專(zhuān)利名稱(chēng)：可調(diào)型基因自殺機(jī)制組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生、純化、配制和使用作為靶向遞送媒介的真細(xì)菌 小細(xì)胞的組合物和方法，所述媒介用于體內(nèi)和體外核酸、蛋白和小分子藥物的遞送以及靶 向體內(nèi)成像和診斷技術(shù)。相關(guān)技術(shù)的描述提供下列說(shuō)明以輔助理解本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容，但是并非承認(rèn)描述或構(gòu)成針對(duì)本公開(kāi) 的現(xiàn)有技術(shù)。本申請(qǐng)中所提及或引用的文章、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)和所有其他文獻(xiàn)以及電子化 可利用信息的內(nèi)容，都通過(guò)引用的方式全文并入本文，其并入的程度，如同每篇單獨(dú)的出版 物被特別且單獨(dú)指出通過(guò)引用的方式并入一樣。本申請(qǐng)人保留將任何和所有來(lái)源于任何此 類(lèi)文章、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)或其他的文獻(xiàn)的材料和信息在物理上并入本申請(qǐng)的權(quán)利。小細(xì)胞是非染色體的、被膜包裹的生物納米粒子(< 400nm)，該納米粒子在細(xì)菌 細(xì)胞的正常分裂器破壞后，由細(xì)菌形成。本質(zhì)上，小細(xì)胞是正常細(xì)菌細(xì)胞的小的、新陳代謝 活躍的復(fù)制品，但是它們不含有染色體DNA并因此為非分裂的和無(wú)存活力的。盡管小細(xì)胞 不含有染色體DNA、質(zhì)粒DNA分子、RNA分子，但已證明天然和/或重組表達(dá)蛋白和其他的代 謝物都可分離出小細(xì)胞。在整個(gè)上世紀(jì)中，研究科學(xué)家已利用小細(xì)胞作為研究細(xì)胞分裂、質(zhì)粒復(fù)制、質(zhì)粒分 離、RNA產(chǎn)生、蛋白產(chǎn)生、質(zhì)粒隔離、質(zhì)粒表征和原核生物中質(zhì)粒源性毒力因子產(chǎn)生的工具。作為微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)展的結(jié)果，任何給定的小細(xì) 胞，不管其來(lái)自哪種親代細(xì)胞種類(lèi)，現(xiàn)在都可以被“改造”并隨后用作體內(nèi)或體外靶向遞送 或成像的媒介。小細(xì)胞特別適合于作為體內(nèi)遞送和成像的媒介，因?yàn)樗鼈儗⒃S多其他的遞送技術(shù) 的單獨(dú)的優(yōu)勢(shì)組合成單一的通用遞送媒介。小細(xì)胞可以被“改造”為優(yōu)先封裝、偶聯(lián)或吸收 包括各種核酸、蛋白和小分子藥物的生物活性分子，以用于隨后的治療和預(yù)防醫(yī)藥應(yīng)用。如 下文更為詳細(xì)描述的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用幾種不同的抗體或基于親和力的方法，它們可以靶向 于特定的細(xì)胞、組織和器官類(lèi)型，所以小細(xì)胞具有更多優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述一些實(shí)施方案提供了產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，所述細(xì)菌包含編碼產(chǎn)生小細(xì)胞的基因 產(chǎn)物的可表達(dá)基因，該基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)隔膜形成、二分裂和染色體分離中的一個(gè)或多個(gè)；和編 碼核酸內(nèi)切酶的可表達(dá)基因，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌的染色體包含一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi) 切酶的識(shí)別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生小細(xì)胞的基因是細(xì)胞分裂基因。細(xì)胞分裂基因 包括但不限于ftsZ、sulA、CCdB以及sfiC。在一些實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)所述產(chǎn)生小細(xì)胞的基因。在一些實(shí)施方案中，核酸內(nèi)切酶基因位于產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌 的染色體上。在一些實(shí)施方案中，核酸內(nèi)切酶是歸巢核酸內(nèi)切酶(homing endonuclease) 0 所述歸巢核酸內(nèi)切酶包括但不限于I-CeuI、PI-SceI, I-Chul、I-CpaI、I-SceIII, I-CreI、 I-Msoia-Scelia-ScelVa-Csmia-DmoI.I-Porl,PI-TliI,PI-TliII 和 PI-ScpI。在一些 實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)所述核酸內(nèi)切酶。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生小 細(xì)胞的細(xì)菌是革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于空腸彎曲菌(CampylcAacter jejuni)、乳桿菌屬禾中(Lactobacillus spp·)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、 嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、沙門(mén)氏菌屬種(Salmonella spp.)、志賀氏 菌屬種(Shigella spp.)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌包含編碼參與脂多糖合成 的基因產(chǎn)物的基因，與相應(yīng)的野生型基因相比，所述基因是遺傳修飾的。在一些實(shí)施方案 中，所述基因是msbB基因，該基因編碼基因產(chǎn)物，與相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的脂質(zhì)A分子相 比，所述基因產(chǎn)物引起細(xì)菌產(chǎn)生改變的脂質(zhì)A分子。在一些實(shí)施方案中，與相應(yīng)的野生型 細(xì)菌中的脂質(zhì)A分子相比，對(duì)于將肉豆蔻酸(myristolic acid)添加至脂多糖分子的脂 質(zhì)A部分而言，所述改變的脂質(zhì)A分子是有缺陷的。產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于葡萄球菌屬種Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬種 (Streptococcus spp·)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或賭樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌包含參與同源重組的基因，其中與相應(yīng)的 野生型基因相比，這一基因是遺傳修飾的，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌在DNA損傷修復(fù)方 面是有缺陷的。一些其他的實(shí)施方案提供了制備小細(xì)胞的方法，包括培養(yǎng)本文所公開(kāi)的產(chǎn)生小細(xì) 胞的細(xì)菌和將小細(xì)胞與產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞基本分離，因此產(chǎn)生包含小細(xì)胞的組合物。 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括由產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞誘導(dǎo)小細(xì)胞的形成。在一些 實(shí)施方案中，所述方法還包括誘導(dǎo)編碼核酸內(nèi)切酶的基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò) 一種或多種選自異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、 蜜二糖(melbiose)和四環(huán)素的化學(xué)化合物的存在誘導(dǎo)小細(xì)胞形成。在一些實(shí)施方案中，通 過(guò)溫度變化誘導(dǎo)編碼核酸內(nèi)切酶的基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括由所 述組合物純化小細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)選自離心、超速離心、密度梯度、免疫親和性 和免疫沉淀的方法將所述小細(xì)胞與親代細(xì)胞基本分離。一些其他的實(shí)施方案提供了包含外膜的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述外膜包含沒(méi)有肉 豆蔻酸部分的脂質(zhì)A分子。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的真細(xì)菌小細(xì)胞的外膜具有這 樣的成分與來(lái)自相應(yīng)的野生型細(xì)菌的真細(xì)菌小細(xì)胞的外膜相比，所述成分導(dǎo)致哺乳動(dòng)物 宿主中促炎癥免疫反應(yīng)的減少。在一些實(shí)施方案中，所述真細(xì)菌小細(xì)胞還包含一種或多種 生物活性化合物。在一些實(shí)施方案中，至少一種生物活性化合物選自放射性同位素、多肽、 核酸和小分子。生物活性化合物可以是小藥物分子、小分子成像劑、化學(xué)治療劑或前體藥物 轉(zhuǎn)化酶。生物活性化合物也可以是核酸和小分子的組合，小分子成像劑和小分子藥物的組 合，小分子藥物、小分子成像劑和核酸的組合，或核酸和多肽的組合。在一些實(shí)施方案中， 本文所公開(kāi)的真細(xì)菌小細(xì)胞還包含細(xì)胞表面定位的靶向部分(cell-surface localized targeting moiety)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是所述真細(xì)菌的外膜錨定結(jié)構(gòu)域和抗體片段的融合物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞 表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是淋病奈瑟氏菌IgAP和識(shí)別哺乳動(dòng) 物細(xì)胞表面抗原的抗體片段的融合物。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原選自脂 肪分化相關(guān)蛋白(adipophilin)、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、細(xì)胞周期蛋白 DU DKK1、 ENAH、Ep-CAM (上皮細(xì)胞粘附分子)、EphA3、FGF5 (纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子5)、G250/MN/CAIX、 HER-2/neu、IL-13Rα 2、腸羧基酯酶、甲胎蛋白(alpha-foetoprotein)、M-CSF(巨噬細(xì)胞集 落刺激因子)、MCSP、mdm-2、MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)、MUC-I、p53、PBF、PRAME、PSMA(前 列腺特異性膜抗原)、RAGE-1、RGS5(G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白5)、RNF43 (環(huán)指蛋白43)、RU2AS、分 離蛋白 Ksecernin 1)、S0X10、STEAPl、生存素(survivin)、端粒酶(Telomerase)、WTl (腎 母細(xì)胞瘤1)、Cdc27、⑶K4(細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4)、⑶KNh(細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激 酶 2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE1-8、GnTV、HERV-K-MEL,KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-Al、 MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白(muc iη)、ΝΑ-88、NY-ESO-1、 LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-166 和 TRP2-INT2。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是顯示I-CeuI對(duì)Ε. coli培養(yǎng)物生長(zhǎng)影響的圖。圖2是顯示I-CeuI對(duì)E. coli生存力影響的圖。圖3A和;3B是顯示與單獨(dú)的min⑶E突變體或ftsZ超表達(dá)相比，同時(shí)ftsZ超表達(dá) 和I-CeuI誘導(dǎo)導(dǎo)致更高的小細(xì)胞產(chǎn)量的柱狀圖。圖4A-D是顯示基于ftsZ超表達(dá)和I-CeuI誘導(dǎo)的自殺系統(tǒng)使親代細(xì)胞絲狀形成 增加的圖。圖5是顯示基于I-CeuI的自殺系統(tǒng)引入不可修復(fù)的雙鏈染色體斷裂的柱狀圖。圖6是顯示基于I-CeuI的自殺系統(tǒng)減少純化的小細(xì)胞中的親代細(xì)胞污染的柱狀 圖。圖7是顯示鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S. Typhimurium)中mslA基因的缺失改變脂多糖 (LPS)譜的銀染色的SDS-PAGE (十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠。圖8是顯示mslDb的缺失引起J774. Al小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的抗鼠 傷寒沙門(mén)氏菌LPS的腫瘤壞死因子α (TNFa)的柱狀圖。圖9顯示單鏈I-CeuI DNA識(shí)別序列和雙鏈I-Ceul DNA切割位點(diǎn)。發(fā)明的詳細(xì)描述^X本文所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞分裂基因”指的是編碼參與細(xì)胞分裂過(guò)程的基因產(chǎn)物的 基因。在本領(lǐng)域中已發(fā)現(xiàn)并表征了許多細(xì)胞分裂基因。所述細(xì)胞分裂基因的實(shí)例包括但不 限于 zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsl、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、 ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sf iC 禾口 ddlB。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指的是天然地或通過(guò)許多基因工程技術(shù)的任何一種 從一個(gè)生物體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物體的基因或遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因是 含有基因序列的DNA區(qū)段，所述基因序列已被從一個(gè)生物體分離出來(lái)并被引入到不同的生 物體中。這種非天然的DNA區(qū)段可以保留在轉(zhuǎn)基因生物體中產(chǎn)生RNA或蛋白的能力，或它 可以改變轉(zhuǎn)基因生物體遺傳密碼的正常功能。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因是人工構(gòu)建的DNA序列，不管它是否包含基因編碼序列，將所述DNA序列引入到其中之前不存在該轉(zhuǎn)基 因的生物體。如本文所使用的，如果相對(duì)于進(jìn)行純化前的組合物，在組合物中該試劑的濃度增 加和/或一種或多種不期望的污染物的濃度減少，則說(shuō)已純化這一試劑。因此純化包括富 集組 合物中的試劑和/或從所述組合物中分離試劑。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”或“蛋白結(jié)構(gòu)域”指的是具有共同的物理和/或化學(xué) 特征的分子或結(jié)構(gòu)的區(qū)域。蛋白結(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例包括疏水的跨膜或外周膜結(jié)合區(qū)、 球狀的酶促區(qū)或受體區(qū)、蛋白_蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和/或核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“真細(xì)菌”和“原核生物”如本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的那些 術(shù)語(yǔ)一樣。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“真細(xì)菌”和“原核生物”包括真細(xì)菌，其包括革蘭氏陰性 細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、原核病毒(例如噬菌體)和專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)(例如立克次體 (Richettsia)、衣原體(Chlamydia)等)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”指的是不同核酸分子的任何集合。核酸可以是 ssDNA (單鏈 DNA)、dsDNA (雙鏈 DNA)、ssRNA (單鏈 RNA)、dsRNA (雙鏈 RNA)、tRNA (轉(zhuǎn)運(yùn) RNA)(包括稀有密碼子使用的tRNA)、mRNA (信使RNA)、核糖體RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、 DNA-RNA雜合體、反義寡核苷酸、核酶或適體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“超表達(dá)”指的是宿主細(xì)胞中DNA所編碼的多肽或蛋白的表達(dá)， 其中所述多肽或蛋白不是宿主細(xì)胞中正常存在的，或其中所述多肽或蛋白在宿主細(xì)胞中的 存在水平高于編碼所述多肽或蛋白的內(nèi)源性基因所正常表達(dá)的多肽或蛋白的水平。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指直接或間接與靶標(biāo)相互作用以至于改變所述靶標(biāo)活 性來(lái)調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程?！罢{(diào)節(jié)”的模式包括但不限于增強(qiáng)靶標(biāo)的活性、抑制靶標(biāo)的活性、限制 靶標(biāo)的活性或擴(kuò)展靶標(biāo)的活性。碰真細(xì)菌小細(xì)胞非常適于用作靶向遞送載體和成像載體。因?yàn)樗鼈儊?lái)自通常是固有 致病的或至少條件致病的細(xì)菌，所以在體內(nèi)系統(tǒng)給藥特別是靜脈內(nèi)給藥之前，從給定的群 體中功能性地消除污染性親代細(xì)胞是有利的。因此，理想的小細(xì)胞制劑將是這樣的制劑，在 所述制劑中，隨著小細(xì)胞被處理和純化，殘余的活親代細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)盡可能低。實(shí)現(xiàn)這一目的 的一種方法是，在物理分離步驟已完成后，引入自殺機(jī)制以殺死殘余的親代細(xì)胞。這種增強(qiáng) 的安全特性減少了感染和敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)，降低了通過(guò)與其他細(xì)菌的重組事件而導(dǎo)致的遺傳 回復(fù)突變的可能性，并且使宿主中插入事件的風(fēng)險(xiǎn)最小化。優(yōu)選的是從產(chǎn)生小細(xì)胞的親代 細(xì)胞菌株的細(xì)菌染色體中除去抗生素抗性標(biāo)記物。從產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌株中除去抗生素抗 性基因標(biāo)記物是理想的，因?yàn)檫@樣可以滿(mǎn)足美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)對(duì)人類(lèi)應(yīng)用的監(jiān) 管要求。對(duì)于最終產(chǎn)品意圖應(yīng)用于人類(lèi)的菌株而言，F(xiàn)DA只允許出于選擇細(xì)菌或細(xì)菌生產(chǎn)株 的目的而使用的卡那霉素(Kanamycin)抗性基因標(biāo)記物。而且，F(xiàn)DA要求用于分析藥物產(chǎn) 品和最終的小細(xì)胞制劑的某些證明標(biāo)準(zhǔn)必須滿(mǎn)足USP (美國(guó)藥典)和ICH(國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議) 對(duì)純度、聚集物缺乏和特定物質(zhì)缺乏的指標(biāo)。因此，藥物產(chǎn)品的上游和下游加工都?xì)w入公司 的化學(xué)、生產(chǎn)和控制(CMC)藥物產(chǎn)品產(chǎn)生活動(dòng)。對(duì)更好的純化方法的需求是研發(fā)來(lái)自致病菌的小細(xì)胞的難題。本發(fā)明的實(shí)施方案 涉及可調(diào)型基因自殺機(jī)制的引入和用途，一旦暴露于適當(dāng)?shù)男盘?hào)，該機(jī)制就將不可修復(fù)的雙鏈斷裂引入至產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞的染色體中，從而導(dǎo)致親代細(xì)胞死亡。與其他的產(chǎn) 生小細(xì)胞的菌株相比，自殺機(jī)制的激活也增加了小細(xì)胞的產(chǎn)量，而且同時(shí)使所有產(chǎn)生小細(xì) 胞的親代細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆的絲狀表型。因此，本文所公開(kāi)的自殺機(jī)制不限于促進(jìn)攜帶染 色體的親代細(xì)菌細(xì)胞的死亡，而是能具有其他多功能作用，即共同作用以改進(jìn)小細(xì)胞產(chǎn)生。 在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的多功能自殺機(jī)制即“MSM”系統(tǒng)所發(fā)揮的作用是，殺死攜帶 染色體的親代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的“MSM”系統(tǒng)所發(fā)揮的作用是，增加小 細(xì)胞的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的“MSM”系統(tǒng)所發(fā)揮的作用是，專(zhuān)門(mén)地誘導(dǎo)親 代細(xì)胞的不可逆的絲狀表型以輔助親代細(xì)胞與小細(xì)胞分離。在一些實(shí)施方案中，本文所公 開(kāi)的“MSM”系統(tǒng)同時(shí)發(fā)揮以下作用(i)殺死攜帶染色體的親代細(xì)胞，(ii)增加小細(xì)胞的產(chǎn) 量，和(iii)專(zhuān)門(mén)地誘導(dǎo)親代細(xì)胞的不可逆的絲狀表型以輔助親代細(xì)胞與小細(xì)胞分離。所 述MSM系統(tǒng)的多功能作用能利用本文所述的技術(shù)改善小細(xì)胞的產(chǎn)生和純度。一些實(shí)施方案涉及組合物和方法，所述組合物和方法用于通過(guò)將多功能基因自殺 機(jī)制即“MSM”系統(tǒng)引入至產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞系，從而減少或消除可存活的污染性產(chǎn)生 小細(xì)胞的活真細(xì)菌親代細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)優(yōu)化所產(chǎn)生的小細(xì)胞的產(chǎn)量和純度。一些實(shí) 施方 案還涉及MSM系統(tǒng)用于在合成生物學(xué)應(yīng)用中的用途。污染性的活親代細(xì)胞在最終的小細(xì)胞制劑中的存在，尤其對(duì)于來(lái)自活致病細(xì)菌和 條件致病細(xì)菌的小細(xì)胞來(lái)說(shuō)，是有問(wèn)題的。當(dāng)由細(xì)菌產(chǎn)生意圖在人類(lèi)或其他的哺乳動(dòng)物中 使用的生物制劑或藥物時(shí)，因?yàn)榧?xì)菌可能引起疾病、嚴(yán)重炎癥和在某些情況下導(dǎo)致死亡，因 此與污染性親代細(xì)菌相關(guān)的安全性和CMC問(wèn)題是至關(guān)重要的。本文所述的產(chǎn)生細(xì)菌小細(xì)胞 的組合物和方法不但改進(jìn)了小細(xì)胞的產(chǎn)生和純度，而且同時(shí)改善了用于體內(nèi)和其他用途的 小細(xì)胞制劑的安全特性。不限于下文的實(shí)施例，高純度和安全的小細(xì)胞制劑的體內(nèi)應(yīng)用可 以用于靶向生物成像和癌癥、遺傳病癥和感染性疾病的治療性預(yù)防和治療。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi) 容的一些實(shí)施方案涉及可調(diào)型基因MSM機(jī)制的引入和用途，即一旦暴露于適當(dāng)?shù)男盘?hào)，所 述可調(diào)型基因MSM機(jī)制就會(huì)將不可修復(fù)的損傷引入至產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞的染色體。所 述自殺機(jī)制同時(shí)有利于純化技術(shù)，所述純化技術(shù)旨在從意圖用于多數(shù)靶向遞送應(yīng)用中的小 細(xì)胞制劑中更好地消除可存活的親代細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可調(diào)型基因自殺機(jī)制”指的是這樣一種機(jī)制，其中一個(gè)細(xì)胞或一 組細(xì)胞受已知的和外部的來(lái)源刺激產(chǎn)生一種或多種基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物可以不可逆地 損傷細(xì)胞的生物學(xué)必需組件或細(xì)胞過(guò)程，從而使得所述細(xì)胞不再有存活力，也不能從所述 事件中恢復(fù)。術(shù)語(yǔ)“多功能自殺機(jī)制”即MSM，指的是使用可調(diào)型基因自殺機(jī)制同時(shí)誘導(dǎo)高 水平的小細(xì)胞產(chǎn)生、誘導(dǎo)親代細(xì)胞死亡和在誘導(dǎo)自殺元件期間專(zhuān)門(mén)在親代細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生 絲狀表型。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶向小細(xì)胞”或“靶向遞送”指的是這樣的小細(xì)胞組合物，其中 所述小細(xì)胞封裝一個(gè)或多個(gè)所選擇的生物活性分子而且展現(xiàn)小細(xì)胞的外部表面上的靶向 部分，不管小細(xì)胞是(i)完全完整的，(ii)原生質(zhì)體(外膜和細(xì)胞壁被移除)或(iii)原 生質(zhì)體(外膜被移除或可通透的)，從而使得所述部分特異性結(jié)合、被結(jié)合或通過(guò)一些其他 的方法特異性識(shí)別并因此在特定的細(xì)胞、器官或組織類(lèi)型中遞送、定位或聚集以遞送所述 小細(xì)胞的分子內(nèi)容物至體外或體內(nèi)的所述靶細(xì)胞、組織和器官類(lèi)型。意圖通過(guò)這種特異的 靶向來(lái)使用小細(xì)胞來(lái)遞送有效載荷至靶細(xì)胞或組織。
這種利用小細(xì)胞的體內(nèi)遞送應(yīng)用包括但不限于生物活性的(與生物學(xué)上有活性 的同義)小分子藥物、生物活性核酸、生物活性蛋白和生物活性脂多糖的靶向遞送，用以在 動(dòng)物中產(chǎn)生“生物學(xué)效應(yīng)”(與生物學(xué)反應(yīng)同義)。所述生物學(xué)效應(yīng)包括但不限于殺死靶 細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的效應(yīng)、取代在特定靶向細(xì)胞類(lèi)型中可能缺陷的或功能異常的基因的 效應(yīng)、減少在特定靶細(xì)胞中失調(diào)的蛋白或信號(hào)傳導(dǎo)分子的表達(dá)和/或活性的效應(yīng)、減少或 增加來(lái)自特定細(xì)胞的激素的分泌的效應(yīng)、刺激針對(duì)一種或多種抗原的適應(yīng)性細(xì)胞免疫反應(yīng) 的效應(yīng)、刺激針對(duì)一種或多種抗原的適應(yīng)性體液反應(yīng)的效應(yīng)、同時(shí)刺激針對(duì)一種或多種抗 原的適應(yīng)性體液反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的效應(yīng)、刺激或抑制一種或多種固有性免疫反應(yīng)的效 應(yīng)；積極地或消極地影響動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程的效應(yīng)，以及影響致病寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒 或其他的致病微生物中的生物學(xué)過(guò)程以治療或預(yù)防所述動(dòng)物體內(nèi)的疾病的效應(yīng)。生物活性 元件本身并不一定就具有免疫原性而誘導(dǎo)宿主動(dòng)物中的免疫反應(yīng)，但可以是因?yàn)槠渖锘?性的結(jié)果而間接地引起免疫反應(yīng)。真細(xì)菌小細(xì)胞對(duì)于遞送而言的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是它們可以被改造從而靶向并將生物活 性分子遞送至體內(nèi)的特定細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)與特異性針對(duì)靶細(xì)胞表面分子的小細(xì)胞抗體或抗 體衍生物的表面偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)所述靶向?？蛇x地，靶向可以通過(guò)產(chǎn)生小細(xì)胞的親代菌株的基因 工程來(lái)完成，從而使得它們產(chǎn)生的小細(xì)胞在小細(xì)胞外膜上表達(dá)并展現(xiàn)與靶細(xì)胞特異性表面 分子有親和力的抗體片段或其他多肽。在這后一種情況下，可以通過(guò)制備細(xì)胞表面定位的 靶向部分和例如來(lái)自淋病奈瑟氏菌的IgAP的跨膜蛋白序列間的嵌合融合蛋白，從而將所 述小細(xì)胞表面上經(jīng)修飾的靶向部分固定在膜上(見(jiàn)下文)。在它們的表面上展現(xiàn)所述抗體 和靶向部分的小細(xì)胞被用于靶向體內(nèi)的特定細(xì)胞類(lèi)型以?xún)?yōu)先地將它們的生物活性有效載 荷遞送至靶組織、器官和細(xì)胞類(lèi)型。意圖用于輔助將小細(xì)胞靶向至特定的組織、器官和細(xì)胞類(lèi)型的抗體或其任何部分 可以來(lái)自免疫球蛋白或免疫球蛋白亞類(lèi)，或是其一部分，包括但不限于IgA、IgM、IgD、IgG 或IgE。意圖用于促進(jìn)小細(xì)胞的靶向功能的任何亞類(lèi)的抗體可以是“人源化的”，但是也可 以在已知能夠通過(guò)適應(yīng)性免疫產(chǎn)生抗體反應(yīng)的任何動(dòng)物以?xún)?nèi)產(chǎn)生抗細(xì)胞特異性抗原的任 何亞類(lèi)的任何抗體，也能夠達(dá)到相同的目標(biāo)的。本質(zhì)上，所產(chǎn)生的抗體應(yīng)使得它們包含兩個(gè) 單獨(dú)的具有針對(duì)它們各自抗原的獨(dú)特特異性的臂。沒(méi)有受下文所限，修飾小細(xì)胞表面的靶 向部分可以來(lái)自噬菌體顯示文庫(kù)，或可以是來(lái)自識(shí)別靶細(xì)胞上的配體的細(xì)胞外受體片段的 嵌合融合蛋白。

抗體可以被改造為獨(dú)立地特異性針對(duì)不同抗原，從而使得單個(gè)的抗體同時(shí)靶向兩 種單獨(dú)的抗原。這被稱(chēng)為‘雙特異性’抗體或‘雙特異性’靶向部分。作為非限制性實(shí)例， 所述抗體可以被改造為其中一個(gè)Fab’識(shí)別給定的真細(xì)菌小細(xì)胞的推定的表面組分(例如 LPS 0-抗原)，并且所述雙特異性抗體的另一個(gè)Fab’可以被改造為識(shí)別諸如下文所列舉的 那些細(xì)胞特異性表面抗原。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)將具有各自特異性 的兩個(gè)單獨(dú)的抗體與蛋白A/G(Pr0tein A/G)相偶聯(lián)而將它們非共價(jià)性連接，從而形成能夠 粘附于小細(xì)胞表面的雙特異性抗體衍生物，其中所述復(fù)合物中的一個(gè)抗體特異性粘附于所 述小細(xì)胞的表面，而另一個(gè)抗體被展現(xiàn)，從而特異性識(shí)別并因此在體內(nèi)“靶向”特定的細(xì)胞、 組織或器官類(lèi)型。類(lèi)似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以利用各種交聯(lián)技術(shù)將具有單獨(dú)特 異性的兩個(gè)單獨(dú)的抗體共價(jià)連接，以達(dá)到相同的效果。
在一些實(shí)施方案中，小細(xì)胞被遺傳“改造”為在其表面表達(dá)并展現(xiàn)重組靶向蛋白。 這已經(jīng)通過(guò)利用包含抗原43-α外膜蛋白錨定結(jié)構(gòu)域與具有Chlam 12或CTP3特異性的單 鏈FcV(ScFv)抗體片段融合的融合蛋白，成功地在腸沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)中 實(shí)現(xiàn)。相似的研究已經(jīng)表明，表達(dá)并展現(xiàn)針對(duì)冠狀病毒(Coronavirus)表位的單鏈FcV抗 體片段與淋病奈瑟氏菌的外膜定位的IgA蛋白酶相融合的融合蛋白的E. coli細(xì)胞能夠在 體外中和冠狀病毒和預(yù)防感染?？梢岳孟嗤?lèi)型的策略以產(chǎn)生并 在小細(xì)胞表面展現(xiàn)靶向 融合蛋白。其他的包括LamB、OmpF, OmpC, OmpA, OmpD, PhoE, PAL和各種鞭毛蛋白的天然的 外膜蛋白已被用作革蘭氏陰性腸桿菌科(Enterobacteriacea)成員中的膜錨定和展現(xiàn)結(jié) 構(gòu)域。通常，相同的方法可以用于在來(lái)自任何腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或芽孢桿 菌科(Bacillaceae)成員的小細(xì)胞表面上表達(dá)和顯示抗體片段，從而使得所述小細(xì)胞成為 針對(duì)存在于涉及各種臨床指征的細(xì)胞、組織或器官類(lèi)型表面的抗原的“特異性”靶向遞送媒 介。實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的主要問(wèn)題是產(chǎn)生一個(gè)編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有推 定的或預(yù)測(cè)的外膜蛋白或外膜定位序列和對(duì)存在于給定的細(xì)胞、組織或器官類(lèi)型中的表面 分子有親和力的抗體、抗體衍生物或其他多肽序列。小細(xì)胞作為遞送媒介(靶向或非靶向的)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以組合遞送生物活性 分子。例如，已證明了當(dāng)小細(xì)胞被用作質(zhì)粒DNA疫苗的遞送媒介時(shí)，所述小細(xì)胞可以成功地 產(chǎn)生抗異源性抗原的體液免疫反應(yīng)。當(dāng)小細(xì)胞被用于同時(shí)遞送DNA疫苗和相應(yīng)的蛋白時(shí)， 體液反應(yīng)被極大地改進(jìn)，說(shuō)明了小細(xì)胞對(duì)于遞送選擇的靈活性的益處。在相似的方法中，所 述小細(xì)胞被用于封裝并遞送特異性針對(duì)不同mRNA轉(zhuǎn)錄物的不同核酸類(lèi)型的組合，所述核 酸類(lèi)型諸如質(zhì)粒DNA或各種反義干擾RNA (例如shRNA、siRNA)分子，從而使得在單次遞送 事件中沉默多個(gè)基因。小細(xì)胞也用于同時(shí)遞送兩種或多種小分子藥物，從而使得在單次事 件中定位多個(gè)細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)。本文所公開(kāi)的一些實(shí)施方案描述了能夠共同或單獨(dú)地遞送幾類(lèi)生物活性有效載 荷的靶向真細(xì)菌小細(xì)胞，其中借助應(yīng)用于常規(guī)分離技術(shù)的誘導(dǎo)型基因自殺機(jī)制的組合效 應(yīng)，所述小細(xì)胞最終制劑基本上不含任何剩余的可存活的污染性親代細(xì)胞。1.小細(xì)胞的產(chǎn)生小細(xì)胞是非染色體的、被膜包裹的生物納米粒子(< 400nm)，該納米粒子在細(xì)菌 細(xì)胞的正常分裂器破壞后，由細(xì)菌形成。本質(zhì)上，小細(xì)胞是正常細(xì)菌細(xì)胞的小的、新陳代謝 活躍的復(fù)制品，但是它們不含有染色體DNA并因此為非分裂的和無(wú)存活力的。盡管小細(xì)胞 不包含染色體DNA，質(zhì)粒、RNA分子、天然和/或重組表達(dá)蛋白和其他的代謝物都已顯示可分 離出小細(xì)胞。在2002年5月24日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10/154，951號(hào)中詳細(xì)討論了一 些產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌菌株的構(gòu)建方法，在此通過(guò)引用將其全文并入。染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂之間的協(xié)調(diào)的破壞導(dǎo)致從大多數(shù)桿狀原核生物的極性區(qū) 形成小細(xì)胞。通過(guò)一些涉及隔膜形成和二分裂的基因的超表達(dá)可以促進(jìn)染色體復(fù)制和細(xì)胞 分裂之間的協(xié)調(diào)的破壞?；蛘?，小細(xì)胞可以產(chǎn)生于在調(diào)節(jié)隔膜形成和二分裂的基因中含有 突變的菌株中。已在許多不同的原核生物中證明，受損的染色體分離機(jī)制也可以導(dǎo)致小細(xì) 胞的形成。類(lèi)似地，通過(guò)參與初期染色體分離至子細(xì)胞的過(guò)程的基因的超表達(dá)或突變可以實(shí) 現(xiàn)小細(xì)胞的產(chǎn)生。例如已證明E. coli的parC或mukB基因座的突變可產(chǎn)生小細(xì)胞。這兩者分別影響腸桿菌科的染色體分離過(guò)程中的獨(dú)立的且不可缺少的步驟。與本文所述的細(xì)胞 分裂基因相似，任何對(duì)參與染色體分離過(guò)程的給定基因的野生型水平進(jìn)行改造并導(dǎo)致小細(xì) 胞產(chǎn)生的操作也會(huì)在其他的家族成員中具有相似的效應(yīng)。因?yàn)榧?xì)胞分裂和染色體復(fù)制過(guò)程對(duì)于細(xì)胞存活十分關(guān)鍵，所以在原核家族成員中 負(fù)責(zé)這些過(guò)程的基因在遺傳上和功能上的保守性均很高。一個(gè)家族成員中可以驅(qū)動(dòng)小細(xì)胞 產(chǎn)生的細(xì)胞分裂基因的超表達(dá)或突變可以被用于在另一個(gè)家族成員中產(chǎn)生小細(xì)胞。例如， 已證明E. coli FtsZ基因在其他腸桿菌科成員諸如沙門(mén)氏菌屬種(Salmonella spp.)和志 賀氏菌屬種(Shigella spp.)以及其他類(lèi)別的成員諸如假單胞菌屬種(Pseudomonas spp.) 中的超表達(dá)將導(dǎo)致相似水平的小細(xì)胞的產(chǎn)生。以上事實(shí)同樣可以在腸桿菌科的基于突變的產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株中得到證明。例如 任何腸桿菌科成員的min基因座的缺失都導(dǎo)致小細(xì)胞的產(chǎn)生。腸桿菌科的其中突變可以導(dǎo) 致小細(xì)胞形成的細(xì)胞分裂基因包括但不限于min基因(MinCDE)。盡管可以由min突變菌株 產(chǎn)生小細(xì)胞，但這些菌株作為產(chǎn)生菌株而言的商業(yè)價(jià)值有限。這是因?yàn)榫哂衜in基因中的 缺失或突變的菌株使得小細(xì)胞處于組成性低水平。這就會(huì)出現(xiàn)商業(yè)化和規(guī)模經(jīng)濟(jì)方面的兩 個(gè)問(wèn)題。第一個(gè)問(wèn)題是是來(lái)自這些菌株的小細(xì)胞產(chǎn)率低，這就增加了產(chǎn)生成本。第二個(gè)問(wèn) 題是突變菌株的小細(xì)胞產(chǎn)率是高度易變的，而且批次之間的差異性對(duì)與生產(chǎn)質(zhì)量控制和監(jiān) 管保證相關(guān)關(guān)的可變生產(chǎn)成本具有極大的影響。首先通過(guò)親代細(xì)胞使用突變菌株制備以產(chǎn) 生已封裝生物活性分子諸如蛋白、RNA、DNA和其他的代謝物用于遞送的小細(xì)胞，所以所產(chǎn)生 的封裝所述生物活性分子的小細(xì)胞是有問(wèn)題的。突變菌株中小細(xì)胞的產(chǎn)生的啟動(dòng)不能控制 而且發(fā)生率處于低水平，所以最終的結(jié)果是一些小細(xì)胞將不包含生物活性分子同時(shí)其他的 小細(xì)胞則包含高度可變數(shù)量的生物活性分子。這些缺點(diǎn)一起或單獨(dú)地大大地限制了使用這 些突變菌株產(chǎn)生商業(yè)上可用的產(chǎn)率和/或質(zhì)量的小細(xì)胞的可能性。超表達(dá)細(xì)胞分裂基因的產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株(“超表達(dá)體”)相對(duì)于基于突變的菌株 而言是優(yōu) 選的，因?yàn)楫?dāng)待被超表達(dá)的細(xì)胞分裂基因被置于誘導(dǎo)型或其他條件活性真細(xì)菌的 啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下時(shí)，這種產(chǎn)生小細(xì)胞的表型是可控的。利用基于質(zhì)粒的互補(bǔ)研究在鑒 定E. coli中的基本細(xì)胞分裂基因時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)超表達(dá)細(xì)胞分裂基因ftsZ的菌株能夠產(chǎn) 生小細(xì)胞。在這些研究中，ftsZ基因的存在量超過(guò)10拷貝/細(xì)胞。證明ftsZ的多基因拷 貝的存在可產(chǎn)生小細(xì)胞和非常長(zhǎng)的絲狀細(xì)胞。最終，這種向不可逆的絲狀表型的轉(zhuǎn)變消極 地影響了超表達(dá)來(lái)自多拷貝質(zhì)粒的ftsZ的菌株的小細(xì)胞的產(chǎn)量，但是所產(chǎn)生的小細(xì)胞的 數(shù)量仍然比任何突變菌株所產(chǎn)生的小細(xì)胞的數(shù)量高。目前已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)將ftsZ基因拷貝 的數(shù)量減少至單個(gè)(染色體雙倍)產(chǎn)生的小細(xì)胞的數(shù)量增加的量比f(wàn)tsZ位于多拷貝質(zhì)粒 上的那些菌株要高，而且絲狀表型的數(shù)量更少。因此，一些優(yōu)選的組合物是可被誘導(dǎo)而產(chǎn)生 小細(xì)胞的菌株，該菌株超表達(dá)來(lái)自ftsZ的雙倍染色體整合拷貝的ftsZ基因。所使用的雙倍 ftsZ基因可以直接來(lái)自其中產(chǎn)生小細(xì)胞表型經(jīng)過(guò)改造的細(xì)菌種類(lèi)，也可以來(lái)自其他細(xì)菌種 類(lèi)的ftsZ基因序列。作為非限制性實(shí)例，大腸埃希菌的ftsZ基因的超表達(dá)可以用于產(chǎn)生 來(lái)自大腸埃希菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的小細(xì)胞。所得到的菌株含有野生型的ftsZ基因和位 于染色體上的分離的雙倍誘導(dǎo)型ftsZ基因拷貝，以及下文中更詳細(xì)描述的誘導(dǎo)型基因自 殺機(jī)制。這種使用誘導(dǎo)型表型產(chǎn)生小細(xì)胞的方法比起突變系統(tǒng)來(lái)具有幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，因 為在這些菌株中沒(méi)有基因突變，所以正常生長(zhǎng)期間不存在選擇性壓力，而且培養(yǎng)細(xì)胞 在小細(xì)胞表型被誘導(dǎo)之前都保持非常穩(wěn)定和正常的生理機(jī)能。最終的結(jié)果是產(chǎn)生型小細(xì)胞 的誘導(dǎo)型菌株更健康且更穩(wěn)定，這最終導(dǎo)致了如圖3所示的較高的小細(xì)胞產(chǎn)量。另一個(gè)使 用誘導(dǎo)型表型產(chǎn)生小細(xì)胞的方法的獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)是如果小細(xì)胞被用于遞送產(chǎn)生小細(xì)胞的親 代細(xì)胞自身所能夠制備的諸如蛋白、RNA、DNA和其他的代謝物的生物活性分子，所產(chǎn)生的小 細(xì)胞能夠封裝那些生物活性分子。在上述情況下，一種優(yōu)選的方法是在誘導(dǎo)小細(xì)胞表型之 前先誘導(dǎo)親代細(xì)胞內(nèi)形成生物活性分子，這樣所有產(chǎn)生的小細(xì)胞都將包含足夠數(shù)量的所需 分子以便于封裝遞送。當(dāng)這些優(yōu)勢(shì)被組合使用時(shí)，可獲得更高質(zhì)量和數(shù)量的小細(xì)胞。作為 非限制性實(shí)例，可以在腸桿菌科中被超表達(dá)而產(chǎn)生小細(xì)胞的分裂基因包括但不限于FtsZ、 MinE、SUIA、CcdB和SfiC。優(yōu)選的組合物含有雙倍拷貝的細(xì)胞分裂基因，所述雙倍拷貝的細(xì) 胞分裂基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，并穩(wěn)定整合至給定的真細(xì)菌菌株的染色體中。 如果這種誘導(dǎo)型細(xì)胞分裂基因盒存在于質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、重組噬菌體或 存在于細(xì)胞中的其他的游離體DNA分子上，那么也可以進(jìn)行這一相同的策略。也可以使用 來(lái)自其他生物體的這些基因的或基因產(chǎn)物的類(lèi)似物。本文所述的新穎的誘導(dǎo)型MSM系統(tǒng)更進(jìn)一步地增加了誘導(dǎo)型小細(xì)胞菌株的小細(xì) 胞產(chǎn)量。MSM系統(tǒng)的激活與其他僅靠過(guò)多產(chǎn)生ftsZ而促進(jìn)小細(xì)胞形成的菌株相比，小細(xì)胞 產(chǎn)量增加了 10倍以上(實(shí)施例3)。將MSM系統(tǒng)與在MinCDE中含有突變或缺失的產(chǎn)生小細(xì) 胞的菌株組合起來(lái)是可能的。一種優(yōu)選的實(shí)施方案是使用MSM系統(tǒng)控制產(chǎn)生小細(xì)胞的誘導(dǎo) 型表型，增加小細(xì)胞的產(chǎn)率，導(dǎo)致不可修復(fù)的細(xì)胞損傷和促進(jìn)親代細(xì)胞群中的絲狀表型。一 種優(yōu)選的MSM基因組合含有超表達(dá)ftsZ或任何其功能性類(lèi)似物的產(chǎn)生小細(xì)胞的誘導(dǎo)型菌 株和歸巢核酸內(nèi)切酶的誘導(dǎo)型表達(dá)，如下文更詳細(xì)描述的，所述歸巢核酸內(nèi)切酶優(yōu)選地為 來(lái)源于藻類(lèi) Chlamydomonas moewusii 的 I-CeuI 基因。能夠產(chǎn)生小細(xì)胞并可由誘導(dǎo)型MSM系統(tǒng)的激活導(dǎo)致親代細(xì)胞自殺/絲狀表型不限 于腸桿菌科，而是可以在包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性來(lái)源的任何桿狀細(xì)菌中產(chǎn)生。例如， 已詳細(xì)地研究了枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌科的其他成員的產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株。與腸桿菌科 的產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株類(lèi)似，所有芽孢桿菌科的產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株都是參與細(xì)胞分裂或染色 體分離過(guò)程的基因的突變或超表達(dá)的結(jié)果。因此，存在足夠的證據(jù)支持這一構(gòu)想對(duì)參與 任何桿狀細(xì)菌科或?qū)俚募?xì)胞分裂或染色體分離過(guò)程的保守基因的操作，也可以用于在同一 科或?qū)俚纳矬w的其他成員中制備能夠產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株。同樣地，如下表1所證明的那 樣，用于產(chǎn)生MSM系統(tǒng)的基因類(lèi)別可以識(shí)別并破壞許多不同桿狀革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌種類(lèi)的染色體。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以用于通過(guò)在生物體發(fā)育的某些階段啟動(dòng)或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄而調(diào) 節(jié)基因表達(dá)。這些啟動(dòng)子的活性可以被生物或非生物因素的存在或不存在所誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子和物理調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子?；瘜W(xué)調(diào) 節(jié)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性包括啟動(dòng)子可以受一種或多種化合物的存在或不存在調(diào)節(jié)。所 述化合物包括但不限于小分子、核酸、多肽和蛋白。所述化合物的非限制性實(shí)例有異丙 基-β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖、四環(huán)素、 乙醇、類(lèi)固醇、金屬和其他化合物。物理調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括其轉(zhuǎn)錄活性受一種或多種物理因素的存在或不存在調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，所述物理因素諸如水壓力或鹽壓力、照明、光亮或黑暗、 輻射、低溫或高溫、氧氣和氮?dú)狻?2.小細(xì)胞與親代細(xì)胞的分離和小細(xì)胞的純化因?yàn)樾〖?xì)胞來(lái)自通常是固有致病的或條件致病的細(xì)菌，在給藥前從給定群體中功 能性地除去任何污染性親代細(xì)胞是有利的。常規(guī)地通過(guò)物理方法或者生物學(xué)方法除去活的 親代細(xì)胞。物理方法包括使用基于離心作用的分離方法、過(guò)濾方法、色譜方法、密度梯度、免 疫親和性、免疫沉淀反應(yīng)或其任何組合。上述方法盡管有效，但每一種都也有缺點(diǎn)，并沒(méi)有 一種物理分離方法可以完全適于從小細(xì)胞中除去可存活的親代細(xì)胞。最終，對(duì)于商業(yè)生產(chǎn) 而言，由于過(guò)濾方法或其組合的簡(jiǎn)易性、實(shí)用性、低成本和規(guī)?？煽匦?，使過(guò)濾方法或其組 合成為最優(yōu)選的技術(shù)。然而，當(dāng)前的過(guò)濾方案是受到限制的，因?yàn)樵S多污染性親代細(xì)胞會(huì)穿 過(guò)過(guò)濾器，而當(dāng)盡力避免這一問(wèn)題時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致最終的小細(xì)胞產(chǎn)量的減少。最終，通過(guò)設(shè)計(jì) 和使用影響親代細(xì)胞大小和存活力的生物因素，并與常規(guī)過(guò)濾方法相結(jié)合，將能夠?qū)崿F(xiàn)除 去活細(xì)胞的最佳效果。如下文所示，本文公開(kāi)的MSM系統(tǒng)使得可以誘導(dǎo)性地發(fā)育出細(xì)長(zhǎng)絲 狀的親代細(xì)胞，這種細(xì)長(zhǎng)絲狀的親代細(xì)胞在生產(chǎn)期間更容易與小細(xì)胞相分離。生物性除去可以通過(guò)包括但不限于下列的手段而實(shí)現(xiàn)親代細(xì)胞的優(yōu)先裂解、營(yíng) 養(yǎng)缺陷型親代菌株的使用、抗生素處理、紫外輻射(UV輻射)處理、二氨基庚二酸(DAP)的 耗盡、親代細(xì)胞的選擇性吸附和使用其他DNA損傷劑的處理。通常通過(guò)誘導(dǎo)溶原性原噬菌體(lysogenic prophage)的裂解周期來(lái)介導(dǎo)親代細(xì) 胞的優(yōu)先裂解。就產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株而言，最有用的是使用有裂解能力但在再感染能力上 有缺陷的原噬菌體，從而使得溶解表型激活期間小細(xì)胞不會(huì)隨后被感染和裂解?；蛘咦鳛?非限制性實(shí)例，可以表達(dá)諸如那些被分類(lèi)為holin基因家族成員的單獨(dú)的基因，以實(shí)現(xiàn)相 似水平的裂解而不需擔(dān)心使用溶原性原噬菌體所固有的再感染。這兩種方法都受限于下述 事實(shí)裂解事件，不管使用哪種方法實(shí)現(xiàn)，都會(huì)將不可接受數(shù)量的游離內(nèi)毒素驅(qū)除進(jìn)入到介 質(zhì)中。清除如此大量的游離內(nèi)毒素既耗費(fèi)時(shí)間，又會(huì)受批次之間的變異性的影響并且最終 成本高昂。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的使用會(huì)導(dǎo)致有關(guān)回復(fù)的問(wèn)題，而且因此它只能用于由共生的或 非致病性細(xì)菌菌株產(chǎn)生小細(xì)胞的情況。因此，對(duì)于被用作除去小細(xì)胞產(chǎn)生中的活親代細(xì)胞 的方法而言，它們的應(yīng)用是受限的。用抗生素處理小細(xì)胞制劑會(huì)導(dǎo)致發(fā)展出對(duì)抗生素的抗性的問(wèn)題，尤其當(dāng)從致病的 或條件致病的親代菌株中制備小細(xì)胞時(shí)這一問(wèn)題更為重要。當(dāng)使用抗生素在給定的小細(xì)胞 產(chǎn)生過(guò)程中除去親代細(xì)胞時(shí)，有關(guān)監(jiān)管和費(fèi)用的問(wèn)題也是值得重視的。UV輻射的處理可以用于在產(chǎn)生小細(xì)胞的過(guò)程中除去活的親代細(xì)胞，但是UV輻射 是隨機(jī)的，而且結(jié)果在批次之間是高度可變的。另外，當(dāng)使用小細(xì)胞遞送治療的或預(yù)防的核 酸時(shí)，這種方法不是優(yōu)選的，因?yàn)閁V輻射是不加區(qū)分地隨機(jī)損傷核酸。例如，質(zhì)粒DNA也非 常容易受UV輻射的影響而造成DNA損傷，這樣一來(lái)即使它被有效地遞送，也仍然沒(méi)有治療 或預(yù)防效果。DAP耗盡可以用于除去活的親代細(xì)胞，但是這種方法受限于它能夠應(yīng)用物種的數(shù) 量。換句話說(shuō)，并不是所有能夠產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞種類(lèi)都需要依賴(lài)DAP而存活，而對(duì)于不依賴(lài)DAP存活的物種使用這種方法就沒(méi)有意義。DAP依賴(lài)性菌株的回復(fù)突變也是這種方 法的一個(gè)問(wèn)題。對(duì)于從活的親代細(xì)胞中純化小細(xì)胞而言，還必須利用選擇性吸附的方法。選擇性吸附被定義為憑借親代細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的親和力而使親代細(xì)胞被優(yōu)先地吸附到基質(zhì)的任何過(guò) 程。作為非限制性實(shí)例，高親和力的蛋白-蛋白相互作用可被用于這一用途。作為非限制 性實(shí)例，來(lái)自革蘭氏陰性種類(lèi)假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的外膜 蛋白侵襲素對(duì)嵌入到整合素的蛋白序列中的RGD基元具有高親和力。可以容易地在產(chǎn) 生小細(xì)胞的菌株中引入受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的編碼侵襲素的基因。可以在侵襲素基因表達(dá) 激活前從這一菌株中產(chǎn)生小細(xì)胞，從而使得所產(chǎn)生的小細(xì)胞不在它們的細(xì)胞表面表達(dá)或展 現(xiàn)侵襲素。當(dāng)從所述菌株中產(chǎn)生所需數(shù)量的小細(xì)胞后，就可以給予培養(yǎng)中的活細(xì)胞信號(hào)以 產(chǎn)生侵襲素蛋白，從而使得所述侵襲素只被表達(dá)或展現(xiàn)在活細(xì)胞上。當(dāng)所述侵襲素在可存 活的親代細(xì)胞的表面被表達(dá)后，親代細(xì)胞就可以容易地被吸附至包被有β “整合素或RGD 基元的基質(zhì)上，所述RGD基元嵌入到合成多肽或其他的重組蛋白中。在被吸附后，就可以根 據(jù)所使用的基質(zhì)類(lèi)型，通過(guò)許多不同的方法選擇性地從可存活的親代細(xì)胞中純化走所述小 細(xì)胞。所述基質(zhì)包括但不限于用于重力過(guò)濾應(yīng)用的固相色譜柱、磁珠、離子交換柱或高壓液 相色譜(HPLC)柱。這種方法受限于這一缺點(diǎn)沒(méi)有一種蛋白_蛋白相互作用能夠有效地用 于所有產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞的種類(lèi)。例如，上文所述的侵襲素-整合素方法可以用于大 多數(shù)的革蘭氏陰性腸桿菌科成員，但不能用于產(chǎn)生小細(xì)胞的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌科成員。以上所提及的產(chǎn)生小細(xì)胞的親代菌株的絲狀表型的使用，在輔助常規(guī)的、基于大 小的物理分離技術(shù)諸如過(guò)濾方面表現(xiàn)出一個(gè)非常獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼉?yōu)先地將污染性活細(xì) 胞的大小從約1 μ M的長(zhǎng)度增加至約10-15 μ M的長(zhǎng)度。然而小細(xì)胞仍保持它們約400ηΜ的 典型大小。小細(xì)胞和絲狀親代細(xì)胞間增加的大小差異極大地簡(jiǎn)化了過(guò)濾方案，并使其可以 作為除去可存活的親代細(xì)胞的優(yōu)選方法。通過(guò)幾種方法可以在桿狀真細(xì)菌中誘導(dǎo)絲狀形 成，所述幾種方法中，最常見(jiàn)的方法包括通過(guò)以下手段給予細(xì)胞生理應(yīng)激加入高濃度的鹽 或通過(guò)增加或減少培養(yǎng)物的ΡΗ，細(xì)胞分裂基因(諸如上文所述的fts基因)的超表達(dá)和SOS 反應(yīng)的誘導(dǎo)。細(xì)菌中SOS應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)通常通過(guò)引入重要染色體損傷來(lái)誘導(dǎo)，但是已證 明其他的機(jī)制也可以起作用。但對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物施加生理應(yīng)激以誘導(dǎo)絲狀形成的問(wèn)題是，并 不是細(xì)胞群中所有的細(xì)胞都平等地響應(yīng)這種應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞大小差異很大，有的親代 細(xì)胞完全不受影響，有的細(xì)胞部分地絲狀形成，還有的細(xì)胞徹底地絲狀形成。這種群體中不 平等的反應(yīng)限制了這種方法在純化過(guò)程中的可重復(fù)性。這種現(xiàn)象在通過(guò)外源性DNA損傷劑 的添加誘導(dǎo)SOS反應(yīng)中同樣存在，因?yàn)椴⒉皇羌?xì)胞群中所有的細(xì)胞都平等地響應(yīng)所述損傷 劑并產(chǎn)生細(xì)絲?？紤]到上文所列舉的所有生物學(xué)方法的局限性，為改進(jìn)用于體內(nèi)應(yīng)用的小細(xì)胞的 安全特性，還是亟需研發(fā)普遍可靠且有效的方法來(lái)除去可存活的產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞。 為此，本發(fā)明的實(shí)施方案滿(mǎn)足了這一需求并提供方法，所述方法通過(guò)利用現(xiàn)有技術(shù)中未記 載的可調(diào)型基因自殺機(jī)制，能夠不可修復(fù)地?fù)p傷可存活的產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞的染色 體。所述基因自殺機(jī)制的激活同時(shí)且不可逆地殺死細(xì)胞同時(shí)誘導(dǎo)絲狀表型，該絲狀表型用 于輔助常規(guī)的，基于過(guò)濾技術(shù)，將可存活的污染性親代細(xì)胞與小細(xì)胞分離。一種優(yōu)選且新穎的方法能夠確保群體中所有的可存活的產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞都一致地變?yōu)榻z狀，所述方法通過(guò)基因工程的手段將處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的一個(gè)基 因或一組基因引入到產(chǎn)生小細(xì)胞的菌株的染色體上，一旦使用誘導(dǎo)物進(jìn)行激活，所述一個(gè) 或一組基因就會(huì)引起如本文所述的MSM系統(tǒng)所實(shí)現(xiàn)的絲狀形成(實(shí)施例4)?？梢源_定的是， 本文所述的基因自殺(MSM)機(jī)制的激活引起廣泛而深度的絲狀形成(實(shí)施例4)。因此，通過(guò) 確保任何可存活的細(xì)胞(具有染色體的細(xì)胞)都將在人為控制下變成絲狀，本發(fā)明的實(shí)施 方案克服了其他方法所表現(xiàn)出的絲狀形成一致性的問(wèn)題。理想的是，為了確保在給予適當(dāng) 信號(hào)時(shí)給定群體中的所有細(xì)胞都進(jìn)入自殺程序，應(yīng)避免與誘導(dǎo)物攝取和其他影響啟動(dòng)子活 性的生理學(xué)因素有關(guān)的自殺機(jī)制表達(dá)的問(wèn)題。為避免啟動(dòng)子活性不足并確保群體中的每個(gè) 細(xì)胞都能變成絲狀，一種優(yōu)選地用于激活基因自殺機(jī)制的啟動(dòng)子系統(tǒng)是溫度調(diào)節(jié)的，例如 CI857ts啟動(dòng)子系統(tǒng)。一些實(shí)施方案包含革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株，所述細(xì)菌菌株 含有以下核酸一種核酸包含與誘導(dǎo)型原核表達(dá)信號(hào)可操作地連接的針對(duì)產(chǎn)生小細(xì)胞的基 因編碼的基因(優(yōu)選ftsZ)，另一種核酸包含與誘導(dǎo)型原核表達(dá)信號(hào)(優(yōu)選CI857ts)可操 作地連接的針對(duì)不裂解親代細(xì)胞的自殺基因編碼的基因(優(yōu)選歸巢核酸內(nèi)切酶I-CeuI)。 與產(chǎn)生小細(xì)胞的基因和自殺基因相連接的原核表達(dá)信號(hào)可以處于相同的原核表達(dá)信號(hào)或 不同的原核表達(dá)信號(hào)的控制下。而且，產(chǎn)生小細(xì)胞的基因和自殺基因可以位于細(xì)胞中相同 的或不同的核酸上，該核酸的其中一個(gè)可以是游離的核酸(例如質(zhì)粒)。在一些其他的實(shí)施 方案中，產(chǎn)生小細(xì)胞的基因和自殺基因被可操作地連接在轉(zhuǎn)錄融合物中(即在相同的mRNA 轉(zhuǎn)錄物上)，而且處于共同的誘導(dǎo)型原核表達(dá)信號(hào)的控制之下。產(chǎn)生小細(xì)胞的基因和自殺基 因都可位于每細(xì)胞多于一個(gè)的基因拷貝中。在一些實(shí)施方案中，在包含小細(xì)胞的組合物中，基本將小細(xì)胞和產(chǎn)生小細(xì)胞的親 代細(xì)胞分離。分離后，少于約 99. 9%、99. 5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、 92%,91 %,90%,89%,88%,87%,86%,85%,84%,83%,82%,81 %,80%,79%,78%, 77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35% 或 30%的包含小細(xì)胞的組合物不含有產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞。3.誘導(dǎo)不可修復(fù)的染餼體損傷的方法已通過(guò)UV輻射的使用最佳地闡明了如下概念給定細(xì)胞的不可修復(fù)的大量染色 體損傷將導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞死亡。UV輻射引起給定的DNA分子中鄰近的胸腺嘧啶核苷酸間 的胸腺嘧啶二聚體的形成。如果胸腺嘧啶二聚體的數(shù)量達(dá)到某一閾值，而其中又沒(méi)有足夠 數(shù)量的蛋白參與這些加合物的DNA修復(fù)，細(xì)胞就會(huì)有效地死亡。然而，如上文所提及的，因 為這種方法對(duì)于染色體中加合物形成的位點(diǎn)之間缺乏特異性，對(duì)所有核酸類(lèi)型都不加區(qū)分 地影響，以及不依賴(lài)暴露時(shí)間的差異性，所以這種方法是嚴(yán)重受限的。不可修復(fù)的染色體損傷也可以通過(guò)核酸內(nèi)切酶的超表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。核酸內(nèi)切酶可以 在序列特異的切割位點(diǎn)處切割雙鏈DNA。根據(jù)所使用的限制酶，切割可以產(chǎn)生平端或粘端的 切割產(chǎn)物。4. Chlamydomonas moewusii 的 I-CeuI 基因 Chlamydomonas moewusii 的葉綠體 DNA(SEQ ID NO :1)所編碼的 I-CeuI 限制酶 特別可用于在許多種產(chǎn)生小細(xì)胞的真細(xì)菌的親代菌株的染色體中引入不可修復(fù)的損傷。所 述的I-CeuI屬于內(nèi)含子編碼的I型限制酶的獨(dú)特家族，這一家族通常被稱(chēng)為歸巢核酸內(nèi)切 酶。I-CeuI歸巢限制酶23S核糖體RNA (rRNA)的rrn操縱子位點(diǎn)(SEQ ID NO 2)的15-19堿基對(duì)保守序列內(nèi)特異地切割。因?yàn)?3S rRNA序列在真細(xì)菌中十分保守，所以I-CeuI可 以用于在許多種產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞種類(lèi)中引入不可修復(fù)的染色體損傷。在大多數(shù)真細(xì) 菌中，23S rRNA位點(diǎn)位于4-10個(gè)不同位置中的任何位置(見(jiàn)表1)，這一系列位點(diǎn)均可支持 不可修復(fù)的損傷。通常，常見(jiàn)的質(zhì)粒DNA分子序列內(nèi)沒(méi)有23S rRNA位點(diǎn)，因此I-CeuI可以 用于在消除親代細(xì)胞的同時(shí)仍使得質(zhì)粒能夠增殖和分離到小細(xì)胞中，使其能夠作為治療的 或預(yù)防的有效載荷而被遞送。而且，I-CeuI歸巢核酸內(nèi)切酶在42-47°C時(shí)操作最有效，因 此使得它專(zhuān)一地適合于使用溫度調(diào)節(jié)啟動(dòng)子系統(tǒng)，諸如來(lái)自噬菌體λ的CI857ts啟動(dòng)子系 統(tǒng)。在溫度39°C以下時(shí)，所述CI857ts啟動(dòng)子系統(tǒng)是失活的，當(dāng)溫度變化為42_45°C時(shí)，該 系統(tǒng)會(huì)具有極高的活性，這使得培養(yǎng)物中的每個(gè)產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞都快速、持久且一 致地暴露于I-Ceul。這一啟動(dòng)子系統(tǒng)的激活很大程度上與許多抑制的生理學(xué)因素諸如誘導(dǎo) 物攝取無(wú)關(guān)。表1.不同的真細(xì)菌基因組內(nèi)I-CeuI識(shí)別位點(diǎn)的列表
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，所述細(xì)菌包含編碼產(chǎn)生小細(xì)胞的基因產(chǎn)物的可表達(dá)的基因，所述基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)隔膜形成、二分裂和 染色體分離中的一種或多種；和編碼核酸內(nèi)切酶的可表達(dá)的基因，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌的染色體包含一個(gè)或多個(gè)所述核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因。
4.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的基因?yàn)榧?xì)胞分裂基因。
5.如權(quán)利要求4所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述細(xì)胞分裂基因選自ftsZ、sulA、 ccdB 和 SfiC0
6.如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述細(xì)胞分裂基因?yàn)閒tsZ。
7.如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述ftsZ包含SEQID NO :3的核酸 序列。
8.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子的控制下被表達(dá)。
9.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述啟動(dòng)子為溫度敏感啟動(dòng)子。
10.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述啟動(dòng)子可被一種或多種化學(xué)化 合物的存在誘導(dǎo)。
11.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶基因位于所述產(chǎn)生 小細(xì)胞的細(xì)菌的染色體上。
12.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶為歸巢核酸內(nèi)切酶。
13.如權(quán)利要求12所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶選自I-Ceul、 PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 和 PUcpI。
14.如權(quán)利要求13所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶為I-Ceul。
15.如權(quán)利要求14所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述I-CeuI包含SEQID NO 4的 氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述核酸內(nèi)切酶在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的 控制下被表達(dá)。
17.如權(quán)利要求16所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述啟動(dòng)子為溫度敏感啟動(dòng)子。
18.如權(quán)利要求16所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述啟動(dòng)子可被一種或多種化學(xué)化 合物的存在誘導(dǎo)。
19.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌為革蘭氏陰 性細(xì)菌。
20.如權(quán)利要求19所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述革蘭氏陰性細(xì)菌選自空 JS^ffi ^ (Campylobacter jejuni) > ILff ^Mft (Lactobacillus spp. ) >K 菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜月市軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、沙門(mén)氏菌屬 種(Salmonella spp·)、志賀氏菌屬種(Shigella spp·)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)禾口大 1 ;^ (Escherichia coli)。
21.如權(quán)利要求19所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，所述細(xì)菌包含編碼參與脂多糖合成的基 因產(chǎn)物的基因，其中所述基因與相應(yīng)的野生型基因相比經(jīng)過(guò)遺傳修飾。
22.如權(quán)利要求21所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述基因?yàn)榫幋a基因產(chǎn)物的msbB基 因，與相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的脂質(zhì)A分子相比，所述基因產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生改變的脂質(zhì)A分 子。
23.如權(quán)利要求22所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中與相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的脂質(zhì)A分 子相比，所述改變的脂質(zhì)A分子對(duì)于肉豆蔻酸添加至所述脂多糖分子的脂質(zhì)A部分而言是 有缺陷的。
24.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌。
25.如權(quán)利要求M所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，其中所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌選自葡萄 球菌屬禾中(Staphylococcus spp·)、鏈球菌屬禾中(Streptococcus spp·)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)禾口賭樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)。
26.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌，所述細(xì)菌包含參與同源重組的基因，其中 所述基因與相應(yīng)的野生型基因相比經(jīng)過(guò)遺傳修飾，其中所述產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌在DNA損傷 修復(fù)中是有缺陷的。
27.制備小細(xì)胞的方法，所述方法包括 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌；和基本上將小細(xì)胞與所述產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞分離，由此產(chǎn)生包含小細(xì)胞的組合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，所述方法還包括由所述產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞誘導(dǎo)小 細(xì)胞形成。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，所述方法還包括誘導(dǎo)編碼所述核酸內(nèi)切酶的基因的表達(dá)。
30.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中通過(guò)選自異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四環(huán)素的一種或多種化學(xué)化合物的存在， 誘導(dǎo)小細(xì)胞形成。
31.如權(quán)利要求四所述的方法，其中通過(guò)溫度的變化誘導(dǎo)所述編碼核酸內(nèi)切酶的基因 的表達(dá)。
32.如權(quán)利要求四所述的方法，所述方法還包括從所述組合物中純化所述小細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中通過(guò)選自離心、超速離心、密度梯度、免疫親和性 和免疫沉淀的方法將所述小細(xì)胞與所述親代細(xì)胞基本分離。
34.制備小細(xì)胞的方法，所述方法包括 培養(yǎng)權(quán)利要求21所述的產(chǎn)生小細(xì)胞的細(xì)菌；和基本上將所述小細(xì)胞與所述產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞分離，由此產(chǎn)生包含小細(xì)胞的組合物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，所述方法還包括由所述產(chǎn)生小細(xì)胞的親代細(xì)胞誘導(dǎo)小 細(xì)胞形成。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，所述方法還包括誘導(dǎo)編碼所述核酸內(nèi)切酶的基因的表達(dá)。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中通過(guò)選自異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四環(huán)素的一種或多種化學(xué)化合物的存在， 誘導(dǎo)小細(xì)胞形成。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中通過(guò)溫度的變化誘導(dǎo)所述編碼核酸內(nèi)切酶的基因 的表達(dá)。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，所述方法還包括從所述組合物中純化所述小細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其中通過(guò)選自離心、超速離心、密度梯度、免疫親和性 和免疫沉淀的方法將所述小細(xì)胞與所述親代細(xì)胞基本分離。
41.包含外膜的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述外膜包含沒(méi)有肉豆蔻酸部分的脂質(zhì)A分子。
42.如權(quán)利要求41所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述外膜的組成與來(lái)自相應(yīng)的野生型細(xì) 菌的真細(xì)菌小細(xì)胞的外膜相比，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物宿主中促炎癥免疫反應(yīng)的減少。
43.如權(quán)利要求41所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，所述真細(xì)菌小細(xì)胞還包含一種或多種生物活 性化合物。
44.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物選自放射 性同位素、多肽、核酸和小分子。
45.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為小分子 藥物。
46.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為小分子 成像劑。
47.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為化學(xué)治 療劑。
48.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為核酸。
49.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為多肽。
50.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為前體藥 物轉(zhuǎn)化酶。
51.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為核酸和 小分子的組合。
52.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為小分子 成像劑和小分子藥物的組合。
53.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為小分子 藥物、小分子成像劑和核酸的組合。
54.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中至少一種所述生物活性化合物為核酸和 多肽的組合。
55.如權(quán)利要求43所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，所述真細(xì)菌小細(xì)胞還包含細(xì)胞表面定位的靶 向部分。
56.如權(quán)利要求55所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表面定位的靶向部分為融合蛋 白，其中所述融合蛋白為真細(xì)菌的外膜錨定結(jié)構(gòu)域和抗體片段的融合物。
57.如權(quán)利要求56所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表面定位的靶向部分為融合蛋白，其中所述融合蛋白為淋病奈瑟氏菌IgAP和識(shí)別哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面抗原的抗體片段 的融合物。
58.如權(quán)利要求57所述的真細(xì)菌小細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面抗原選 自脂肪分化相關(guān)蛋白、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、細(xì)胞周期蛋白DU DKKU ENAH、 Ep-CAM (上皮細(xì)胞粘附分子)、EphA3、FGF5 (纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子5)、G250/MN/CAIX、HER_2/ neu、IL-13Ra 2、腸羧基酯酶、甲胎蛋白、M_CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、MCSP、mdm_2、 MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)、MUC-l、p53、PBF、PRAME、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、RAGE-l、 RGS5(G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白5)、RNF43(環(huán)指蛋白43)、RU2AS、分離蛋白1、S0X10、STEAPl、生存 素、端粒酶、WTl (腎母細(xì)胞瘤l)、Cdc27、⑶K4(細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4)、⑶細(xì)胞 周期蛋白依賴(lài)性激酶 2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE 1-8、GnTV、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、 LAGE-I、MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白、NA-88、 NY-ES0-1、LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-166 和 TRP2-INT2。
59.由權(quán)利要求34所述的方法產(chǎn)生的真細(xì)菌小細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及可調(diào)型基因自殺機(jī)制在用于在改進(jìn)的生物學(xué)純化中引入和用途，包括在各種真細(xì)菌小細(xì)胞的產(chǎn)生和純化方法中的輔助用途。本文描述了具有遺傳修飾的包含可調(diào)型基因自殺機(jī)制的高產(chǎn)量的產(chǎn)生小細(xì)胞的真細(xì)菌菌株，所述基因自殺機(jī)制不可修復(fù)地破壞親代細(xì)胞的染色體，從而使得可以在小細(xì)胞產(chǎn)生和純化過(guò)程的運(yùn)行期間，在任何時(shí)間，功能性地消除培養(yǎng)中的活親代細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還描述了用于在其他基于細(xì)胞的生物學(xué)產(chǎn)生期間消除活親代細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102131927SQ200980133155
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者斯坦利·馬洛伊, 辻晉吾, 馬修·J·賈卡洛內(nèi) 申請(qǐng)人:瓦克星治療有限公司