG島)清單進(jìn)行比較，但沒有發(fā)現(xiàn)有意義的關(guān)聯(lián)。對(duì)于hLF-mHe和hLF-mNeu融合，沒有使用費(fèi)時(shí)費(fèi)力的系統(tǒng)法，代替的是ー種更專注的方法(因此是非系統(tǒng)的)。隨機(jī)選擇ー組已知的肝基因，并通過RT-PCR檢測(cè)它們?cè)趍He 和hLF中的表達(dá)。在mHe中活躍但在hLF中沉默的基因進(jìn)ー步用RT-PCR檢測(cè)以確定其在 hLF-mHe融合中的表達(dá)形式。通過這些方法，在hLF中識(shí)別出了 6個(gè)封閉基因和3個(gè)反式激活基因(圖17)。同樣，隨機(jī)選擇ー組已知的神經(jīng)基因并在hLF-mNeu融合中檢測(cè)，識(shí)別出了 hLF中的3個(gè)的封閉基因和8個(gè)反式激活基因(圖17)。使用不同重編程細(xì)胞時(shí)封閉或反式激活的穩(wěn)定性
在hLF-mSMM融合中識(shí)別的M個(gè)hLF封閉基因中，9個(gè)在mOst中表達(dá)，2個(gè)在mHe中表達(dá)，還有ー個(gè)在mNeu中表達(dá)(其它基因在這些類型的細(xì)胞中沉默)。當(dāng)hLF與mSMM之外的其他類型細(xì)胞融合，這些基因在hLF中是否同樣表現(xiàn)為封閉也進(jìn)行了研究。通過hLF-mOst 融合，發(fā)現(xiàn)9個(gè)在mOst中表達(dá)的基因在hLF中確實(shí)都是封閉的(圖16)。類似地，hLF-mHe 融合中，2個(gè)在mHe中表達(dá)的基因在hLF中依然是封閉的，在mNeu中表達(dá)的ー個(gè)基因在hLF 中依然是封閉的(圖18)。在hLF-mSMM融合中識(shí)別的10個(gè)反式激活的hLF基因中，其中ー個(gè)在mOst中表達(dá)， 3個(gè)在mHe中表達(dá)。當(dāng)hLF與mSMM之外的其他類型細(xì)胞融合，這些基因在hLF中是否同樣表現(xiàn)為反式激活也進(jìn)行了研究。這就是觀察結(jié)果(圖19)。因此，給定應(yīng)答細(xì)胞類型中基因的封閉或反式激活對(duì)使用不同的重編程細(xì)胞作為融合對(duì)象是是穩(wěn)定的，盡管可能有例外。材料與方法細(xì)胞融合
鼠骨骼肌成肌細(xì)胞(mSMM)、成骨細(xì)胞(mOst)、肝細(xì)胞(mHe)和成神經(jīng)細(xì)胞瘤(mNeu)， 以及人的肺成纖維細(xì)胞(hLF)先前已經(jīng)描述過了，其為人們所知的通用名分別是C2C12、 MC3T3-E1、Subclone 4、AML12、Neuroja 和 MRC-5 (Blau et al.，1985 ；Klebe and Ruddle, 1969 ；Wang et al. , 1999 ；Wu et al. , 1994 ；Yaffe and Saxel，1977)。C2C12(CRL-1772)， MC3T3-E1 亞克隆 4 (CRL-2593)，MRC-5 (CCL-171)，Hela(CCL_2)和人角質(zhì)細(xì)胞(hKe ； CRL-2404)從ATCC獲得；人間質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)是按文獻(xiàn)Oiang et al.，2007)描述的方法獲得；黒猩猩真皮成纖維細(xì)胞(cDF ;S006007)從Coriell Institute for MedicalResearch)獲得；人骨骼肌成肌細(xì)胞QiSMM ;CC_2580T2。從Cambrex獲得。細(xì)胞培養(yǎng)的條件參照出版的或者供應(yīng)商提供的操作規(guī)程。新霉素抗性的mSMM細(xì)胞是通過轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech)然后用800 μ g/ mlG418篩選而得到。EGFP熒光在這個(gè)細(xì)胞群內(nèi)有所不同，但是與細(xì)胞分選用的染料熒光相比，這種不同微不足道。嘌呤霉素抗性的hLF細(xì)胞是利用來自Addgene的pBabe-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(#1764) (Morgenstern and Land, 1990)獲得的。將載體轉(zhuǎn)染入ProPakA. 6包裝細(xì)胞(ATCC)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，過濾病毒上清，然后在存在8 μ g/ml凝聚胺的情況下加入細(xì)胞中，M小時(shí)后用2 μ g/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞。在融合前一天，在細(xì)胞培養(yǎng)基中用30 μ M的CMTMR或10 μ M的CMFDA細(xì)胞追蹤染料(Invitrogen) 37°C下標(biāo)記細(xì)胞30分鐘。隨后，細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個(gè)小吋，用PBS 洗兩次。染色后，mSMM細(xì)胞培養(yǎng)在添加有2%馬血清的DMEM的低血清培養(yǎng)基。按照文獻(xiàn) (Davidson et al. , 1976)中描述的方法用聚乙ニ醇(MW1500)融合細(xì)胞。大致操作如下，將兩群中的一群細(xì)胞接平鋪在IOcm的組織培養(yǎng)皿中，然后將另外一群細(xì)胞覆蓋在其上。細(xì)胞粘附后，用溫PEG處理細(xì)胞1分鐘，然后用溫基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗三次。分選前將融合的細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)小吋。通過熒光激活細(xì)胞分選(FACQ具有雙熒光的融合細(xì)胞，使其純度>98%。FACS后，純化的融合細(xì)胞用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到RNA提取。在表達(dá)研究中，未融合的mSMM作為對(duì)照，在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)和融合細(xì)胞相同的周期。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中融合了抗生素抗性細(xì)胞的，在融合后一天將4-8 μ g/ml嘌呤霉素和400-800 μ g/ml G418 加入到培養(yǎng)基中。在融合中用到的mOst細(xì)胞系，MC3T3-E1亞克隆4是ー個(gè)成骨前細(xì)胞系， 如文獻(xiàn)(Franceschi and Iyer，1992)描述的那樣，在無抗壞血酸的培養(yǎng)基中維持正常的增殖狀態(tài)。在融合前，如文獻(xiàn)(Xiao et al. ,1997)描述的那樣，將細(xì)胞在抗壞血酸存在的情況下培養(yǎng)7天。微陣列分析
按供應(yīng)商的操作規(guī)程使用TRIZOL試劑(Invitrogen)純化hLF、mSMM和融合的細(xì)胞中總RNA，然后按照標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix操作規(guī)程合成微陣列探針。使用oligo(dT)引物 (Affymetrix)合成第一鏈，然后用該鏈和GeneChip One-Cycle cDNA試劑盒合成雙鏈cDNA 樣品，再用該雙鏈DNA和GeneChip IVT標(biāo)記試劑盒(Affymetrix)合成生物素標(biāo)記的cRNA。 然后用 GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix)將標(biāo)記的 cRNA 樣品切割成片段。 雜交、標(biāo)記和掃描都是由Manford大學(xué)的蛋白和核酸機(jī)構(gòu)(PAN)進(jìn)行。將每類細(xì)胞標(biāo)記的 cRNA樣品與鼠MG U74Av2和人HG U133A基因芯片(Affymetrix)進(jìn)行雜交并重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確定基因表達(dá)和種間的交叉雜交。芯片掃描圖的探針?biāo)椒治鲇葾ffymetrix芯片操作軟件(GC0Q進(jìn)行。在hLF-mOst融合細(xì)胞中進(jìn)行類似的雜交過程。檢測(cè)閾值ρ-值被設(shè)置為“存在” (ρ < 0.05)、“邊際” (0.05彡ρ彡0. 49)或“缺失”(ρ > 0. 49)，每ー基因的決定響應(yīng)值(decision calls)使用GCOS按MAS 5.0標(biāo)準(zhǔn)分配。根據(jù)絕對(duì)決定響應(yīng)值過濾基因清單得到封閉基因候選清單并使用GeneSpringGilicon Genetics)進(jìn)行分析。過濾的封閉基因根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)在hLF與人芯片雜交中所有重復(fù)都 “缺失”的響應(yīng)、在融合細(xì)胞與人芯片雜交中所有重復(fù)都“缺失”的響應(yīng)、在mSMM與鼠芯片雜交中重復(fù)的至少ー個(gè)為“存在”或“邊際”的響應(yīng)、在融合細(xì)胞與鼠芯片雜交中重復(fù)的至少ー 個(gè)為“存在”或“邊際”的響應(yīng)。反式激活基因的過濾按1)使用GeneSpring按在hLF與人芯片雜交中所有重復(fù)都“缺失”的響應(yīng)、在融合細(xì)胞與人芯片雜交中重復(fù)的至少ー個(gè)為“存在”或“邊際”的響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)絕對(duì)決定響應(yīng)值比較基因；2)使用RMAexpress (http:// rmaexpress. bmbolstad. com) RMA標(biāo)準(zhǔn)化的信號(hào)強(qiáng)度為依據(jù)，選擇兩種細(xì)胞中表現(xiàn)出表達(dá)差異的基因；或者;3)使用 dChip (http ://biosunl. harvard, edu/complab/dchip)基于模型表達(dá)指數(shù)分析比較來自兩種細(xì)胞的數(shù)據(jù)。和測(cè)序
使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄RNAQ μ g以上)、或者按供應(yīng)商操作規(guī)程使用含有RT-PCR隨機(jī)引物的superscript III第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen) 得到cDNA。使用不同模板濃度和PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行半定量PCR以獲得每個(gè)基因擴(kuò)增的線性范圍。對(duì)于人-黒猩猩融合實(shí)驗(yàn)，引物選擇的依據(jù)是識(shí)別非多態(tài)性起始序列，這些起始序列分布在跨內(nèi)含子的擴(kuò)增子(amplicons)的兩側(cè)，根據(jù)基因序列分析表明兩個(gè)物種之間的這些擴(kuò)增子中至少含有一種單核苷酸取代。對(duì)于鼠-鼠融合實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)鼠品系之間的擴(kuò)增子含有至少ー種可通過隨機(jī)測(cè)序跨內(nèi)含子的擴(kuò)增子附近序列確認(rèn)的多態(tài)性。PCR引物的序列和RT-PCR具體的條件可以向發(fā)明人請(qǐng)求獲得。所有的DNA序列分析使用ABI BigDye Terminator (Applied Biosystems) ^ABI 3730DNA Analyzer ± 。合成和細(xì)胞核融合的分析
對(duì)于細(xì)胞核融合的分析，融合之前將未融合的細(xì)胞在加入了 IOyM 5-碘-2’-脫氧尿苷(IdU)或5-氯-2’ -脫氧尿苷(CldU)的培養(yǎng)基中標(biāo)記72小吋，然后按照出版的操作規(guī)程(Vega and Peterson, 2005)用鼠單克隆抗 IdU 抗體(Becton-Dickinson，#347580 ； 1 500稀釋)和大鼠單克隆抗CldU抗體(Accurate，#0BT0030 ；1 250)對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。當(dāng)IdU和CldU用于雙染色吋，兩個(gè)抗體不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，但是兩者都能識(shí)別 5-溴-2，-脫氧尿苷(BrdU)。ニ抗是 Oregon Green 標(biāo)記的羊抗鼠(Invitrogen ;1 1000) 和Cy3標(biāo)記的鼠抗大鼠(Jackson Immunoresearch ； 1 300)。對(duì)于DNA合成的分析，細(xì)胞融合72小時(shí)后立即加入10 μ M BrdU，之后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用抗BrdU抗體(Accurate，#0BT0030 ； 1 250)對(duì)細(xì)胞染色。由于將鹵化核苷酸整合到DNA中可能影響基因的表達(dá)，因此將與鹵化核苷酸標(biāo)記相關(guān)的融合實(shí)驗(yàn)與確定基因表達(dá)狀態(tài)的融合實(shí)驗(yàn)分開進(jìn)行。染色質(zhì)分析
根據(jù) UCSC 基因組瀏覽器(UCSC Genome Browser) (Placental Mammal Conserved Elements by28_way Multiz Alignment, Kuhn et al. ,2007)確定的跨物種保守區(qū)域，挑選用于亞硫酸氫鹽測(cè)序的目標(biāo)基因組區(qū)域。按文獻(xiàn)(Vallender and Lahn,2006)中描述的亞硫酸氫鹽誘變測(cè)序進(jìn)行DNA甲基化分析。對(duì)大約20個(gè)克隆的興趣區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，并用軟件BiQ Analyzer分析序列文件(Bock et al.，2005)。亞硫酸氫鹽測(cè)序的引物可以向發(fā)明人請(qǐng)求獲得。使用6組引物都未能擴(kuò)增Ly75的TSS區(qū)域后，放棄對(duì)其分析。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)基本上是按照以前描述的方法進(jìn)行(Li et al.，2003)， 修改如下用帶有0.5英寸平角頭的Fisher Dismembrator Model 500以33%的功率，超聲處理7ml —份的試樣9個(gè)循環(huán)，毎次循環(huán)20s。這種程度的超聲獲得的DNA片段平均大小是300-700bp。為了對(duì)7X IO6個(gè)細(xì)胞的進(jìn)行免疫共沉淀，用40 μ 1 1的蛋白A和蛋白G磁珠(Dynabeads) (Invitrogen)偶聯(lián)10 μ g抗體，然后與超聲過的染色質(zhì)樣品一起培養(yǎng)過夜。免疫共沉淀的染色質(zhì)用150 μ 1洗脫液緩沖液(50mM Tris pH 8, IOmM EDTA，1 % SDS)從磁珠上洗脫下來，經(jīng)蛋白酶K(Roche)消化后，使用GenCatch PCR Cleanup試劑盒(Epoch Biolabs)純化DNA。每個(gè)擴(kuò)增子用特定的模版濃度和PCR循環(huán)進(jìn)行半定量 PCR以獲得線性范圍的擴(kuò)増。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳固定，并通過溴化乙錠染色而 ロ丁見。使用 Gel Analyzer module of ImageJ 1. 37v (National Institutes of Health， http://rsb.info.nih.gov/ij)對(duì)清除背景后的PCR帶圖像進(jìn)行光密度分析。將測(cè)量的PCR帶強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化作為IP輸入對(duì)照。每個(gè)數(shù)值點(diǎn)是至少三個(gè)獨(dú)立重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值。PCR引物的序列和具體的PCR條件可以向發(fā)明人請(qǐng)求獲得。ChIP所用的抗體如下 抗 H3(abl791)、H3K9Ac(ab4441)、H3K4me3(ab8580)、H3K9me2(abl220)、H3K9me3(ab8898)、 H3K27me3 (ab6002)、H4K20mel (ab9051)、H4K20me3 (ab9053)、H2A.X(ablll75)、 macroH2A. 1 (ab37264)、H2A. Z (ab4174)、H2A. Bbd(ab4175)和 HPl-gamma (ab50365)購自 Abeam ；抗 CENP- α (sc-22787)購自 Santa Cruz Biotechnology ；抗 SUZ12 (04-046)和 HPl-α Ipha (05-689)購自 Millipore ；抗 ΕΖΗ2 (36-6300)購自 hvitrogen。在DNA甲基化的藥物抑制實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞首先以20-25%的密度平板培養(yǎng)，并用 IOyM的5-氮雜-2’脫氧胞嘧啶核苷(AdC)處理，直到細(xì)胞數(shù)量?jī)纱伪秹?。然后進(jìn)行細(xì)胞融合，融合的細(xì)胞不帶AdC再培養(yǎng)4天。對(duì)于組蛋白乙?；乃幬镆种茖?shí)驗(yàn)，在融合前用 1 μ M曲古霉素A處理細(xì)胞M小吋。對(duì)于AdC和曲古霉素A共同處理，對(duì)照細(xì)胞無需融合， 暴露于藥物處理相同的時(shí)間。在生理改變下基因表達(dá)的分析
細(xì)胞要么在正常條件下(10%小牛血清，37°C )，要么在ー個(gè)模擬生理變化的條件下包括低養(yǎng)分(0.1%血清)，缺氧(380 μ M的缺氧模擬物去鐵胺)、低溫(33°C)、高溫(41°C ) 和干擾素-Y處理(lOOng/ml ；Cell Sciences)培養(yǎng)。每種條件下培養(yǎng)細(xì)胞持三天，然后如本說明書所述用，RT-PCR分析挑選的基因。表一封閉的、反式激活的、消減的基因的表達(dá)形式
重編程細(xì)胞巾的表達(dá)形式應(yīng)答細(xì)胞巾的表達(dá)形式結(jié)論融合前融合后融合前融合后活躍的活躍的活躍的活躍的活躍的沉默的沉默的沉默的沉默的沉默的活躍的沉默的基因在應(yīng)答細(xì)胞中封閉基因在應(yīng)答細(xì)胞中反式激活，因此是能動(dòng)的基因在重編程細(xì)胞中消減
表2.在hLF-mSMM融合細(xì)胞中識(shí)別的封閉和反式激活的hLF基因
權(quán)利要求
1.確定與反式機(jī)制相比，順式機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因有關(guān)貢獻(xiàn)的方法，方法包括(a)在體外融合至少兩類不同的細(xì)胞；(b)比較來自不同細(xì)胞基因組的目標(biāo)基因在未融合和融合細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過確定與目標(biāo)基因?qū)Ρ灰肴诤霞?xì)胞的共享環(huán)境中的反式信號(hào)的相關(guān)響應(yīng)性，確定反式機(jī)制與順式機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因的貢獻(xiàn)度。
2.在目標(biāo)基因組中，確定與反式機(jī)制相比，順式機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因有關(guān)貢獻(xiàn)的方法， 方法包括(a)在體外融合至少兩類不同的細(xì)胞；(b)捜索在融合細(xì)胞和未融合細(xì)胞基因組之間表達(dá)不同的目標(biāo)基因，引入并共享融合細(xì)胞的順式封閉基因不能應(yīng)答反式信號(hào)；并(c)比較順式基因和反式基因?qū)φ{(diào)節(jié)編碼基因的有關(guān)貢獻(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過融合不同的細(xì)胞(例如應(yīng)答細(xì)胞和重編程細(xì)胞)確定不同調(diào)控機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因貢獻(xiàn)的方法。通過反式互補(bǔ)機(jī)制以及融合細(xì)胞和未融合細(xì)胞中反映出的差異表達(dá)，在應(yīng)答細(xì)胞中識(shí)別出不同調(diào)控機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)編碼基因貢獻(xiàn)的方法。利用反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)識(shí)別和區(qū)分的封閉基因在研究健康和疾病包括癌癥的治療中有廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102559899SQ20121001351
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
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