專利名稱：抗病毒療法應(yīng)答的預(yù)測(cè)的制作方法
抗病毒療法應(yīng)答的預(yù)測(cè)本發(fā)明涉及改善抗病毒療法的處理并涉及用于確定抗病毒療法是否將有效的方法。病毒性感染代表對(duì)健康的嚴(yán)重威脅并且已知是動(dòng)物和人發(fā)病率的一個(gè)主要原因。 例如，丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界范圍慢性肝臟疾病的主要原因。丙型肝炎的一個(gè)重要且顯著的特征是其慢性傾向。在超過(guò)70%的感染個(gè)體中，HCV建立超過(guò)數(shù)十年的可能導(dǎo)致硬化和肝細(xì)胞癌的持續(xù)感染。HCV生物學(xué)中的一個(gè)有趣假設(shè)提出病毒的NS3-4A蛋白酶不僅加工病毒蛋白，還切割并失活探測(cè)病毒性感染和誘導(dǎo)I型干擾素(IFN)轉(zhuǎn)錄性激活的胞內(nèi)傳感途徑的組分。 NS3-4A的靶標(biāo)之一是TRIF (誘導(dǎo)IFN β的含有IlR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白)，它是一種在內(nèi)體中 TLR3 (Toll樣受體幻檢測(cè)dsDNA與IFNii誘導(dǎo)之間的重要紐帶。最近，視黃酸可誘導(dǎo)的基因-I(RIG-I)和MDA5(heliCard)被鑒定為dsRNA的胞內(nèi)傳感基因。這兩種傳感基因通過(guò) Cardif (也稱作 IPS-I、MAVS、VISA)發(fā)信號(hào)以誘導(dǎo) IFNβ 產(chǎn)生。Cardif 可以被 HCV NS3-4A 切割并失活。被鑒定為dsRNA胞內(nèi)傳感蛋白的兩種RNA解旋酶RIG-I和MDA5通過(guò)Cardif 發(fā)揮作用以誘導(dǎo)IFNii產(chǎn)生。I型IFN不僅是先天免疫系統(tǒng)的重要組分，也是當(dāng)前抗CHC療法的最重要組分。當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)療法由每周一次皮下注射聚乙二醇化IFNa (pegIFNa)和每日攝入口服抗病毒藥利巴韋林組成。該方案在約55%患者中實(shí)現(xiàn)整體的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，該應(yīng)答在基因型之間存在顯著差異。SVR定義為治療期間喪失可檢測(cè)的HCV RNA并且在停止治療后繼續(xù)不存在至少6個(gè)月。對(duì)實(shí)現(xiàn)SVR的患者的幾項(xiàng)長(zhǎng)期隨訪研究表明這種應(yīng)答在超過(guò)95%的患者中是持久的。SVR的可能性強(qiáng)烈依賴于早期治療應(yīng)答。不顯示早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)的患者很可能不出現(xiàn)SVR并且可以在這些患者中停止治療，其中所述的早期病毒學(xué)應(yīng)答定義為治療12周后病毒載量降低至少2 Iog100另一方面，具有EVR的患者具有治愈的良好機(jī)會(huì)，65%的這些患者實(shí)現(xiàn)SVR。具有快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)的患者的預(yù)后甚至更好，其中所述的快速病毒學(xué)應(yīng)答定義為治療4周后檢測(cè)不到血清HCV RNA。超過(guò)85%的這些患者會(huì)實(shí)現(xiàn)SVR。不幸地是，少于20%的具有基因型1的患者和約60%的具有基因型2或3的患者顯示RVR。對(duì)早期治療應(yīng)答重要的宿主因素目前是未知的。I型IFN通過(guò)調(diào)節(jié)數(shù)百種基因(ISG，干擾素刺激的基因)實(shí)現(xiàn)其強(qiáng)烈的抗病毒作用。ISG的轉(zhuǎn)錄性激活誘導(dǎo)出通常在靜息細(xì)胞中不合成并且在細(xì)胞內(nèi)建立非病毒特異性抗病毒狀態(tài)的蛋白質(zhì)。干擾素通過(guò)激活Jak-STAT途徑(一種被許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子使用的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)范例)誘導(dǎo)這些蛋白質(zhì)合成。所有I型IFN結(jié)合至相同的細(xì)胞表面受體(IFNAR)并激活受體相關(guān)的Janus激酶家族成員Jakl和Tyk2。所述激酶隨后磷酸化并激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物I(STATl)和STAT2。激活的STAT轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，在那里它們結(jié)合ISG啟動(dòng)子中的特異性DNA元件。眾多的ISG具有抗病毒活性，不過(guò)其他ISG參與脂類代謝、凋亡、蛋白質(zhì)降解和炎性細(xì)胞反應(yīng)。如同多種病毒那樣，HCV干擾IFN系統(tǒng)，可能在多個(gè)水平上干擾。IFN誘導(dǎo)的Jak-STAT信號(hào)傳導(dǎo)在表達(dá)HCV蛋白的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中以及CHC患者的肝臟活組織檢查中被抑制。在體外，HCV蛋白NS5A和E2結(jié)合并失活一種重要的非特異性抗病毒蛋白即蛋白激酶RO3KR)。但是，目前未知對(duì)應(yīng)答于CHC患者中治療性施用的IFN而言重要的分子機(jī)制。(Sarasin-Filipowicz等人，2008，PNAS，105(19) 7034-7039)。HCV在多個(gè)不同水平上干擾IFN途徑的能力是決定HCV成功建立慢性感染的可能機(jī)制(Gale，M.，Jr. ^P Foy, Ε. Μ.，Nature 436，939-945 Q005))。但是，極為矛盾的是，在 HCV 急性或慢性感染的黑猩猩中，數(shù)百種ISG在肝臟中被誘導(dǎo)(7 Bigger, C. B.等人，J Virol 78,13779-13792(2004)).但是，盡管激活了內(nèi)源性IFN系統(tǒng)，然而病毒未從慢性感染動(dòng)物中清除。用黑猩猩獲得的結(jié)果難以外推至人，因?yàn)镠CV感染的病理生物學(xué)在這些物種之間存在一些重大差異。大部分急性感染HCV的黑猩猩自發(fā)清除病毒，而人類中的感染大多變成慢性。另一方面，幾乎很少能夠用IFN治愈慢性感染的黑猩猩，而成功地治療了超過(guò)半數(shù)的CHC患者。ISG的誘導(dǎo)也存在于許多CHC患者的治療前肝臟活組織檢查中，這再次表明HCV感染可能導(dǎo)致內(nèi)源性IFN系統(tǒng)激活(Chen，L.等人，Gastroenterology 128， 1437-1444(2005))。值得注意的是，與具有低初始ISG表達(dá)的患者相比較時(shí)，具有預(yù)先升高的ISG表達(dá)的患者傾向于不良地應(yīng)答于療法(Chen, L.等人，Gastroenterology 128， 1437-1444(2005))。不了解這種差異性治療應(yīng)答的原因。本發(fā)明基于這樣的研究，其中本發(fā)明人研究了用pegIFNa治療之前和治療期間的慢性肝炎患者的肝臟活組織檢查和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的成對(duì)樣品中IFN誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和ISG誘導(dǎo)。本發(fā)明人還將生物化學(xué)數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)與治療應(yīng)答關(guān)聯(lián)。他們的工作在后附實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。在之前的研究中，本發(fā)明人確定了患有肝臟病毒性感染的一些受試者處于“預(yù)激活”狀態(tài)，從而IFN信號(hào)傳導(dǎo)途徑處于用激活的ISG刺激的狀態(tài)(Sarasin-Filipowicz等人，2008，PNAS, 105 (19) =7034-7039)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類個(gè)體隨后用IFN和抗病毒藥治療時(shí)具有不良的抗病毒治療應(yīng)答或無(wú)抗病毒治療應(yīng)答。相反，另一組感染的受試者沒(méi)有預(yù)先的IFN受體刺激作用(并且沒(méi)有ISG刺激作用)并且該組受試者良好地應(yīng)答于抗病毒療法(即他們具有快速的病毒學(xué)應(yīng)答(RVR))。另外，可能根據(jù)眾多特定基因的表達(dá)水平確定受試者是否是治療的不良應(yīng)答者或具有RVR，其中所述的特定基因中某些是ISG基因。換句話說(shuō)，本發(fā)明人鑒定了作為預(yù)后遺傳標(biāo)記的一組基因，其中所述基因的表達(dá)水平預(yù)測(cè)受試者是否將應(yīng)答抗病毒治療。在使用pegIFNd治療之前和治療期間慢性肝炎患者的肝臟活組織檢查和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的成對(duì)樣品的進(jìn)一步研究中，本發(fā)明人研究了所述患者的微RNA(miR)。
微RNA (miRNA)是其終產(chǎn)物為約22nt的功能性RNA分子的一類非編碼性RNA基因。 它們從內(nèi)源編碼的不完整發(fā)夾前體被加工為單鏈RNA。它們似乎通過(guò)與靶mRNA的3’ -非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)借助翻譯抑制作用發(fā)揮功能(Griffith-Jones等人，2006，Nucleic Acids Research, Vol. 34，D140—D144)。 微RNA(miRNA)生物發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程。初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物由RNA聚合酶11轉(zhuǎn)錄并且可以在大小上是數(shù)百至數(shù)千個(gè)核苷酸長(zhǎng)度范圍內(nèi)(初級(jí)miRNA)。miRNA可以追溯至兩個(gè)基因組來(lái)源。一些miRNA位于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)部。其他miRNA位于非編碼性RNA的內(nèi)含子或外顯子內(nèi)部。有趣地，初級(jí)miRNA可以編碼單個(gè)miRNA，但是也可以含有成簇的幾個(gè)miRNA。初級(jí)miRNA隨后由胞核核糖核酸酶III (RNA酶III)內(nèi)切核酸酶 Drosha加工成約70nt的發(fā)夾(前miRNA)。前miRNA隨后從細(xì)胞核由核輸出蛋白5/RanGTP 輸出到胞漿中。在胞漿中，第二種RNA酶III(Dicer)連同其dsRBD蛋白伙伴在發(fā)夾的莖區(qū)中切割該前miRNA，因而釋放約21核苷酸的RNA雙鏈體。來(lái)自該miRNA雙鏈體的一條鏈進(jìn)入抑制靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)合體(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC))，而另一條鏈被降解。鏈的選擇取決于該miRNA雙鏈體的局部熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。其5’末端較不穩(wěn)定配對(duì)的鏈被載入 RISC復(fù)合體。載入RISC復(fù)合體的miRNA似乎通過(guò)與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)借助翻譯抑制作用發(fā)揮功能(Du，T.和Zam0re，P.D.等人，微引物微RNA的生物發(fā)生和功能(micro-Primer :the biogenesis and function ofmicroRNA). Development(2005) 132, 4645-4652)。目前，462 種人 miRNA 序列保存在 miRBase (http //microrna. sanger. ac. uk) 中并且提出此名單會(huì)達(dá)到800種。迄今鑒定的龐大數(shù)目的miRNA暗示它們可能在生物過(guò)程的調(diào)節(jié)和細(xì)致微調(diào)中發(fā)揮復(fù)雜的作用。實(shí)際上，幾種miRNA參與細(xì)胞增殖調(diào)控(mir-12^和 let-7)、造血性B細(xì)胞系命運(yùn)(mir-181)，B細(xì)胞存活(mir-15a和mir-16-l)、腦模式建立 (mir-430)、胰腺細(xì)胞胰島素分泌(mir-357)、脂肪細(xì)胞發(fā)育(mir-375)和肌肉增殖與分化 (miR-1和miR-133)。許多miRNA位于涉及癌癥的基因組區(qū)域中。例如，含有mir-16-l和 mir-15的簇在大部分B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病中缺失和下調(diào)(B-CLL ;Calin，G. Α.等人，微 RNA-癌癥聯(lián)系新故事的開(kāi)女臺(tái)(MicroRNA-cancer connection :Thebeginning of a new tale). Cancer Res. (2006)66，7390-7394)。miRNA似乎參與基因調(diào)節(jié)。一些miRNA (包括lin_4和let_7)通過(guò)結(jié)合至靶mRNA 的部分互補(bǔ)性3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)來(lái)抑制蛋白質(zhì)合成。其他miRNA(包括植物中存在的 Scarecrow miRNA)像siRNA那樣發(fā)揮功能并且與完全互補(bǔ)性mRNA序列結(jié)合以摧毀靶轉(zhuǎn)錄物(Grishok 等人，2001)。隨著科學(xué)家開(kāi)始認(rèn)識(shí)到這些分子在真核基因表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮的廣泛作用，對(duì)微 RNA的研究正在增加。兩種最充分理解的miRNA(lin-4和let_7)通過(guò)調(diào)節(jié)一個(gè)重要mRNA 家族的翻譯而調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲(chóng)(C. elegans)中的發(fā)育時(shí)序(Pasquinelli，2002中綜述)。 已經(jīng)在秀麗隱桿線蟲(chóng)、果蠅、小鼠和人中鑒定了幾百種miRNA。如會(huì)對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子預(yù)期的那樣，已經(jīng)顯示miRNA水平在組織與發(fā)育狀態(tài)之間不同。此外，一項(xiàng)研究顯示了兩種 miRNA的減少表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞性白血病之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)，從而提供miRNA與癌癥之間的可能聯(lián)系(Calin，2002)。雖然該領(lǐng)域仍然不成熟，但是存在以下推測(cè)miRNA可能在調(diào)節(jié)高等真核生物中基因表達(dá)方面與轉(zhuǎn)錄因子同樣重要。存在幾個(gè)在細(xì)胞分化、早期發(fā)育和細(xì)胞過(guò)程如凋亡和脂肪代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA例子，lin-4和let_7均在秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育期間調(diào)節(jié)從一種幼體狀態(tài)轉(zhuǎn)變至另一種幼體狀態(tài)(Ambros，200 。mir-14和bantam是顯然通過(guò)調(diào)節(jié)參與凋亡的基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的果蠅miRNA (Brennecke等人，2003，Xu等人，2003)。Mir_14也參與脂肪代謝(Xu等人，2003)。Lsy-6和miR-273是調(diào)節(jié)化學(xué)感覺(jué)神經(jīng)元不對(duì)稱性的秀麗隱桿線蟲(chóng) miRNA (Chang等人，2004)。調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的另一種動(dòng)物miRNA是miR-181，它指導(dǎo)造血細(xì)胞分化(Chen等人，2004)。這些分子代表全部類型的具有已知功能的動(dòng)物miRNA。增強(qiáng)對(duì) miRNA功能的理解將毫無(wú)疑問(wèn)地揭示對(duì)正常發(fā)育、分化、胞內(nèi)與胞間通訊、細(xì)胞周期、血管生成、凋亡和許多其他細(xì)胞過(guò)程做出貢獻(xiàn)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。鑒于它們?cè)谏飳W(xué)功能中的重要作用，miRNA可能會(huì)提供用于治療性介入或診斷性分析的重要的點(diǎn)。豐富的肝臟特異性miRNA miR-122對(duì)于HCV RNA在穩(wěn)定表達(dá)HCV復(fù)制子的培養(yǎng)的人肝癌Huh7 細(xì)胞中高效復(fù)制是重要的(Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Science 2005 ；309 :1577-1581) 這個(gè)觀察結(jié)果引起關(guān)于miR-122在HCV感染中的作用和作為潛在治療靶的大量興趣。如本文中所解釋，現(xiàn)有CHC療法由PEG化INF α (pegIFNa) 聯(lián)合利巴韋林組成，但是該療法僅在約55%的患者中實(shí)現(xiàn)持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答(Maims MP等人，Lancet 2001 ；358 :958-965 ；Fried MW 等人，N Engl J Med2002 ；347 :975-982)。近來(lái)?yè)?jù)報(bào)道，miR-122和其他幾種miRNA的水平在Huh7肝癌細(xì)胞和原代小鼠肝細(xì)胞中受IFN 調(diào)節(jié)，并且miRNA可能介導(dǎo)IFN對(duì)HCV RNA體外復(fù)制的至少某些效應(yīng)(Pedersen IM等人， Nature2007 ；449 =919-922)。迄今進(jìn)行的全部實(shí)驗(yàn)均評(píng)估了 miR-122在HCV于培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制方面的作用。為確定miR-122在患有慢性丙型肝炎(CHC)的患者中的狀態(tài)，本發(fā)明人比較了 miR-122和其他miRNA在肝臟活組織檢查樣品中的水平，其中所述肝臟活組織檢查樣品從正在用pegIFNa和利巴韋林治療的42位CHC患者收集。使用化學(xué)合成的miRNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)定量PCR(qPCR)進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，被劃分為原發(fā)性無(wú)應(yīng)答者(PNR) 的不應(yīng)答于療法而伴有病毒載量在第12周下降超過(guò)2 Iogltl的患者比伴有強(qiáng)烈IFNa應(yīng)答且在第12周具不可檢測(cè)到的HCV RNA (完全的早期病毒學(xué)應(yīng)答；cEVR)的患者具有顯著較低水平的miR-122。PNR和cEVR患者之間的差異與肝纖維樣變性的階段無(wú)關(guān)，表明miR-122 在PNR患者中的下降不歸因于活組織檢查材料中肝細(xì)胞的較低比例。另外，當(dāng)miR-122水平對(duì)肝細(xì)胞特異性白蛋白mRNA進(jìn)行歸一化時(shí)，各組之間miR-122表達(dá)的差異仍是顯著的， 這進(jìn)一步支持miR-122水平與治療應(yīng)答之間的直接關(guān)聯(lián)。臨床研究已經(jīng)顯示，具有高HCV病毒載量的患者較差地應(yīng)答于療法(Marms MP等人，Lancet 2001 ；358 :958-965 ；Fried MW 等人，N Engl J Med2002 ;347 :975-982)。由于miR-122對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞中的HCV復(fù)制是重要的，故本發(fā)明人在無(wú)應(yīng)答者中發(fā)現(xiàn)低量 miR-122是令人吃驚的。本發(fā)明人測(cè)量了所述患者的肝臟和血清中的HCV RNA。沒(méi)有觀察到miR-122水平與HCV病毒載量之間的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果與體外獲得的結(jié)果相反并且不支持 miR-122在HCV體內(nèi)復(fù)制中的明顯作用(見(jiàn)例如W0-A-2007/1127M，其提出抑制miR-122 用于治療HCV)。無(wú)應(yīng)答者中降低的miR-122水平提出一種可能性miR_122是一種受負(fù)調(diào)節(jié)的IFN靶基因。實(shí)際上，miR-122在CHC患者的活組織檢查樣品中的表達(dá)顯示負(fù)相關(guān)于已知的IFN-刺激基因(ISG)的表達(dá)?？偠灾?，現(xiàn)有令人吃驚的結(jié)果顯示(i)不應(yīng)答于IFN療法的患者通常具有比應(yīng)答者低幾倍的miR-122水平；(ii)peglFNa的施用未對(duì)患者肝臟中的miR-122水平產(chǎn)生明顯影響；和(iii)肝內(nèi)miR-122水平與HCV RNA水平之間不存在關(guān)聯(lián)。這是出于意料的，因?yàn)榛贖uh7細(xì)胞中的HCV復(fù)制子研究，低水平的miR-122應(yīng)當(dāng)降低病毒產(chǎn)量并有益于該療法。然而，miR-122水平在PNR中明顯低于cEVR患者的研究結(jié)果使miR-122成為一種便利標(biāo)記物，該標(biāo)記物例如連同預(yù)激活的ISG (Sarasin-Filipowicz M等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008,105(19) :7034-7039 ；Chen L 等人，Gastroenterology 2005 ； 128 :1437-1444 ； Asselah T等人，Gut2008 ；57 =516-524)適用于預(yù)測(cè)IFN療法在CHC患者中的結(jié)果。另外， 本發(fā)明結(jié)果也令人吃驚地顯示(i)不應(yīng)答于IFN療法的患者通常具有比應(yīng)答者高幾倍的 miR-296-5p水平。這表明miR496-5p并且更一般地表明miRNA可以用于預(yù)測(cè)IFN療法在CHC患者中的結(jié)果。這導(dǎo)致本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到可以開(kāi)發(fā)一種基于miRNA的方法以幫助臨床決定針對(duì)患有肝臟病毒性感染的受試者的治療方案。來(lái)自感染個(gè)體的miRNA(例如miR-122或 miR-296-5p)的水平可以與來(lái)自對(duì)照(即無(wú)病毒性感染的受試者)的基因表達(dá)比較。(與對(duì)照相比)具有較低水平miR-122和/或較高水平miR496-5p的感染受試者將不可能得益于治療方案中的IFN使用(即，預(yù)期這些個(gè)體不會(huì)具有RVR)，而與對(duì)照表達(dá)相比其miR-122水平和/或miR496-5p水平大多未改變或升高的感染受試者有可能得益于 IFN療法并具有RVR。本發(fā)明人驚訝于產(chǎn)生這些關(guān)聯(lián)，原因是本領(lǐng)域已知的體外結(jié)果做出相反預(yù)測(cè)。盡管先前已研究了 “應(yīng)答”和“非應(yīng)答”的肝臟病毒性感染受試者中的基因表達(dá)水平，例如Chen等人Q005) (Gastroenterology 128，1437-1444，然而作為本發(fā)明的一部分所實(shí)施的研究調(diào)查了廣泛得多的基因集合以確定哪些基因?qū)⒊洚?dāng)預(yù)后標(biāo)記物。另外，本發(fā)明人也評(píng)估了不同的miRNA是否可能用作預(yù)后標(biāo)記物。而且，本發(fā)明人也分析了抗病毒治療之前和之后所取的樣品中的基因表達(dá)水平和miRNA水平，并使用這種信息來(lái)鑒定預(yù)后的遺傳標(biāo)記物，而先前的研究?jī)H試圖將治療結(jié)果與治療前所取的樣品中存在的基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)。認(rèn)為導(dǎo)致鑒定到下文所述預(yù)后遺傳標(biāo)記物的數(shù)據(jù)集合比先前研究中的數(shù)據(jù)完整且有力得多。因此在本發(fā)明的第一方面，提供了用于確定具有肝臟病毒性感染的受試者會(huì)應(yīng)答于包括刺激干擾素(IFN)活性的抗病毒療法的可能性的方法，該方法包括對(duì)來(lái)自該受試者的樣品分析miRNA的表達(dá)水平并且比較來(lái)自受試者的樣品中所述miRNA的表達(dá)水平與對(duì)照樣品中所述miRNA的表達(dá)水平。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，miRNA是miR122并且其中與對(duì)照樣品中miR-122的水平相比，來(lái)自受試者的樣品中較低的miR-122水平表明該受試者很可能不應(yīng)答于所述抗
病毒療法。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施方案中，所述實(shí)施方案可以與上文所述的那些實(shí)施方案聯(lián)合，miRNA是miR496-5p并且其中與對(duì)照樣品中miR496-5p的水平相比，來(lái)自受試者的樣品中較高的miR496-5p水平表明該受試者很可能不應(yīng)答于所述抗病毒療法。在本發(fā)明的一些其他實(shí)施方案中，分別與對(duì)照樣品中miR-122或miR496-5p的水平相比，來(lái)自受試者的樣品中未改變或升高的miR-122水平或未改變或降低的miR496-5p 水平分別可以表示該受試者可能應(yīng)答于所述抗病毒療法。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法不限于僅使用一種miRNA，還包括任意miRNA的表達(dá)水平與miR-122和/或miR496-5p的那些表達(dá)水平的任意組合，或任意相關(guān)的miRNA、尤其具有預(yù)測(cè)力的任意miRNA的組合，其中所述的預(yù)測(cè)力針對(duì)具有肝臟病毒性感染的受試者會(huì)應(yīng)答于抗病毒療法的可能性。在本發(fā)明的方法中，抗病毒療法可以是聚乙二醇化的IFN α (pegIFN α )，其任選地與利巴韋林聯(lián)合。而且，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，病毒性感染是乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。而且，肝臟組織可以用作本發(fā)明方法中的樣品。
有利地，也可以在本發(fā)明的方法中分析可能預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法的基因(例如由一些本發(fā)明人在先前研究中所發(fā)表基因中的一些基因(Sarasin-Filipowicz等人， 2008，PNAS，105(19) :7034-7039))的表達(dá)，目的在于提高預(yù)測(cè)力，可以通過(guò)測(cè)量樣品中 mRNA基因轉(zhuǎn)錄物的量或從所述mRNA衍生的cDNA的量，或通過(guò)例如使用特異性結(jié)合分子測(cè)量樣品中由該基因編碼的肽或多肽的量來(lái)確定所述的基因表達(dá)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物，例如人。本發(fā)明也包括用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，所述的試劑盒包含用于對(duì)來(lái)自受試者的樣品分析miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達(dá)水平的工具；并且任選地包括用于比較來(lái)自該受試者的樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達(dá)水平與對(duì)照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具。該試劑盒可以還包含用于分析可能預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法的至少一種基因的表達(dá)的工具，最終包含一種或多種特異性結(jié)合分子，所述的特異性結(jié)合分子可靶向代表所述至少一種基因的分子，所述的至少一種基因可預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法，其中所述的特異性結(jié)合分子是寡核苷酸探針、抗體或適體； 并且任選地，用于比較樣品中所述基因的表達(dá)與對(duì)照樣品中相同基因的表達(dá)的工具。將理解本發(fā)明的方法會(huì)極有益于臨床醫(yī)生。IFN是蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子并且含有IFN 的藥物制品造價(jià)昂貴。因而對(duì)臨床醫(yī)生極重要的是確信以適宜和經(jīng)濟(jì)的方式使用IFN。而且，與成本無(wú)關(guān)的是，往往希望盡可能快地消除肝臟病毒性感染。因此，如果臨床醫(yī)生施用 IFN并且隨后發(fā)現(xiàn)它沒(méi)有有益效果，則這是浪費(fèi)時(shí)間(本可以用來(lái)使用備選療法)。本發(fā)明的方法因而與臨床醫(yī)生極有關(guān)系，因?yàn)樗梢澡b定兩個(gè)受試者群體。一個(gè)群體與對(duì)照相比會(huì)顯示較低的miR-122水平和/或較高的miR496-5p水平并且因而可能不會(huì)從用IFN治療中得益。與對(duì)照相比，具有正?；蛏叩膍iR-122水平和/或正?；蚪档偷膍iR496-5p 表達(dá)水平的另一個(gè)群體會(huì)從用IFN治療中得益。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了影響具有肝臟病毒性感染的受試者針對(duì)抗病毒療法的應(yīng)答的方法，該方法包括調(diào)節(jié)miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平，其中所述抗病毒療法包括刺激干擾素(IFN)活性。miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平可能通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法調(diào)節(jié)。此類方法的例子可以在例如W0-A-2006/13794U W0-A-2007/021896或 W0-A-2007/090073 中找到?！翱共《警煼ā币庵赣糜跍p少涉及刺激IFN活性的病毒性感染的任意治療方案。這種方案可以涉及使用刺激I型IFN活性和/或誘導(dǎo)IFN刺激的基因(ISG)的化合物。該療法可以涉及用IFN本身或其他IFN受體激動(dòng)劑治療。例如，該療法可以使用聚乙二醇化
IFNa (pegIFNa )。該療法可以僅涉及刺激IFN活性。但是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法對(duì)預(yù)測(cè)包括使用聯(lián)合療法的抗病毒療法的有效性特別有用，其中所述聯(lián)合療法包括與已知抗病毒藥聯(lián)合的IFN活性刺激物。多種抗病毒藥是本領(lǐng)域已知的并且本發(fā)明的方法可以用來(lái)評(píng)價(jià)眾多的不同聯(lián)合療法的有效性。但是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法對(duì)于預(yù)測(cè)與抗病毒藥利巴韋林聯(lián)合使用IFN活性刺激物的療法的有效性具有特別的價(jià)值。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用來(lái)預(yù)測(cè)pegIFNa和利巴韋林作為抗病毒療法的有用性。
本發(fā)明的方法可以用來(lái)評(píng)價(jià)針對(duì)眾多不同肝臟病毒性感染的療法的有效性，所述肝臟病毒性感染包括乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用來(lái)評(píng)價(jià)針對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染的療法的有效性。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法對(duì)區(qū)分預(yù)期具有快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)的受試者和沒(méi)有快速病毒學(xué)應(yīng)答(無(wú)RVR)的那些受試者特別有用?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的代表受試者中miR-122水平的樣品包括可以提供關(guān)于該受試者中miR-122水平方面信息的任意樣品。合適樣品的例子包括活組織檢查樣品、外科手術(shù)期間切下的樣品、血樣、尿樣、痰樣品、腦脊液樣品和拭子樣品(如唾液拭子樣品)。將理解的是樣品來(lái)源將取決于該受試者可能患有哪種類型的病毒性感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品來(lái)自肝臟組織。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)所述方法用來(lái)評(píng)估具有HCV 感染的受試者時(shí)，肝臟樣品特別具有指示性。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)RVR能夠通過(guò)分析 miR-122的水平與無(wú)RVR受試者區(qū)分。合適的樣品可以包括組織切片，如組織學(xué)切片或冰凍切片?？杉灾苽浯祟惽衅瑥亩軌蛱峁┬畔⒌姆椒▽⑹潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且應(yīng)當(dāng)參考研究基因表達(dá)時(shí)意圖使用的技術(shù)加以選擇，其中所述信息代表所述切片所來(lái)源的受試者中miRNA例如miR-122 或miR496-5p的表達(dá)水平。雖然構(gòu)思了使用包含受試者的組織的一部分的樣品，不過(guò)通?？梢詢?yōu)選的是代表 miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的樣品包含從這種組織取得的合適提取物，所述提取物能夠進(jìn)行研究以提供該受試者中關(guān)于所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的所述水平方面的信息。用于產(chǎn)生能夠提供關(guān)于受試者中基因表達(dá)方面信息的組織提取物的合適方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的方案可以參考待研究基因表達(dá)的方式選擇。在樣品源自肝臟的情況下，合適的制備步驟在實(shí)施例中公開(kāi)?！皩?duì)照樣品”意指與來(lái)自受試者的樣品等同的樣品，該樣品已經(jīng)來(lái)源于并未患有肝臟病毒性感染的個(gè)體。雖然構(gòu)成對(duì)照樣品的等同組織樣品或器官樣品或來(lái)自此類樣品的提取物可以直接用作對(duì)照樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的信息來(lái)源，將理解并且一般優(yōu)選應(yīng)當(dāng)以參考數(shù)據(jù)的形式提供關(guān)于“理想”對(duì)照樣品中miRNA例如miR-122或 miR-296-5p的表達(dá)水平的信息。這種參考數(shù)據(jù)可以用指示所選擇對(duì)照組織中miRNA例如 miR-122或miR496-5p水平的表格形式提供。備選地，這種參考數(shù)據(jù)可以用計(jì)算機(jī)軟件形式供應(yīng)，所述的計(jì)算機(jī)軟件含有指示所選擇對(duì)照組織中miRNA例如miR-122或miR496-5p 水平的可獲取信息。該參考數(shù)據(jù)可以例如以算法的形式提供，其中所述的算法能夠比較受試者中至少miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達(dá)水平與對(duì)照組織樣品中這種miRNA 的表達(dá)。在對(duì)照樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平欲通過(guò)處理構(gòu)成對(duì)照樣品的組織或器官樣品進(jìn)行研究的情況下，使用與處理來(lái)自該受試者的樣品所用的相同方法實(shí)施這種處理是有益的。受試者樣品和對(duì)照樣品的這種平行處理允許產(chǎn)生程度更大的可信性，從而這些組織中的基因表達(dá)比較將相對(duì)于另一方進(jìn)行歸一化(因?yàn)榕c處理組織和研究基因表達(dá)的所選方法相關(guān)的任意人為影響將應(yīng)用于受試者和對(duì)照樣品這兩者)。本發(fā)明的方法可以涉及分析至少miR-122的水平。改變的miR-122水平可以用于確定抗病毒療法有效性的研究結(jié)果是令人驚訝的。就現(xiàn)有技術(shù)中公布的結(jié)果而言，完全出乎意料的是較低的miR-122水平與針對(duì)后續(xù)IFN療法的不良應(yīng)答相關(guān)。在先前研究中，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定到不同的基因，它們的表達(dá)水平可以是抗病毒療法結(jié)果的預(yù)后標(biāo)記物。涉及miR-122的本發(fā)明可以與所述的基因組合，旨在提供更有力的預(yù)測(cè)?？梢员谎芯康膍iRNA例如miR-122或miR496-5p的存在、不存在和/或水平通常將使用合適的探針?lè)肿訖z測(cè)。這種檢測(cè)會(huì)提供miRNA例如miR-122或miR496-5p的存在、 不存在和/或水平方面的信息并且因而允許在出現(xiàn)于受試者中的miRNA例如miR-122或 miR496-5p和出現(xiàn)于對(duì)照樣品中的那些miRNA的水平之間比較。探針通常將能夠直接或間接地與該miRNA例如miR-122或miR496-5p特異性結(jié)合。隨后可以評(píng)估此類探針的結(jié)合作用并使之與該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平關(guān)聯(lián)，以允許受試者與對(duì)照之間的有效預(yù)后性比較。“改變的表達(dá)”包括與對(duì)照相比時(shí)樣品中的基因表達(dá)升高或降低，如上文所討論。相反地，“未改變的表達(dá)”包括與對(duì)照相比時(shí)樣品中的基因表達(dá)不升高或不降低， 如上文所討論。評(píng)估m(xù)iRNA例如miR-122或miR496-5p的水平和基因表達(dá)是否改變或未改變可以可以使用統(tǒng)計(jì)分析的常規(guī)方法進(jìn)行。靶分子可以是肽或多肽。使用特異性結(jié)合分子，例如抗體，可以確定肽或多肽的量。在一個(gè)優(yōu)選的例子中，可以參考樣品中靶蛋白的生物學(xué)活性評(píng)估該樣品中存在的某些靶蛋白的量。以這種方式評(píng)估和比較表達(dá)在具有酶活性的蛋白質(zhì)靶的情況下是特別合適的。用于測(cè)量樣品中存在的蛋白質(zhì)靶的量的合適技術(shù)包括但不限于基于適配子和抗體的技術(shù)，如放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡法。為了本發(fā)明的目的，將“核酸”或“核酸分子，，理解為指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。另外，除非上下文另外要求，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這些術(shù)語(yǔ)包括天然核苷酸的已知類似物，其中所述的已知類似物可以按照類似于天然存在核苷酸的方式發(fā)揮作用。而且，將理解適用于本發(fā)明的靶核酸不需要包含“全長(zhǎng)核酸”(例如全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)錄物)，而僅需要包含允許探針?lè)肿犹禺愋越Y(jié)合的足夠長(zhǎng)度。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)裂解取自合適樣品的細(xì)胞(這可以使用市售的裂解緩沖液如Qiagen有限公司生產(chǎn)的裂解緩沖液實(shí)現(xiàn))，隨后使用市售的核酸分離柱(如Qiagen有限公司生產(chǎn)的RNeasy微量離心柱)離心裂解物的方法處理樣品以分離RNA靶分子。用于RNA提取的其他方法包括Chomczynski，P.和&icchi，N. (1987) AnalyticalBiochemistry 162，156. “通過(guò)酸硫氰酸胍-酚-氯仿提取的單步驟RNA分離方法(Single Step Method of RNA Isolation by Acid GuanidiniumThiocyanate-Pheno I-Chloroform Extraction)，，的酚和異硫氰酸胍方法的變更方式。以這種方式獲得的RNA 可以構(gòu)成合適的靶分子本身或可以充當(dāng)模板用于產(chǎn)生代表miR-122的水平的靶分子。在評(píng)估所選擇基因的表達(dá)旨在獲得更有力預(yù)測(cè)值的情況下，可以優(yōu)選來(lái)源于受試者或?qū)φ諛悠返腞NA可用作cDNA合成的底物，例如，使用Superscript系統(tǒng)Gnvitrogen Corp.)。所得的cDNA隨后可以使用BioArrayRNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(Enzo Life SciencesInc.)轉(zhuǎn)變成生物素化cRNA，并且使用RNeasy微量試劑盒Oliagen Ltd)從反應(yīng)混合物中純化出這種cRNA?？梢詮膩?lái)源于受試者或?qū)φ諛悠返慕M織中直接測(cè)量代表基因表達(dá)的mRNA， 無(wú)需mRNA提取或純化。例如，目的受試者或?qū)φ諛悠分写嬖诘牟⒋砘虮磉_(dá)的mRNA可以使用這種組織的恰當(dāng)固定的切片或活組織檢查樣品進(jìn)行研究。這種類型樣品的使用可以在可與其開(kāi)展表達(dá)比較的快速性方面提供益處，以及可以用來(lái)產(chǎn)生該樣品的相對(duì)便宜且簡(jiǎn)單的組織處理過(guò)程。原位雜交技術(shù)代表可以在這種類型的組織樣品中研究和比較基因表達(dá)的優(yōu)選方法。維持受試者或?qū)φ諛悠分写砘虮磉_(dá)的RNA的可獲得性的目的組織處理技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。但是，可以提取和收集受試者或?qū)φ諛悠分写砘虮磉_(dá)的 mRNA的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以有利地在本發(fā)明中使用此類技術(shù)。包含來(lái)自受試者或?qū)φ諛悠返奶崛〉膍RNA的樣品可以優(yōu)選用于本發(fā)明第三方面的方法中，因?yàn)榇祟愄崛∥飪A向于比包含原始組織的樣品更易于研究。例如，允許比較基因表達(dá)的合適靶分子可以包含從受試者來(lái)源的組織樣品或從對(duì)照組織樣品分離的總 RNA。而且，可以容易地?cái)U(kuò)增提取的RNA以產(chǎn)生放大的mRNA樣品，其中所述放大的mRNA樣品能夠提供關(guān)于受試者或?qū)φ諛悠分谢虮磉_(dá)的增多的信息。用于提取和擴(kuò)增mRNA群體的技術(shù)的合適例子是熟知的，并在下文更詳細(xì)地考慮。例如，分離和純化核酸以產(chǎn)生本發(fā)明適用的核酸靶的方法在P. Ti j sseη編著的 Elsevier, N. Y. (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMoIecuIar Biology !Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation的第3章中詳細(xì)描述。當(dāng)想要在研究和比較基因表達(dá)之前擴(kuò)增核酸靶的情況下，可以優(yōu)選使用維持或控制所擴(kuò)增核酸在來(lái)源該樣品的受試者或?qū)φ战M織中相對(duì)頻率的方法?！岸俊睌U(kuò)增的合適方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。一個(gè)熟知例子即定量PCR涉及同時(shí)地共擴(kuò)增已知其量在對(duì)照與受試者樣品之間不改變的對(duì)照序列。這提供了可用來(lái)校準(zhǔn) PCR反應(yīng)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。除上文概述的方法之外，技術(shù)人員會(huì)知道將擴(kuò)增基因-轉(zhuǎn)錄物特異性產(chǎn)物偶聯(lián)于信號(hào)產(chǎn)生的任何技術(shù)也可以適用于定量。一個(gè)優(yōu)選的例子使用針對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的便利改進(jìn)(US 4683195和468320 ，所述的便利改進(jìn)通過(guò)摻入mRNA的初始逆轉(zhuǎn)錄至cDNA而使聚合酶鏈反應(yīng)適于特定mRNA轉(zhuǎn)錄物的精確定量。其他關(guān)鍵性改進(jìn)能夠隨反應(yīng)進(jìn)程而實(shí)時(shí)測(cè)量積累的PCR產(chǎn)物。在許多情況下，可以優(yōu)選使用能夠指示相關(guān)樣品中靶分子存在性的探針?lè)肿釉u(píng)估受試者或?qū)φ諛悠分械幕虮磉_(dá)程度?？梢詤⒖即芯康幕虮磉_(dá)的(直接或間接)產(chǎn)物選擇探針。合適探針的例子包括具有適宜特異性的寡核苷酸探針、抗體、適配子和結(jié)合性蛋白質(zhì)或小分子。寡核苷酸探針可以用作探針。合適寡核苷酸探針的產(chǎn)生是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(《寡核苷酸合成方法和應(yīng)用》Piet Herdewijn(編著)(Oligonucleotide synthesis Methods and Applications, HumanaPress (2004)) 寡核苷酸和修飾的寡核苷酸是從眾多公司可商業(yè)獲得的。出于本發(fā)明的目的，寡核苷酸探針可以認(rèn)為包含能夠通過(guò)一個(gè)或多個(gè)類型的化學(xué)鍵與具有互補(bǔ)序列的核酸靶分子特異性雜交的寡核苷酸。這種結(jié)合通?？梢越柚パa(bǔ)堿基CN 102159725 A
說(shuō)明書(shū)
10/22 頁(yè)
配對(duì)并通常借助氫鍵形成發(fā)生。合適的寡核苷酸探針可以包括天然堿基(即A、G、C或T) 或修飾的堿基(7-脫氮鳥(niǎo)苷、肌苷等)。此外，除磷酸二酯鍵之外的鍵也可以用來(lái)連接寡核苷酸探針中的堿基，只要這種變異不干擾該寡核苷酸探針與其靶雜交。因此，適用于本發(fā)明方法中的寡核苷酸探針可以是其中組成堿基由肽鍵而非磷酸二酯鍵連接的肽核酸。如本文中所解釋，微RNA分子(“miRNA”)的長(zhǎng)度通常是21至22個(gè)核苷酸，盡管已經(jīng)報(bào)道了 17和直至25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。多種miRNA各自從較長(zhǎng)的前體RNA分子(“前體miRNA”)加工而來(lái)。前體miRNA從不編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)。前體miRNA具有能夠形成莖環(huán)樣或折回樣結(jié)構(gòu)的兩個(gè)互補(bǔ)性區(qū)域，所述的莖環(huán)樣或折回樣結(jié)構(gòu)由動(dòng)物中稱作 Dicer的酶切開(kāi)。Dicer是核糖核酸酶III樣核酸酶。加工的miRNA —般是該莖的一部分。經(jīng)加工的miRNA (也稱作“成熟miRNA” )變成一個(gè)下調(diào)特定靶基因的大復(fù)合體的部分。動(dòng)物miRNA的例子包括阻滯翻譯的與靶發(fā)生不完全堿基配對(duì)的那些miRNA (Olsen等人，1999 ；Seggerson等人，200 。siRNA分子也由Dicer加工，但是來(lái)自長(zhǎng)的雙鏈RNA分子。siRNA不天然地存在于動(dòng)物細(xì)胞中，但是它們可以在此類細(xì)胞中的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)內(nèi)發(fā)揮功能以指導(dǎo)mRNA靶的序列特異性切割(Denli等人，2003)。對(duì)內(nèi)源miRNA分子的研究例如在美國(guó)專利申請(qǐng)60/575，743中描述。當(dāng)成熟的單鏈RNA被一個(gè)調(diào)節(jié)與合成性miRNA雜交的mRNA翻譯的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合時(shí)，該miRNA在細(xì)胞中明顯地有活性。導(dǎo)入以與內(nèi)源表達(dá)的miRNA相同的方式影響細(xì)胞的外源RNA分子要求序列與內(nèi)源性成熟miRNA相同的單鏈RNA分子應(yīng)當(dāng)被促進(jìn)翻譯性調(diào)控的蛋白質(zhì)復(fù)合體攝取。已經(jīng)評(píng)價(jià)了多種RNA分子設(shè)計(jì)。已經(jīng)鑒定了使miRNA途徑攝取想要的單鏈miRNA最大化的3種通用設(shè)計(jì)。將帶有具備所述3種設(shè)計(jì)至少之一的miRNA序列的RNA分子稱作合成性 miRNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成性miRNA包含兩種RNA分子，其中一種RNA與天然存在的成熟miRNA相同。與成熟miRNA相同的RNA分子稱作活性鏈。稱作互補(bǔ)鏈的第二 RNA分子至少部分地互補(bǔ)于活性鏈?；钚枣満突パa(bǔ)鏈雜交以產(chǎn)生與天然存在的miRNA前體相似的稱作合成性miRNA的雙鏈RNA，其中所述的miRNA前體在細(xì)胞中的miRNA激活之前即刻被蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合。最大化合成性miRNA的活性要求在翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的 miRNA蛋白質(zhì)復(fù)合體對(duì)活性鏈的攝取最大化和對(duì)互補(bǔ)鏈的攝取最小化。提供最適miRNA活性的分子設(shè)計(jì)涉及對(duì)互補(bǔ)鏈的修飾。兩種設(shè)計(jì)在互補(bǔ)鏈中摻入化學(xué)修飾。第一修飾涉及產(chǎn)生在其5’末端具有除磷酸酯或羥基之外的化學(xué)基團(tuán)的互補(bǔ)性RNA。5’修飾的存在明顯消除了 miRNA蛋白質(zhì)復(fù)合體對(duì)互補(bǔ)鏈的攝取并且隨后支持其對(duì)活性鏈的攝取。5’修飾可以是包括NH2、NHC0CH3、生物素等在內(nèi)的多種分子之任一者。顯著減少miRNA途徑攝取互補(bǔ)鏈的第二化學(xué)修飾策略是在互補(bǔ)鏈的頭2_6個(gè)核苷酸中摻入帶有糖修飾的核苷酸。應(yīng)當(dāng)指出符合第二設(shè)計(jì)策略的糖修飾可以與符合第一設(shè)計(jì)策略的5’末端修飾聯(lián)合以進(jìn)一步增強(qiáng)合成性miRNA的活性。第三合成性miRNA設(shè)計(jì)涉及在互補(bǔ)鏈的3’末端摻入不互補(bǔ)于活性鏈的核苷酸。所得活性RNA和互補(bǔ)性RNA的雜交體在活性鏈的3’末端處是極穩(wěn)定的，但在活性鏈的5’末端處是相對(duì)不穩(wěn)定的。用siRNA的研究表明5’雜交體穩(wěn)定性是支持RNA干擾的蛋白質(zhì)復(fù)合體攝取RNA的關(guān)鍵指標(biāo)，其至少與細(xì)胞中的miRNA途徑有關(guān)。在互補(bǔ)RNA鏈中審慎使用錯(cuò)配顯著地增強(qiáng)合成性miRNA的活性。如本文中所解釋，術(shù)語(yǔ)“miRNA”通常指單鏈分子，但是在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)的分子還會(huì)包含一個(gè)區(qū)域或一條額外鏈，其部分地(在鏈長(zhǎng)度范圍內(nèi)10%與50% 之間互補(bǔ))、基本上(在鏈長(zhǎng)度范圍內(nèi)大于50%但小于100%互補(bǔ))或完全互補(bǔ)于相同單鏈分子的另一個(gè)區(qū)域或如此互補(bǔ)于另一個(gè)核酸。因此，核酸可以包含這樣的分子，其包含了包含某分子的特定序列的一條或多條互補(bǔ)鏈或自我互補(bǔ)鏈或者“互補(bǔ)物”。例如，前體miRNA 可以具有多達(dá)100%互補(bǔ)的自我互補(bǔ)區(qū)域。合成性miRNA —般包含兩條鏈，與正在研究的成熟miRNA在序列上相同的活性鏈和與該活性鏈至少部分互補(bǔ)的互補(bǔ)鏈。活性鏈?zhǔn)巧飳W(xué)相關(guān)分子并且應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地被細(xì)胞中借助mRNA降解或翻譯性調(diào)控作用調(diào)節(jié)翻譯的復(fù)合體攝取。對(duì)活性鏈的優(yōu)選性攝取產(chǎn)生兩個(gè)深遠(yuǎn)結(jié)果(1)觀察到的合成性miRNA的活性大幅度地增長(zhǎng)并且O)因攝取和激活互補(bǔ)鏈所誘導(dǎo)的非預(yù)期效應(yīng)基本上消除。根據(jù)本發(fā)明，可以使用幾種合成性miRNA設(shè)計(jì)來(lái)確保對(duì)活性鏈的優(yōu)選性攝取。在互補(bǔ)鏈的5’末端導(dǎo)入除磷酸酯或羥基之外的穩(wěn)定部分損害了互補(bǔ)鏈在miRNA 途徑中的活性。這確保僅使用合成性miRNA的活性鏈來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的翻譯。5’修飾包括但不限于NH2、生物素、胺基、低級(jí)烷胺基、乙酰基、2 O-Me, DMT0、熒光素、硫氫基或吖啶或具有這種類型官能性的任意其他基團(tuán)。其他的有義鏈修飾。在合成性miRNA的互補(bǔ)鏈中導(dǎo)入核苷酸修飾如2’ _0Me、NH2、 生物素、胺基、低級(jí)烷胺基、乙?；MT0、熒光素、硫氫基或嚇唳或具有這種類型官能性的任意其他基團(tuán)可以消除互補(bǔ)鏈的活性并增強(qiáng)對(duì)該miRNA的活性鏈的攝取。如同siRNA(Schwarz 2003)那樣，合成性miRNA的活性鏈5’和3’末端的相對(duì)穩(wěn)定性顯然決定了 miRNA途徑對(duì)該活性鏈的攝取和激活。通過(guò)策略性替換合成性miRNA的互補(bǔ)鏈3’末端中的堿基錯(cuò)配致合成性miRNA的活性鏈5’末端去穩(wěn)定化增強(qiáng)了活性鏈的活性并且基本上消除互補(bǔ)鏈的活性。miR-122(也稱作miRNA-1222、22-核苷酸微RNA)從轉(zhuǎn)錄自基因her的肝臟特異的非編碼性聚腺苷酸化RNA衍生。從哺乳動(dòng)物物種直至魚(yú)類，miR-122的確切序列以及在her mRNA內(nèi)部的相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)是保守的。miR-122在小鼠肝臟中的水平在胚發(fā)生的約第17日增加至50%最大值，并且在出生前達(dá)到平均每個(gè)細(xì)胞50，000個(gè)拷貝的幾乎最大水平(它占據(jù)70%的全部miRNA) (Chang等人，2004 ；Lagos-Quintana等人，200 。它是據(jù)認(rèn)為對(duì)于建立基因表達(dá)模式重要的許多組織特異性微RNA之一，其中所述的基因表達(dá)模式可能負(fù)責(zé)維持組織的分化狀態(tài)(Lagos-Quintana等人，2002 ；Lim等人，2005)。如本文中所用的短語(yǔ)“特異性雜交至”指寡核苷酸探針偏好地與特定靶核苷酸序列在嚴(yán)格條件下結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，此時(shí)所述序列存在于復(fù)雜混合物(如總細(xì)胞DNA 或RNA)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可以僅與特定靶分子結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指這樣的條件，在所述條件下探針將與其靶的子序列雜交，而最小程度地與其他序列雜交。在一些實(shí)施方案中，探針可以在嚴(yán)格條件下與除該探針靶之外的序列不雜交。嚴(yán)格條件具有序列依賴性并且在不同的環(huán)境中會(huì)不同。較長(zhǎng)的序列在更高的溫度上特異性雜交。通常，可以將嚴(yán)格條件選擇為在定義的離子強(qiáng)度和pH上，低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)約5°C。1是(在定義的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)與靶核酸互補(bǔ)的50%寡核苷酸探針與該靶核酸平衡雜交的溫度。由于靶核酸一般過(guò)量存在，50%的探針在Tm被平衡地占據(jù)。例如，嚴(yán)格條件將是這些條件，其中鹽濃度是在PH 7.0至8. 3至少約0.01至1.0M Na+離子濃度(或其他鹽)并且溫度對(duì)于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)是至少約30°C。 嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。寡核苷酸探針可以用來(lái)檢測(cè)合適代表性樣品中的互補(bǔ)性核酸序列(即核酸靶)。 這種互補(bǔ)結(jié)合作用形成可以使用寡核苷酸來(lái)檢測(cè)并因而允許比較特定基因表達(dá)的大部分技術(shù)的基礎(chǔ)。一些合適的技術(shù)允許平行地量化多種基因的表達(dá)并且包括其中實(shí)時(shí)地將物質(zhì)種類擴(kuò)增與量化偶聯(lián)的技術(shù)(如定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù))和其中經(jīng)擴(kuò)增的物質(zhì)種類的量化在擴(kuò)增后進(jìn)行的技術(shù)，如陣列技術(shù)。陣列技術(shù)涉及代表受試者或?qū)φ諛悠返臉悠放c多種寡核苷酸探針雜交，其中每種探針偏好地與公開(kāi)的一種基因或多種基因或miRNA雜交。陣列技術(shù)提供對(duì)特定寡核苷酸序列的獨(dú)特鑒定，例如通過(guò)其物理位置(例如，如AfTymetrix Inc.商業(yè)提供的二維陣列中的網(wǎng)格)或通過(guò)與另一個(gè)特征關(guān)聯(lián)(例如，標(biāo)記的珠子，如Illumina Inc或Luminex Inc商業(yè)提供)進(jìn)行鑒定。寡核苷酸陣列可以原位地合成(例如通過(guò)光定向合成，如Affymetrix Inc商業(yè)提供)或通過(guò)(如Agilent或Applied Biosystems商業(yè)提供的)接觸或噴墨技術(shù)預(yù)形成和點(diǎn)樣。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是完整或部分的cDNA序列也可以充當(dāng)陣列技術(shù)的探針(如商業(yè)地由Clontech提供)。寡核苷酸探針可以在印跡技術(shù)如DNA印跡或RNA印跡中用來(lái)檢測(cè)和比較基因表達(dá) (例如通過(guò)代表基因表達(dá)的cDNA或mRNA靶分子)。適用于DNA印跡或RNA印跡技術(shù)中的技術(shù)和試劑將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。簡(jiǎn)而言之，將包含DNA(在DNA印跡的情況下)或 RNA (在RNA印跡的情況下)靶分子的樣品根據(jù)它們穿透凝膠材料如丙烯酰胺或瓊脂糖的能力分離。凝膠的穿透可以由毛細(xì)管作用或電場(chǎng)活動(dòng)驅(qū)動(dòng)。一旦已經(jīng)實(shí)現(xiàn)靶分子的分離，將這些分子轉(zhuǎn)移至薄膜(通常是尼龍或硝化纖維素)，隨后固定在該膜上(例如通過(guò)焙烘或通過(guò)紫外線照射)。隨后可以通過(guò)寡核苷酸探針與結(jié)合至該膜的靶分子雜交檢測(cè)并比較基因表達(dá)。在某些情況下，使用比較基因表達(dá)的常規(guī)雜交方案可能證明是有問(wèn)題的。例如，印跡技術(shù)可能難以區(qū)別分子量大致相同的兩種或多種基因產(chǎn)物或miRNA，因?yàn)殡y以使用凝膠分開(kāi)大小相似的產(chǎn)物。因此，在這種情況下，可以優(yōu)選使用備選技術(shù)(如下文所述的那些技術(shù))比較基因表達(dá)?？梢詤⒖己线m核酸樣品中的整體轉(zhuǎn)錄物水平，通過(guò)高密度寡核苷酸陣列技術(shù)評(píng)估代表受試者中基因表達(dá)和/或miRNA水平的樣品中的基因表達(dá)。此類技術(shù)利用了其中寡核苷酸探針(例如通過(guò)共價(jià)結(jié)合作用)束縛至固體支持物的陣列。這些固定于固體支持物上的寡核苷酸探針陣列代表在本發(fā)明的方法和試劑盒中待用于基因表達(dá)比較的優(yōu)選組分?？梢园凑者@種方式結(jié)合龐大數(shù)目的此類探針以提供適于比較大量基因或miRNA的表達(dá)的陣列。因此，會(huì)認(rèn)識(shí)到此類寡核苷酸陣列可以在想要比較多于一種miRNA和/或基因的表達(dá)的實(shí)施方案中是特別優(yōu)選的。可以在比較代表基因表達(dá)的核酸靶中使用的其他合適方法學(xué)包括但不限于基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)或滾環(huán)DNA擴(kuò)增(RCA)。
通常希望將探針標(biāo)記，旨在可以輕易地檢測(cè)到這些探針?？梢栽跇?biāo)記根據(jù)本發(fā)明適用的探針或靶標(biāo)中使用的可檢測(cè)部分的例子包括通過(guò)光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段可檢測(cè)的任意組合物。合適的可檢測(cè)部分包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射活性物質(zhì)和比色物質(zhì)。這些可檢測(cè)部分適于摻入可以用于本發(fā)明方法中的全部類型的探針或靶，除非有相反說(shuō)明。合適酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復(fù)合體的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素； 合適熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素 (dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯、藻紅蛋白、得克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S、3H、14C或32P ；合適比色測(cè)定物質(zhì)的例子包括膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。檢測(cè)此類標(biāo)記物的手段是技術(shù)人員熟知的。例如，可以使用膠片或閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射標(biāo)記物；可以使用檢測(cè)發(fā)射光的光探測(cè)器檢測(cè)熒光標(biāo)記物。酶標(biāo)記物一般通過(guò)向酶提供底物并檢測(cè)因該酶作用于此底物所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)，并且比色測(cè)定標(biāo)記物通過(guò)簡(jiǎn)單地觀察有色標(biāo)記物檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以掃描熒光標(biāo)記的探針或靶并且使用激光共聚焦掃描儀檢測(cè)熒光。在標(biāo)記的核酸探針或靶的情況下，合適的標(biāo)記過(guò)程可以在雜交之前、期間或之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針或靶在雜交之前被標(biāo)記。熒光標(biāo)記物也是適合的，并且在使用時(shí)，通過(guò)量化來(lái)自雜交的熒光標(biāo)記核酸的熒光量化核酸探針與其核酸靶的雜交。量化可以源自結(jié)合摻入核酸的半抗原的熒光標(biāo)記試劑實(shí)施。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用合適的分析軟件如微陣列分析軟件包 (Affymetrix Inc.)實(shí)現(xiàn)雜交分析?？梢允褂脽晒怙@微鏡實(shí)現(xiàn)有效的量化，其中所述的熒光顯微鏡可以配備有自動(dòng)載物臺(tái)以允許自動(dòng)掃描陣列，并可以配備有用于自動(dòng)測(cè)量、記錄和后續(xù)加工熒光強(qiáng)度信息的數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)。這種自動(dòng)化的合適布局是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)連接至雜交的核酸的一種或多種可檢測(cè)部分檢測(cè)所述核酸?？蓹z測(cè)部分可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法中任意方法摻入。但是在一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品核酸(探針或靶)制備中的擴(kuò)增步驟期間同時(shí)摻入此類部分。因而例如，使用以可檢測(cè)部分標(biāo)記的引物或核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將提供用所述部分標(biāo)記過(guò)的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用熒光標(biāo)記的核苷酸(例如熒光素標(biāo)記的 UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增將該標(biāo)記物摻入轉(zhuǎn)錄的核酸。備選地，可以將合適的可檢測(cè)部分直接添加至原始核酸樣品(例如來(lái)自目的組織的mRNA、polyA mRNA、cDNA等)或在原始核酸擴(kuò)增結(jié)束后添加至擴(kuò)增產(chǎn)物。將標(biāo)記物如熒光標(biāo)記物連接至核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括例如切口翻譯或通過(guò)激酶處理核酸(例如用標(biāo)記的RNA)進(jìn)行末端標(biāo)記并隨后連接核酸接頭，其中所述核酸接頭將樣品核酸與標(biāo)記物(如合適的熒光團(tuán))連接。盡管本發(fā)的方法最合適與人受試者結(jié)合使用，然而它也可以用于確定非人動(dòng)物
15(例如馬、犬、牛、駱駝)中病毒性感染的治療過(guò)程。在先前研究中，本發(fā)明人確立了內(nèi)源性IFN系統(tǒng)在眾多感染的患者中被持久地激活。另外，本發(fā)明人驚訝于具有預(yù)激活的IFN系統(tǒng)的患者與不良的IFN療法應(yīng)答相關(guān)。這個(gè)研究結(jié)果是違背直覺(jué)的，因?yàn)槿藗儽緛?lái)預(yù)期活躍的先天免疫系統(tǒng)在IFNa療法期間將幫助消除病毒。本發(fā)明人分析了肝臟活組織檢查中的ISG表達(dá)并且進(jìn)一步得出結(jié)論存在其中 HCV出人意料地誘導(dǎo)(不阻斷)內(nèi)源性IFN系統(tǒng)的患者，并且存在其中HCV不誘導(dǎo)(可能通過(guò)切割TRIF和/或Cardif所致)內(nèi)源性IFN系統(tǒng)的患者，不過(guò)這種差異不影響HCV維持慢性感染的能力。在IFN系統(tǒng)沒(méi)有預(yù)激活的患者中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)pegIFNa 2b在4小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)肝臟中眾多ISG的強(qiáng)烈(次)最大上調(diào)。出人意料地，這種高ISG表達(dá)水平已經(jīng)存在于稍后不顯示第4周快速病毒學(xué)應(yīng)答的患者的治療前活組織檢查樣品中。還發(fā)現(xiàn)與HCV基因型2或3感染患者相比，內(nèi)源性IFN系統(tǒng)的預(yù)激活更頻繁地存在于HCV基因型1 (和4)感染患者的肝臟活組織檢查樣品中。這是令人好奇的，因?yàn)楸娝苤c基因型1感染患者低于50%的治愈相比，可以治愈超過(guò)80%的基因型2和3感染患者。本發(fā)明人的研究結(jié)果即內(nèi)源性IFN系統(tǒng)預(yù)激活的頻率和程度依賴于HCV基因型為對(duì) HCV基因型治療的不同易感性提供了解釋。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到這些數(shù)據(jù)確立了 HCV干擾IFN信號(hào)傳導(dǎo)并且因而損害治療應(yīng)答。 而且，HCV抑制IFNa信號(hào)傳導(dǎo)解釋了內(nèi)源性IFN系統(tǒng)的強(qiáng)烈預(yù)激活為何不導(dǎo)致自發(fā)消除 HCV。本發(fā)明人不希望受任何假設(shè)約束，不過(guò)相信這意味著IFNa將不會(huì)在感染HCV的肝細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)。在眾多患者的肝臟中觀察到的ISG上調(diào)隨后僅將出現(xiàn)于非感染的肝細(xì)胞中。肝臟活組織檢查中存在的ISG強(qiáng)烈誘導(dǎo)與這種模型一致，因?yàn)槲锤腥镜母渭?xì)胞比感染的肝細(xì)胞更多。在沒(méi)有成功切割Cardif和/或TRIF的病毒感染的肝細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn) IFN^產(chǎn)生。因?yàn)镠CV誘導(dǎo)的Jak-STAT途徑抑制，分泌的IFNii將不在這些感染的肝細(xì)胞中而僅在未感染的毗鄰細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)。“減少”意指物質(zhì)有效減少ISG的刺激，從而ISG的表達(dá)水平?jīng)]有顯著不同于對(duì)照組織中的表達(dá)水平。所述物質(zhì)可以在治療眾多不同的肝臟病毒性感染中使用，所述肝臟病毒性感染包括乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)用來(lái)預(yù)防或減少丙型肝炎病毒(HCV)感染?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的物質(zhì)的例子包括以下情況，其中該物質(zhì)可以結(jié)合至IFNa 多肽并阻止IFN功能活性，例如抗體和其片段和衍生物(例如結(jié)構(gòu)域抗體或Fab)。備選地， 該物質(zhì)可以通過(guò)充當(dāng)針對(duì)IFNa受體(例如IFNAR1、IFNAR2a、b或c)拮抗劑作為IFN系統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)揮作用。備選地，該物質(zhì)可以抑制IFN途徑中的酶或其他分子。備選地，該物質(zhì)可以以如此方式結(jié)合至編碼IFN α多肽的mRNA，從而導(dǎo)致減少該mRNA并因而減少IFNa多肽。備選地，該物質(zhì)可以以如此方式結(jié)合至編碼IFNa的核酸序列，從而導(dǎo)致減少所轉(zhuǎn)錄的編碼IFN α多肽的mRNA的量。例如，該物質(zhì)可以結(jié)合至IFN α基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)或結(jié)合至IFN的DNA的5’或3’并因而減少該蛋白質(zhì)的表達(dá)。存在眾多不同的人干擾素α多肽序列。共有序列已經(jīng)確定。該信息可以由技術(shù)人員用來(lái)開(kāi)發(fā)針對(duì)IFNa多肽的結(jié)合物質(zhì)。當(dāng)所述物質(zhì)結(jié)合至IFNa多肽時(shí)，優(yōu)選該物質(zhì)結(jié)合至由已經(jīng)正確折疊成其天然形式的蛋白質(zhì)所定義的表位。應(yīng)理解物種之間和基因型之間可以存在一些序列變異。因此， 其他的優(yōu)選表位包含來(lái)自基因變體的等同區(qū)域。可以使用以上在本發(fā)明第一方面中概述的序列相似性和同一性工具和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法鑒定來(lái)自其他IFN多肽的等同區(qū)域?？贵w可以通過(guò)注射抗原至動(dòng)物作為多克隆血清產(chǎn)生。例如，可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，以抗原(例如完整IFNa多肽或其片段)接種動(dòng)物(例如兔)產(chǎn)生多克隆抗體。備選地，抗體可以是單克隆的。常規(guī)雜交瘤技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生此類抗體。用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明中使用的單克隆抗體的抗原可以與用來(lái)產(chǎn)生多克隆血清的抗原相同。在其最簡(jiǎn)單的形式下，抗體或免疫球蛋白是通常用抗體的Y-免疫球蛋白(IgG) 類作為例子的Y形分子。該分子由四條多肽鏈每條分別大約50kD的兩條相同重鏈(H)和每條分別大約25kD的兩條相同輕鏈(L)組成。每條輕鏈通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵與重鏈結(jié)合(H-L)。兩個(gè)相同的H-L鏈組合通過(guò)與兩條H鏈之間相似的非共價(jià)鍵和二硫鍵連接以形成基本的四鏈免疫球蛋白結(jié)構(gòu)(H-L)2。輕鏈免疫球蛋白由1個(gè)V-結(jié)構(gòu)域(yL)和1個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CJ組成，而重鏈由1 個(gè)V-結(jié)構(gòu)域和取決于H鏈同種型的3個(gè)或4個(gè)C-結(jié)構(gòu)域(CH1、Ch2、Ch3和CH4)組成。在序列上變動(dòng)巨大的可變(V)結(jié)構(gòu)域位于每條輕鏈或重鏈的氨基端區(qū)域并且負(fù)責(zé)與抗原的特異性結(jié)合?？贵w對(duì)抗原的特異性實(shí)際上由V區(qū)內(nèi)部稱作高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū) (⑶R)的氨基酸序列決定。每條H鏈和L鏈的V區(qū)具有3個(gè)這樣的⑶R，并且正是全部6個(gè) CDR的組合才形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。顯示較少變異并支撐高變環(huán)的其余V區(qū)氨基酸稱作構(gòu)架區(qū)(FR)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域之外的區(qū)域(C-結(jié)構(gòu)域)在序列上相對(duì)恒定。將理解本發(fā)明抗體的表征特性是Vh和\結(jié)構(gòu)域。將進(jìn)一步理解總體而言Ch和Q結(jié)構(gòu)域的確切本質(zhì)對(duì)本發(fā)明是不重要的。實(shí)際上，用于本發(fā)明中的優(yōu)選抗體可以具有極不同的C1^nQ結(jié)構(gòu)域。另外，如下文更充分地討論，優(yōu)選的抗體功能性衍生物可以包含沒(méi)有C-結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域(例如 scFV抗體)。在一個(gè)物種中產(chǎn)生的抗體并且尤其是mAb已知用來(lái)治療一個(gè)不同物種時(shí)具有幾個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)。例如在人類中使用鼠抗體時(shí)，這些抗體總是具有血清中短的循環(huán)半壽期并且可以被正在治療的患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)蛋白。這可以導(dǎo)致不希望的人抗小鼠抗體 (HAMA)應(yīng)答發(fā)生。當(dāng)需要頻繁施用抗體時(shí)，這尤其麻煩，因?yàn)樵摽贵w可以增強(qiáng)其清除作用、 阻斷其治療作用并誘導(dǎo)超敏反應(yīng)。這些因素限制了小鼠單克隆抗體在人療法中的使用并且促進(jìn)抗體工程技術(shù)的發(fā)展以產(chǎn)生人源化抗體。因此，在意圖使用能夠降低IFN活性的抗體作為治療劑以在人受試者中治療HCV 感染的情況下，則優(yōu)選使非人來(lái)源的抗體和其片段被人源化?？梢酝ㄟ^(guò)將V區(qū)序列(例如源自非人雜交瘤中產(chǎn)生的單克隆抗體)與來(lái)自人抗體的C區(qū)(并且理想地是來(lái)自V區(qū)的F 序列剪接起來(lái)實(shí)現(xiàn)人源化。所得的“工程化”抗體在人中比衍生所述工程化抗體的非人抗體具有更小的免疫原性并且因而更好地適于臨床用途。
人源化抗體可以是其中使用重組DNA技術(shù)將嚙齒類免疫球蛋白恒定區(qū)替換為人抗體恒定區(qū)的嵌合單克隆抗體。嵌合H鏈和L鏈基因隨后可以克隆到含有合適調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體并導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生充分糖基化的抗體。通過(guò)為該過(guò)程選擇適宜的人H鏈 C區(qū)基因，可以預(yù)先確定抗體的生物學(xué)活性。此類嵌合分子可以根據(jù)本發(fā)明用來(lái)治療或預(yù)防癌癥。抗體的進(jìn)一步人源化可以涉及抗體的⑶R移植或重構(gòu)。通過(guò)移植非人抗體的重和輕鏈CDR(其形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn))至人抗體的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)產(chǎn)生此類抗體。人源化抗體片段代表根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選物質(zhì)。可以通過(guò)篩選人抗體可變鏈的噬菌體文庫(kù)鑒定識(shí)別IFNa多肽或IFN受體上表位的人FAb。本領(lǐng)域已知的(例如由 Morphosys或Cambridge Antibody ^Technology開(kāi)發(fā)的)技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生可以作為本發(fā)明物質(zhì)使用的Fab。簡(jiǎn)而言之，人組合Fab抗體文庫(kù)可以通過(guò)將源自單鏈Fv文庫(kù)的重和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移至Fab展示載體產(chǎn)生。該文庫(kù)可以產(chǎn)生2. IXlOici種不同的抗體片段。該肽隨后可以用作“釣餌”從該文庫(kù)鑒定具有所需結(jié)合特性的抗體片段。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)代表可以根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案使用的另一種優(yōu)選物質(zhì)。 dAb是抗體的最小功能性結(jié)合單位并且對(duì)應(yīng)于人抗體重或輕鏈的可變區(qū)。此類dAb可以具有約13kDa的分子量(對(duì)應(yīng)于完整抗體的約1/10 (或更小)尺寸)。適配子代表本發(fā)明第三和第四方面的另一種優(yōu)選物質(zhì)。適配子是采取特定的序列依賴性形狀并且基于適配子與配體之間的鎖-鑰匹配而與特定靶配體結(jié)合的核酸分子。一般而言，適配子可以包含單鏈或雙鏈DNA分子(ssDNA或dsDNA)或單鏈RNA分子(ssRNA)。 適配子可以用來(lái)結(jié)合核酸靶和非核酸靶。因此，可以產(chǎn)生識(shí)別并因而降低IFNa的活性或表達(dá)的適配子?？梢詮碾S機(jī)序列匯集物選擇合適的適配子，從所述隨機(jī)序列匯集物中可以鑒定以高親和力與所選靶分子結(jié)合的特定適配子。用于產(chǎn)生和選擇具有所需特異性的適配子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括SELEX(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)法。簡(jiǎn)而言之，產(chǎn)生大的寡核苷酸文庫(kù)，從而允許通過(guò)反復(fù)的體外選擇過(guò)程并隨后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增來(lái)分離龐大數(shù)目的功能性核酸。反義分子代表用來(lái)治療患者的另一種優(yōu)選物質(zhì)。反義分子一般是這樣的單鏈核酸，該單鏈核酸可以與一種基因產(chǎn)生的互補(bǔ)核酸序列特異性結(jié)合并使該基因失活，從而有效地“關(guān)閉”該基因。如技術(shù)人員所理解，該分子稱作“反義”，原因是它互補(bǔ)于稱作“有義” 序列的該基因的mRNA。反義分子一般是15至35堿基長(zhǎng)度的DNA、RNA或化學(xué)類似物。反義核酸已經(jīng)實(shí)驗(yàn)地用來(lái)結(jié)合于mRNA并阻止特定基因的表達(dá)。這已經(jīng)導(dǎo)致發(fā)展“反義療法” 作為治療癌癥、糖尿病和炎性疾病的藥物。反義藥物最近已經(jīng)由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于人類治療用途。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)編碼IFN多肽的多核苷酸序列的反義分子，將有可能減少細(xì)胞中IFN α多肽的表達(dá)并因而降低IFN α活性和減少HCV感染中所見(jiàn)到的預(yù)激活。圖8中提供編碼IFNa多肽的多核苷酸序列。小的干擾性RNA (siRNA)，有時(shí)稱做短的干擾性RNA或沉默性RNA，代表根據(jù)本發(fā)明第三和第四方面使用的其他優(yōu)選物質(zhì)。如上所述，本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到IFN系統(tǒng)的預(yù)激活與抗病毒療法耐受有關(guān)。因而顯而易見(jiàn)，可以減少IFNa表達(dá)的siRNA分子在制備用于治療HCV 感染的藥物中具有巨大用途。siRNA是一類20-25核苷酸長(zhǎng)的參與RNA干擾途徑(RNAi) 的RNA分子，其中siRNA可以借助所述RNA干擾途徑引起特定基因的表達(dá)減少，或特異地干擾這種mRNA的翻譯，因而抑制由該mRNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。siRNA具有充分定義的結(jié)構(gòu)在任意末端具有2個(gè)核苷酸3’突出端的短(通常21個(gè)核苷酸)RNA雙鏈(dsRNA)。 每條鏈具有一個(gè)5’磷酸基團(tuán)和一個(gè)3’羥基(-0H)。在體內(nèi)，這個(gè)結(jié)構(gòu)是Dicer (—種將長(zhǎng) dsRNA或發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)變成siRNA的酶)加工的結(jié)果。siRNA也可以通過(guò)多種轉(zhuǎn)染方法外源 (人為)地導(dǎo)入細(xì)胞以引起目的基因的特異性敲低。因而基于與適宜定制的siRNA的序列互補(bǔ)性，可以靶向序列已知的基本上任何基因。鑒于基本上敲低任何目的基因的能力，借助 siRNA的RNAi已經(jīng)在基礎(chǔ)及應(yīng)用生物學(xué)中激起巨大興趣。設(shè)計(jì)旨在鑒定多種生物學(xué)途徑中重要基因的大規(guī)模RNAi篩選的數(shù)目日益增加。由于疾病過(guò)程也依賴于多個(gè)基因的活性，預(yù)期在一些情況下用siRNA關(guān)閉某基因的活性可能產(chǎn)生治療益處。因而它們的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致將RNAi用于生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)的興趣激增。治療性RNAi試驗(yàn)的最近I期結(jié)果表明 siRNA被良好地耐受并具有合適的藥代動(dòng)力學(xué)特性。siRNA和相關(guān)RNAi誘導(dǎo)方法因此代表在可見(jiàn)的未來(lái)變成一種重要的新類型藥物。針對(duì)編碼IFNa多肽的核酸所設(shè)計(jì)的siRNA分子可以用來(lái)減少IFNa的表達(dá)并因而導(dǎo)致減少IFN系統(tǒng)的預(yù)激活。因此，本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案是其中所述物質(zhì)是與IFNa多核苷酸具有互補(bǔ)序列的siRNA分子。使用如此信息，設(shè)計(jì)具有與IFNa多核苷酸互補(bǔ)的序列的siRNA分子是簡(jiǎn)單明了的并且完全在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如，簡(jiǎn)單的互聯(lián)網(wǎng)搜索提供了可以用來(lái)設(shè)計(jì)siRNA 分子的多個(gè)網(wǎng)址。"siRNA分子”包括20至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的雙鏈RNA分子，以及組成siRNA分子的兩條RNA單鏈中的每條鏈。例如，使用發(fā)夾RNA(shRNA)形式的siRNA。這種shRNA可以包含由間隔序列(例如約9個(gè)核苷酸長(zhǎng))連接的兩個(gè)互補(bǔ)siRNA分子。所述互補(bǔ)siRNA分子可以折疊從而它們
結(jié)合在一起。能夠切割編碼IFNa多肽的RNA或DNA的核酶代表本發(fā)明第三和第四方面的另一種優(yōu)選物質(zhì)?！笆茉囌摺笨梢允羌棺祫?dòng)物、哺乳動(dòng)物、家畜或人。優(yōu)選待治療的受試者是人。當(dāng)情況如此時(shí)，可以這樣設(shè)計(jì)所述物質(zhì)，從而它們最適合人療法(例如如上文討論的抗體人源化)。但是，也應(yīng)理解所述物質(zhì)也可以用來(lái)治療有獸醫(yī)意義的其他動(dòng)物(例如馬、駱駝、牛、 犬或貓)。如本文中提及的“可藥用載體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于配制藥物組合物的任
意生理學(xué)載體。技術(shù)人員施行本發(fā)明第一方面方法所需要的多種元件可以并入一個(gè)試劑盒中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于確定具有肝臟病毒性感染的受試者會(huì)應(yīng)答于抗病毒療法的可能性的試劑盒，所述抗病毒療法包括刺激干擾素(IFN)活性，該試劑盒包含(i)用于分析來(lái)自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具；和，任選地，(ii)用于比較該樣品中該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平與對(duì)照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296_5p的水平的工具?！坝糜诜治鰜?lái)自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具”包括特異性結(jié)合分子，所述的特異性結(jié)合分子可以靶向代表樣品中該miRNA例如miR-122 或miR496-5p水平的分子。在一些實(shí)施方案中，該特異性結(jié)合分子是上文提及的寡核苷酸探針、抗體、適配子或結(jié)合蛋白或小分子?！坝糜诒容^該樣品中該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平與對(duì)照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具”包括在本發(fā)明的第一方面中上文所提及的對(duì)照樣品。也包括本文中提及的對(duì)照參考數(shù)據(jù)。本發(fā)明的試劑盒也可以包含(iii)用于分析miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達(dá)水平的相關(guān)緩沖液和試劑。隨試劑盒提供的緩沖液和試劑可以是液體形式并且在一些實(shí)施方案中以預(yù)量取的等份樣提供。備選地，所述緩沖液和試劑可以是用于稀釋的濃縮(或甚至粉)形式。本文(包括后續(xù)任意權(quán)利要求、摘要和附圖)中所述的全部特征和/或披露的任意方法或過(guò)程的全部步驟可以與上述方面中任意者以任何組合方式組合，不包括其中此類特征和/或步驟中至少一些是相互排斥的組合。本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述，其中

圖1.慢性丙型肝炎(CHC)患者的肝臟中的miR-122表達(dá)。(A)miR-122水平在針對(duì)pegIFN α療法的原發(fā)性無(wú)應(yīng)答者(PNR)中顯著地低于具有完全早期病毒學(xué)應(yīng)答(cEVR)的患者。miR-122在42位CHC患者和6位無(wú)肝臟疾病的對(duì)照患者的肝臟中的量由RT-qPCR測(cè)量并表述為拷貝/IOpg總RNA。16位PNR患者和沈位 cEVR患者之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(ρ <0.0001)，如雙尾Marm Whitney t_檢驗(yàn)所確定。 cEVR患者和對(duì)照之間不存在顯著差異。(B)RNA酶保護(hù)測(cè)定法證實(shí)miR-122水平在PNR與cEVR患者之間的差異。源自4 位對(duì)照患者和8位CHC患者G位PNR和4位cEVR ；患者數(shù)目顯示在各分圖的頂部)的RNA 用針對(duì)miR-122 (上分圖)和let-7b (中間分圖)特異的探針?lè)治?。下部分圖中的柱代表了通過(guò)定量性磷成像法對(duì)每位患者確定的miR-122與let-7b RNA(來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)相似于上部和下部分圖中所示的那些平均數(shù))之間的相對(duì)比率。PNR患者顯示比cEVR患者和對(duì)照患者低3-4倍的miR-122水平。(C)血清HCV RNA水平與肝內(nèi)miR-122表達(dá)不相關(guān)。血清病毒載量(國(guó)際單位/ ml)以對(duì)數(shù)刻度作圖(y_軸)。相關(guān)性不顯著(ρ = 0.35)，相關(guān)系數(shù)r = 0.15。(D)肝內(nèi)HCV RNA水平與miR-122表達(dá)不相關(guān)。肝內(nèi)HCV RNA (拷貝/ μ g總肝臟 RNA)以對(duì)數(shù)刻度作圖(y_軸)。相關(guān)性不顯著(p = 0. 06，相關(guān)系數(shù)r = -0. 29)。(E)PegIFNa的施用沒(méi)有顯著影響人肝臟中的miR-122水平。通過(guò)RT-qPCR測(cè)量來(lái)自患有CHC的6位cEVR患者和5位PNR患者中的成對(duì)人肝臟活組織檢查樣品中的miR-122 水平(拷貝/IOpg總RNA)。首次肝臟活組織檢查在治療啟動(dòng)之前(-pegIFNa )進(jìn)行。在首次pegIFNa注射后4小時(shí)進(jìn)行第二次活組織檢查(+pegIFNa )。該圖顯示了每位患者的成對(duì)肝臟樣品(由一條線連接)中miR-122的水平。圖2.慢性丙型肝炎(CHC)患者的肝臟中的miR496-5p表達(dá)。miR496-5p水平在針對(duì)pegIFNa療法的原發(fā)性無(wú)應(yīng)答者(PNR)中顯著地高于具有完全早期病毒學(xué)應(yīng)答(cEVR)的患者。miR496-5p在42位CHC患者和6位無(wú)肝臟疾病的對(duì)照患者的肝臟中的量由RT-qPCR測(cè)量并表述為拷貝/IOpg總RNA。16位PNR患者和沈位cEVR患者之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(ρ < 0.0001)，如雙尾Marm Whitney t_檢驗(yàn)所確定。
實(shí)施例患者樣品和丙型肝炎治療從2006年10月至2008年3月，請(qǐng)求稱作巴塞爾大學(xué)醫(yī)院臨床肝臟外部患者 (outpatient)的CHC患者允許出于研究目的使用他們的診斷性肝臟活組織檢查樣品。用聚乙二醇化 IFNa 2b(pegIFNa ；Peglntron, EssexChemie AG，瑞士)和利巴韋林(Rebetol, Essex Chemie AG，瑞士 ；基于體重給藥< 65kg，800mg/d ；65_85kg，lg/d ； > 85kg, 1. 2g/d) 治療的42位患者提供了可用于重復(fù)RNA提取的足夠肝臟活組織檢查材料。他們?nèi)渴前追N人。這42患者中11位還同意首次注射pegIFNa后4小時(shí)進(jìn)行第二次肝臟活組織檢查。 該方案由巴塞爾大學(xué)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并從全部患者獲得書(shū)面的知情同意書(shū)。使用來(lái)自 Roche Molecular Systems 的COBASAmpliPr印/COBASTaqman HCV-Test，在治療啟動(dòng)前和在治療4周和12周時(shí)量化血清HCV RNA。在巴塞爾大學(xué)醫(yī)院病理學(xué)研究所根據(jù)Metavir 分類系統(tǒng)進(jìn)行HCV肝臟活組織檢查的組織學(xué)評(píng)級(jí)和分期。從6位患者取得非CHC健康對(duì)照組織，其中所述的患者接受超聲波引導(dǎo)肝臟活組織檢查病灶并且為該病灶外部的正常肝臟組織中的活組織檢查出具告知同意書(shū)。這些患者具有正常的肝臟值并且組織學(xué)地證實(shí)全部對(duì)照樣品不存在肝臟病變。選擇肝臟組織和Huh7細(xì)胞中用于量化的miRNA除miR-122之外，為量化和分析Huh-7細(xì)胞和人及小鼠肝臟樣品中的IFN作用所選擇的 miRNA 是 miR-1、miR-196、miR-296, miR-351 和 miR-448，它們均由 Pedersen 等人報(bào)道為INF-可誘導(dǎo)的(Pedersen IM等人，Nature 2007;449:919-922)。還報(bào)道這些miRNA (miR-1除外)中每一種miRNA的轉(zhuǎn)染降低了 Huh7細(xì)胞中HCV復(fù)制子RNA的量 (Pedersen IM 等人，Nature 2007;449:919-922)。據(jù)報(bào)道導(dǎo)致 HCV 復(fù)制子 RNA 產(chǎn)量減少的另一種miRNA是miR-431，但是我們沒(méi)有分析這種miRNA，因?yàn)橛糜谄淞炕臏y(cè)定法從Applied Biosystems不可獲得并且迄今為止，這種miRNA未曾鑒定為在肝臟或肝細(xì)胞中表達(dá)。同樣，沒(méi)有分析miR-30，因?yàn)樗远喾N形式(miR-30a、b、c、d和e)存在，但是 Pedersen等人沒(méi)有詳述分析的形式。此外，這種miRNA的過(guò)量表達(dá)對(duì)HCV RNA產(chǎn)量沒(méi)有影響(Pedersen IM 等人，Nature 2007;449:919-922)。雖然沒(méi)有指出 Pedersen 等人分析的具體miR-196和miR-296形式，我們選擇量化miR_196b (人肝癌細(xì)胞中所鑒定的兩個(gè) miR-196 特定克隆代表 miR-196b 并且不代表 miR-196a)和 miR-296_5p (Pedersen 等人也使用的Applied Biosystems Taqman 微RNA測(cè)定法可用于miR-296_5p，但不可用于miR496-3p)。除miR_196b之外，沒(méi)有從人肝臟或肝癌細(xì)胞分離出代表其他分析的 miRNA (miR-1、miR-^6、IiiiR-35I 和 miR-448)的克隆(參考文獻(xiàn) 3)。選擇Let_7b和miR-lfe作為預(yù)期在CHC中不受影響或不受IFN治療影響的對(duì)照 miRNA水平。小RNA的RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)qPCR量化分別使用Trizol 和 mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion，Austin，TX)，并根據(jù)制造商的方案，提取來(lái)自Huh7細(xì)胞和Huh7. 5細(xì)胞的總RNA部分和小RNA部分。通過(guò)在Trizol 試劑中均化10-30mg冰凍組織而分離來(lái)自人或小鼠肝臟的總RNA。使用NanoDrop分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies^H )量化 RNA 濃度。為了分析人和小鼠材料中l(wèi)et-7b、miR_15a、miR-122、miR-1、miR_196b、 miRj96-5p、miR-351和miR-448的表達(dá)(這些miRNA的序列在小鼠和人中是相同的)，使用了 Applied Biosystem Taqman microRNAAssay System (Applied Biosystems, Foster City, CA)。終體積7. 5μ 1的逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)含有Ix RT緩沖液、5ng RNA、50nM miRNA特異性的 RT 引物、0. 25mM 每種 dNTP、0. 25U/μ 1 RNA 酶抑制劑和 3. 33U/μ IMultiScribe RT, 在16°C孵育30分鐘，在42°C孵育30分鐘，在85°C孵育5分鐘并且隨后保持在4°C。全部逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，包括無(wú)模板對(duì)照，均一式三份進(jìn)行。使用Applied Biosystems Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)展實(shí)時(shí)PCR。10 μ 1 PCR包括0. 67 μ 1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、1 X Taqman通用PCR母混合物和1 μ 1引物和Taqman MicroRNA Assay的探針混合物。所述反應(yīng)在96孔光學(xué)平板中在95°C孵育5分鐘，隨后是40個(gè)循環(huán)95°C 15秒和60°C 60秒。使用默認(rèn)閾值設(shè)置確定Ct值。將循環(huán)閾值(Ct)定義為熒光通過(guò)固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)次數(shù)(fractional cycle number) 歸一化和miRNA拷貝數(shù)估計(jì)對(duì)每種樣品確定的Ct值針對(duì)所獲得的TORNA的平均Ct歸一化，所述的平均Ct從三次反應(yīng)計(jì)算出來(lái)。為確定miRNA拷貝數(shù)，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化的對(duì)應(yīng)于 let-7b、miR-15a、miR-122、miR-1、miR_196b、miR-296_5p、miR-351 和 miR-448 miRNA 的寡核苷酸(Microsynth，瑞士)，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。合成性RNA輸入量是從1. 3aM(等同于每個(gè)反應(yīng)7個(gè)拷貝)至13pM(每個(gè)反應(yīng)7X107個(gè)拷貝)并且使用如上文所述的Applied Biosystems Prism 7000，通過(guò)Taqman 微RNA測(cè)定法一式兩份分析所述反應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證用分離的合成性miRNA所進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化，含有來(lái)自HeLa細(xì)胞或小鼠視網(wǎng)膜的5ng總 RNA的反應(yīng)用遞增濃度(1.3aM至13pM)的合成性miR-122內(nèi)標(biāo)并由Taqman 微RNA測(cè)定法分析。如不添加合成性miR-122 RNA的對(duì)照反應(yīng)所確定，HeLa細(xì)胞和小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中不表達(dá)MiR-122。在“載體”RNA存在或不存在下獲得的多條標(biāo)準(zhǔn)曲線之間未觀察到差異 (數(shù)據(jù)未顯示)。使用適宜的標(biāo)準(zhǔn)化曲線，從不同反應(yīng)獲得的Ct值被轉(zhuǎn)換成每IOpg來(lái)自肝臟組織的總RNA或每一單個(gè)Huh7細(xì)胞的特定miRNA的絕對(duì)拷貝數(shù)。當(dāng)指出時(shí)，miRNA的回收率進(jìn)一步對(duì)肝細(xì)胞特異性白蛋白mRNA的水平歸一化。用于人白蛋白R(shí)T-qPCR的引物是 TTGGAAAAATCCCACTGCAT (SEQ ID NO :1)和 CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC(SEQ ID NO :2)。使用 SYBR 綠 PCR 母混合物(Applied Biosystems, Foster City, CA)，開(kāi)展 SYBR-PCR 反應(yīng)。為確定每個(gè)Huh7細(xì)胞的各種miRNA的拷貝數(shù)，通過(guò)3種不同方法計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的總RNA回收率。對(duì)于頭兩種方法，使用CASYl細(xì)胞計(jì)數(shù)器，根據(jù)制造商的方案(Scharfe System，德國(guó))計(jì)數(shù)細(xì)胞并且使用Trizol或mirVana試劑盒從已知數(shù)目的細(xì)胞提取RNA。在第三種方法中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞并且通過(guò)Trizol提取RNA。使用不同數(shù)目的用于RNA提取的細(xì)胞，一式三份開(kāi)展全部三種方法。樣品用標(biāo)記的RNA內(nèi)標(biāo)以確定RNA回收率。這三種方法產(chǎn)生每細(xì)胞以下量的總 RNA 13. 8+/-3. 5pg、14. 52+/-2. 65pg禾口 13. 98+/-2. 37pg。 平均值14. Ipg/細(xì)胞用于其他計(jì)算。該值低于Chang等人先前用于計(jì)算肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞
22中miR-122含量的25pg RNA/細(xì)胞。但是，它屬于對(duì)不同發(fā)育期的小鼠T淋巴細(xì)胞(0.67 至6.82pg/細(xì)胞)或?qū)π∈驟S細(xì)胞QOpg/細(xì)胞)計(jì)算的值范圍。為確定每細(xì)胞的小RNA( < 200nt)含量，通過(guò)不同方法獲得的總Huh7細(xì)胞RNA 經(jīng)mirVana 試劑盒分級(jí)。計(jì)算出單個(gè)Huh7細(xì)胞含有1. 125pg的小RNA (確定范圍從1. 05 至1. 2pg/細(xì)胞的平均數(shù))。與Brown等人所確定的值相似的這個(gè)值用來(lái)相對(duì)于miRNA 拷貝/細(xì)胞而再計(jì)算miRNA拷貝的數(shù)目/IOpg小RNA (如Brown等人也使用Applied BiosystemTaqman 測(cè)定法所確定的)。我們注意到由 Applied BiosystemTaqman 測(cè)定法確定的每細(xì)胞中miRNA拷貝的值傾向于比RNA酶保護(hù)法所確定的那些值低(我們未發(fā)表的結(jié)果)。這歸因于以下事實(shí)Applied BiosystemTaqman 系統(tǒng)不檢測(cè)特定miRNA 的具有相同效力的各個(gè)3’端序列變體(未發(fā)表的結(jié)果)。通過(guò)RNA酶保護(hù)測(cè)定法檢測(cè)miRNA使用mirVana miRNA探針構(gòu)建和檢測(cè)試劑盒(Ambion)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RNA酶保護(hù)測(cè)定法(RPA)。用于制備RPA探針的引物是let_7b，TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT CCTGTCTC(SEQ ID NO 3)；和 miR-122，TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCCTGTCTC(SEQ IDNO :4)。 簡(jiǎn)而言之，RPA反應(yīng)含有5 fmol (100, OOOcpm)的內(nèi)部標(biāo)記的且PAGE純化的RPA探針和1 μ g 肝臟總RNA。在42°C過(guò)夜實(shí)施雜交并且RNA酶A/T1消化在37°C持續(xù)20分鐘。受保護(hù)的片段通過(guò)12% PAGE在變性條件下分析，隨后是磷成像儀(Typhoon，Molecular Dynamics)定
fioISGmRNA水平的確定從人或小鼠肝臟組織提取的總RNA用于量化作為IFN作用的量度的“經(jīng)典” ISG mRNA (PKR、OASl、STATl和S0CS1)。該RNA由莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (Promega Biosciences, Inc. , Wallisellen,瑞士)在隨機(jī)六聚體(Promega)禾口脫氧三磷酸核苷存在下逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)在70°C孵育5分鐘，隨后在37°C孵育1小時(shí)，并且通過(guò)在95°C加熱5分鐘終止。使用STOR綠PCR母混合物(Applied Biosystems)和跨越外顯子-內(nèi)含子交界以避免擴(kuò)增基因組DNA的引物，進(jìn)行STOR-PCR反應(yīng)。以下引物用于小鼠(m)基因核糖體蛋白 L-19 (mRPL-19)，ATCCGCAAGCCTGTGACTGT (SEQ ID NO 5)和 TCGGGCCAGGGTGTTTTT(SEQ ID NO 6) ；mPKR, TGATAACGAAAACAAGGTGGATTG(SEQ ID NO 7)和 ACAAGGCCTATGTAGTTACCAACGA(SEQ ID NO 8) ；mOASl,CACCCA GTGAGGGTCTCCAA(SEQ ID N0: 9)和 CCCTTGAGTGTGGTGCCTTT(SEQ ID NO :10) ；mSTATl, CGGCGCAGAGAGATTTGC(SEQ ID N0: 11)和AGCTGAAACGACTGGC TCTCA(SEQ ID NO 12)。針對(duì)人(h)基因的引物是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(hGAPDH) ；GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA (SEQ ID NO 13)和 ACCTTCCCCATGGTGTCTGA (SEQ ID N0:14) ；hPKR, T G A T T A T C T G C G T G C A T T T T G G ( S E Q ID NO 1 5)禾口 GCTGAAAGATCACCAGCCATTT(SEQ ID N0:16) ；hOASl, TGATGCCCTGGGTCAGTTG(SEQ ID NO 17) 和 TCGGTGCACTCCTCGATGA(SEQ ID NO 18) ；hSOCSl, CCCCTTCTGTAGGATGGTAGCA(SEQ ID N0: 19)和 TGCTGTGGAGACTGCATTGTC(SEQ ID NO :20) ；hSTATl,TCCCCAGGCCCTTGTTG(SEQ ID N0: 21)和CAAGCTGCTGAAGTTGGTACCA(SEQ ID NO :22) ；hIP10 ；CGATTCTGATTTGCTGCCTTAT(SEQ ID NO 23)和 GCAGGTACAGCGTACGGTTCT(SEQ ID NO 24) ；hUSP18, CTCAGTCCCGACGTGGAACT(SEQ ID NO 25)和ATCTCTCAAGCGCCATGCA(SEQ ID NO :26) ；hIFI27,CCTCGGGCAGCCTTGTG(SEQ ID NO :27)和AATCCGGAGAGTCCAGTTGCT(SEQ ID NO :28)。通過(guò)從目的轉(zhuǎn)錄物的Ct值中扣除
23充當(dāng)內(nèi)部對(duì)照的hGAPDH或mRPL-19的Ct值而獲得循環(huán)閾值的差(Δ Ct)。使用Applied Biosystems Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)，一式兩份進(jìn)行全部反應(yīng)。使用公式2_Δ"，從Δ Ct 值相對(duì)于hGAPDH或mRPL-19計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)公式2~(ACt B-I-ACt B_2)，將成對(duì)肝臟活組織檢查樣品中的表達(dá)變化計(jì)算為倍數(shù)變化。肝內(nèi)HCV RNA的定量使用設(shè)計(jì)用于體外定量全部HCV亞型的病原體特異性RT引物混合物(HCV定量試劑盒，PrimerDesign Ltd，南安普頓，英國(guó))，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄從42位CHC和 6位對(duì)照患者的活組織檢查樣品中分離的IygS RNA。使用病原體特異性引物/探針混合物O^rimerDesign Ltd)和Taqman 通用PCR母混合物(美國(guó)新澤西州Roche制造的 AppliedBiosystems)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)定量 HCV RNA。通過(guò) AppliedBiosystems 7000 序列檢測(cè)系統(tǒng)的FAM通道檢測(cè)熒光并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每IygS RNA的HCV RNA拷貝， 其中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用病原體陽(yáng)性對(duì)照模板O^rimerDesign Ltd)獲得。
權(quán)利要求
1.用于確定具有肝臟病毒性感染的受試者將應(yīng)答于包括刺激干擾素(IFN)活性的抗病毒療法的可能性的方法，該方法包括(a)分析來(lái)自該受試者的樣品的miRNA表達(dá)水平，和(b)比較來(lái)自該受試者的樣品中所述miRNA的表達(dá)水平與對(duì)照樣品中所述miRNA的水平。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中miRNA是miR122并且其中與對(duì)照樣品中miR-122的水平相比，來(lái)自該受試者的樣品中較低的miR-122水平表明該受試者很可能不應(yīng)答于所述抗病毒療法。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中miRNA是miR-296_5p并且其中與對(duì)照樣品中 miR-296-5p的水平相比，來(lái)自該受試者的樣品中較高的miR-296_5p水平表明該受試者很可能不應(yīng)答于所述抗病毒療法。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中分別與對(duì)照樣品中miR-122和/或 miR-296-5p的水平相比，來(lái)自該受試者的樣品中分別未改變或升高的miR-122水平和/或未改變或降低的miR-296-5p水平表示該受試者可能應(yīng)答于所述抗病毒療法。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中抗病毒療法包括聚乙二醇化的 IFNa (peglFNa)，其任選地與利巴韋林聯(lián)合。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中病毒性感染是乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。
7.權(quán)利要求4的方法，其中病毒是丙型肝炎病毒。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中樣品包含肝臟組織。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中也分析了可預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法的基因的表達(dá)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中通過(guò)測(cè)量樣品中mRNA基因轉(zhuǎn)錄物的量或從所述mRNA衍生的cDNA的量確定基因表達(dá)。
11.權(quán)利要求9或10所述的方法，其中通過(guò)測(cè)量樣品中由該基因編碼的肽或多肽的量確定基因表達(dá)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中使用特異性結(jié)合分子確定肽或多肽的量。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是人。
14.用于實(shí)施權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，包含⑴用于分析來(lái)自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR-296-5p的表達(dá)水平的工具；和，任選地，(ii)用于比較來(lái)自受試者的樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296-5p的水平與對(duì)照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296_5p的水平的工具。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒，還包含用于分析可預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法的至少一種基因的表達(dá)的工具，最終包含一種或多種特異性結(jié)合分子，所述的特異性結(jié)合分子能靶向代表所述至少一種基因的分子，所述的至少一種基因可預(yù)測(cè)受試者應(yīng)答于療法，其中所述的特異性結(jié)合分子是寡核苷酸探針、抗體或適體；和任選地，用于比較樣品中所述基因的表達(dá)與對(duì)照樣品中相同基因的表達(dá)的工具。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及用于確定抗病毒療法是否會(huì)有效的方法。特別地，本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂胢iRNA例如miR-122或miR-296-5p，用于確定具有肝臟病毒性感染的受試者會(huì)應(yīng)答于抗病毒療法的可能性的方法，所述抗病毒療法包括刺激干擾素(IFN)活性，并且提供了用于實(shí)施所述確定的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102159725SQ200980133061
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者I·馬爾基維茨, J·科洛爾, M·海姆, M·薩拉森-菲利波維奇, W·菲利波維奇 申請(qǐng)人:巴塞爾大學(xué)醫(yī)院, 諾瓦提斯研究基金會(huì)弗里德里克·米謝爾生物醫(yī)學(xué)研究所