專利名稱：一種hpv18l1多核苷酸序列及其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種HPV18L1多核苷酸序列，還包括一種表達(dá)載體和宿主細(xì)胞及其多核苷酸序列、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在制藥和制劑方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在多種物種包括綿羊，狗，兔子，猴子，牛和人中已發(fā)現(xiàn)乳頭瘤病毒的感染。人乳頭瘤病毒(簡稱HPV)已分出上百個型別，如果LI基因與以前鑒定的型別的LI序列的同一性低于90%，那么這種型別可確定為新的型別，如果LI氨基酸序列同一性是在90到98%之間則為亞型，同一性在98%以上為變體[與原型(親代類型)相比]。
人乳頭瘤病毒是一類具有嚴(yán)格宿主范圍和組織特異性的DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)100多種亞型。致病HPV的類型主要有6，11，16，18等。依據(jù)HPV能否致癌可將其分為致癌的高危型和不致癌的低危型兩類。低危型HPV主要包括6，11，13，32，42，43，44等。高危型HPV 主要包括 16，18，45，52，56，58 等。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料表明，宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中位居第二，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位；每年全球大約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，約20萬人死于宮頸癌，其中，80%的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)有宮頸癌病人約13. 8萬，每年約有5萬人死于宮頸癌。大量研究資料證明，生殖道的人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系-約80%的宮頸癌與4種類型(16、18、31型和45型)的HPV感染有關(guān)，其中，50%的宮頸癌與HPV16感染相關(guān)。目前，對中晚期宮頸癌的化療和手術(shù)治療效果也不理想。宮頸癌的復(fù)發(fā)率較高且治療費(fèi)用也高。2005年，美國約有I萬例新確診的宮頸癌患者，約有3700例患者死亡。在大多數(shù)人中，人乳頭瘤病毒可于感染后自行消失。然而，少數(shù)情況下，某些高危類型的人乳頭瘤病毒如果未被檢出和治療，可以導(dǎo)致宮頸癌。此夕卜，某些低危類型的人乳頭瘤病毒可以導(dǎo)致尖銳濕疣。在美國，每年用于宮頸癌篩查和治療的費(fèi)用約為5. 7億美元，每年約有100萬例尖銳濕疣，約有470萬女性由于巴氏涂片檢查(Pap)結(jié)果異常需要進(jìn)行隨訪，其中，至少有300萬例此類異常結(jié)果是由某些人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的。HPV是一種小的DNA病毒，直徑45_55nm，衣殼呈二十面體立體對稱，沒有囊膜，完整的病毒顆粒氯化銫中浮密度為I. 34g/mL，在密度梯度離心時易與無DNA的空殼(密度1.29g/mL)分開。HPV基因組是一閉環(huán)雙股DNA，分子量5*106道爾頓。按功能可分為早期(E區(qū))，晚期(L區(qū))和非編碼區(qū)(NCR)三個區(qū)域，E區(qū)分為E1-E7開放閱讀框架，主要編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白。例如El蛋白是一種DNA解旋酶，參與病毒DNA復(fù)制過程的起始，E2是一種調(diào)控蛋白，控制病毒基因的表達(dá)和DNA的復(fù)制。E2通過其既結(jié)合El又結(jié)合病毒復(fù)制起點(diǎn)的作用，使El在所述起點(diǎn)局部聚集，從而，刺激病毒DNA的復(fù)制起始。E4蛋白具有多種沒確定的功能，但結(jié)合宿主細(xì)胞骨架屬于上述功能，E5延遲體內(nèi)的酸化，導(dǎo)致細(xì)胞表面的EGF受體表達(dá)增加，已知E6和E7各自都能結(jié)合細(xì)胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成與宮頸癌有關(guān)的HPV型別，是已知的致癌基因。NCR是E區(qū)與L區(qū)間-6. 4-1. Okp的DNA片段，可負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控。L區(qū)分LI和L2，分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。已經(jīng)鑒定LI和L2基因是好的免疫預(yù)防靶，對于綿尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)系統(tǒng)的研究表明，用細(xì)菌中表達(dá)的LI和L2蛋白或使用疫苗載體的免疫方法能保護(hù)動物不受病毒感染。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人乳頭狀瘤病毒LI基因或使用疫苗載體導(dǎo)致組裝成病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒已經(jīng)用于誘導(dǎo)與保護(hù)免受病毒侵襲有關(guān)的高效價病毒中和抗體應(yīng)答。大量研究已表明，VLPs具有良好的免疫原性和反應(yīng)性，高誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，以此為基礎(chǔ)來研制疫苗顯得很有前途。LI基因編碼的主要衣殼蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，可避免機(jī)體再受同型別HPV的感染。疫苗在歷史上一直被視為預(yù)防病原體感染的一種方式，如果發(fā)生感染，疫苗可激發(fā)免疫系統(tǒng)，以識別并中和病原體。疫苗包含一種或多種來自病原體的抗原，通常是已滅活的或減毒的完整生物體，或者是來自所述生物體的特定抗原肽，當(dāng)將免疫系統(tǒng)暴露于抗原時，產(chǎn)生使個體終生保持對所述抗原免疫記憶的細(xì)胞。再次接觸相同抗原包括感染所述病原體時刺激特異性免疫應(yīng)答，從而清除感染的病原體或使感染的病原體失活。有關(guān)HPV的基礎(chǔ)研究的高峰期已經(jīng)過去，應(yīng)用時代包括診斷和疫苗的臨床應(yīng)用正 在走來，特別是高危型如HPV16U8的預(yù)防性疫苗產(chǎn)品即將得到越來越廣泛的臨床使用甚至是廣泛普及。截至目前，世界上開發(fā)成功的宮頸癌疫苗主要是兩種預(yù)防性疫苗一種是Merck(默克)藥廠研制的四價疫苗，主要針對引起宮頸癌的兩個HPV高危型16、18和引起生殖道尖銳濕疣的兩個HPV低危型6、11 ;另一種是GSK (葛蘭素)藥廠研制針對HPV高危型16、18的二價疫苗，2006年6月先后獲得歐洲與美國FDA的批準(zhǔn)上市。默克公司應(yīng)用啤酒酵母和葛蘭素史克公司應(yīng)用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒研發(fā)的人乳頭瘤病毒疫苗都已上市，主要在歐洲免疫接種，一人份的費(fèi)用是350美元，這個價格在我國顯然太高，不能被普通大眾接受。對于基因工程蛋白疫苗的研制，除了目的基因的選擇之外，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇也同樣重要。對于整合表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的LI蛋白，可自我組裝成VLPs。目前國際上研究較多，適合工業(yè)化生產(chǎn)的是酵母表達(dá)系統(tǒng)，它不僅具有原核表達(dá)系統(tǒng)快捷、方便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，并且兼有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工、修飾等特點(diǎn)，使表達(dá)的LI蛋白能自我組裝成VLPs，具有良好的抗原性。本發(fā)明中使用的表達(dá)系統(tǒng)中宿主細(xì)胞為漢遜酵母(Hansenula polymorpha),甲醇酵母是近幾年逐漸發(fā)展起來的一類作為細(xì)胞工廠表達(dá)外源基因特別是真核生物基因的理想宿主，其中多形漢遜酵母是當(dāng)前國際上公認(rèn)的最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白，漢遜酵母的技術(shù)優(yōu)勢和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值可歸納為(I)最適生長溫度高(37 43°C，畢赤酵母與釀酒酵母為28°C)，生長速率快，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，可以高效表達(dá)許多在其它系統(tǒng)中難以高效表達(dá)的基因。(2)外源基因整合于細(xì)胞染色體中，重組菌株有絲分裂遺傳穩(wěn)定性高。(3)能利用廉價的化學(xué)合成培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞高密度發(fā)酵，不需要添加價格昂貴的天然組分(如酵母粉、蛋白胨)，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本并提高了外源基因的表達(dá)水平。易于培養(yǎng)，能夠在廉價培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，菌體密度高達(dá)100 130g/L干重。(4)具有自主復(fù)制序列(HARS)，重組的頻率高，重組質(zhì)?？梢愿呖截愓系饺旧w上，易獲得高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。漢遜酵母能夠按一定的基因劑量比分步整合多個基因，重組菌可按最佳的比例表達(dá)所需基因，對進(jìn)行多基因改造提供了有利條件。(5)多形漢遜酵母具有遺傳操作簡單、外源基因拷貝數(shù)高、外源蛋白產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，是一個已得到廣泛關(guān)注的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。(6)在分泌型表達(dá)中，外源蛋白通過分泌途徑可完成蛋白水解成熟、糖基化修飾和二硫鍵形成等翻譯后加工過程 ，使所表達(dá)的蛋白更接近具有生物學(xué)活性的天然蛋白形式。(7)與釀酒酵母相比，多形漢遜酵母在表達(dá)糖蛋白方面具有顯著優(yōu)勢，其本身的甘露糖鏈總長度比較短，糖基化修飾比較簡單，易于進(jìn)行糖基化改造。(8)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子和甲醛脫氫酶基因(FMD)啟動子等強(qiáng)啟動子，高效地啟動外源基因的表達(dá)。蛋白的表達(dá)通常在過氧化物酶體內(nèi)進(jìn)行，可使其免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，并降低了對細(xì)胞的毒害作用。(9)耐高溫，最適生長溫度為37_43°C，生長速率快，大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)時間短。發(fā)酵中以甘油或甲醇為唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，發(fā)酵染菌率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種HPV18L1多核苷酸序列，該序列編碼HPV18L1氨基酸序列，從而使利用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)HPV18L1衣殼蛋白成為現(xiàn)實(shí)，相對于目前采用的其他真核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)率更高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種對應(yīng)的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種宿主細(xì)胞。本發(fā)明的又一目的是提出所述HPV18L1多核苷酸序列和對應(yīng)的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞在制藥和制劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明是技術(shù)方案如下首先，提供了一種HPV18L1多核苷酸序列，如SEQID NO. 2所示，該序列如下ATGGCCCTGTGGAGACCATCCGACAACACCGTCTACCTGCCACCACCATCCGTCGCCAGAGTCGTCAACACCGATGACTACGTCACCAGAACCTCCATCTTCTACCACGCTGGCTCCTCCAGACTGCTGACCGTCGGCAACCCATACTTCAGAGTCCCAGCGGGCGGTGGCAACAAGCAGGACATTCCAAAGGTCTCCGCTTACCAGTACAGAGTCTTCAGAGTCCAACTGCCAGACCCAAACAAGTTCGGCCTCCCAGACACCTCCATCTACAACCCAGAGACCCAGAGACTGGTGTGGGCTTGCGCTGGCGTCGAGATCGGCAGAGGACAGCCACTGGGCGTTGGCCTGTCGGGCCACCCATTCTACAACAAGCTTGACGACACCGAGTCCTCCCACGCCGCCACCTCCAACGTCTCCGAGGATGTCAGAGACAACGTCTCCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGCCCCAGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCGCTTGCAAGTCCAGACCACTGTCCCAGGGCGACTGCCCACCACTGGAGCTGAAAAACACCGTCCTGGAAGACGGCGACATGGTCGACACCGGCTACGGCGCCATGGATTTCTCTACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTCCCACTCGACATCTGCCAGTCCATCTGCAAGTACCCAGACTACCTCCAAATGTCCGCCGACCCATACGGCGACTCCATGTTCTTTTGCCTGAGAAGAGAGCAGCTGTTCGCCAGACACTTCTGGAATAGAGCCGGCACCATGGGCGACACCGTCCCACAGTCCCTGTACATCAAGGGCACCGGCATGAGAGCCTCCCCTGGCTCCTGCGTCTACTCCCCATCCCCATCGGGCTCCATCGTCACCTCCGACTCCCAGCTGTTCAACAAGCCATACTGGCTGCACAAGGCCCAAGGCCACAACAACGGCGTCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTCACCGTCGTCGACACCACCAGATCCACCAACCTGACCATCTGCGCCTCCACCCAGTCCCCAGTCCCAGGTCAGTACGACGCTACCAAGTTCAAGCAGTACTCCAGACACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGACGTCATGTCCTACATCCACTCCATGAACTCCTCCATTCTTGAGGATTGGAACTTTGGCGTCCCA
CCACCACCAACCACCTCCCTGGTCGACACCTACAGATTCGTCCAGTCCGTCGCCATCACCTGCCAGAAGGACGCTGC
CCCAGCCGAGAACAAGGACCCATACGACAAGCTGAAATTCTGGAACGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCTCGCTGGACC
TTGACCAGTACCCACTGGGCAGAAAGTTCCTGGTGCAGGCAGGACTGAGAAGAAAGCCAACCATCGGCCCAAGAAAG
AGATCCGCCCCATCCGCCACCACCTCCTCCAAGCCAGCCAAGAGAGTCAGAGTCAGAGCTAGAAAGTAA該多核苷酸序 列的密碼子使用通過表達(dá)宿主菌株漢遜酵母基因的密碼子偏愛方式優(yōu)化。本發(fā)明提供的編碼HPV18L1多核苷酸序列，密碼子使用方式參照高表達(dá)的漢遜酵母基因的密碼子偏愛模式人工設(shè)計得到。人工設(shè)計時期望所述多核苷酸序列的密碼子使用與高表達(dá)的漢遜酵母基因的密碼子使用方式更加接近。所述多核苷酸序列是雙鏈DNA序列，所述優(yōu)選多核苷酸序列編碼人乳頭瘤病毒18型LI，因此，本發(fā)明提供了一種合成基因，該基因包含開放閱讀框編碼HPV18L1氨基酸序列，其中通過選擇使可能用于編碼所述氨基酸序列的密碼子類似漢遜酵母的優(yōu)化密碼子，以使在合成基因中密碼子的使用頻率極類似于高表達(dá)的漢遜酵母基因，而不是人乳頭瘤病毒基因。所述密碼子使用與高表達(dá)的漢遜酵母基因使用系數(shù)最大或次大的密碼子。將HPV18L1氨基酸序列全長508氨基酸，轉(zhuǎn)換為漢遜酵母偏愛密碼子模式的核苷酸序列，首選兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一位的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數(shù)情況使用第三位的密碼子完成局部調(diào)整，利用DNAMAN軟件避免過長互補(bǔ)序列、重復(fù)序列，通過RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測，避免過長復(fù)雜的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，排除強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)，增加特異性的分子內(nèi)部穩(wěn)定性。基因的核苷酸序列中還避免出現(xiàn)可能對基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯效率帶來不利影響的序列，如內(nèi)含子剪接序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、內(nèi)部啟動子序列(TATA)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(GGAGG)等。轉(zhuǎn)錄終止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG(富含 T)TA(G)GT、(富含 AT) TTT 等。本發(fā)明提供了序列2的多核苷酸序列，對應(yīng)附圖2所示氨基酸序列，保持了漢遜酵母基因的密碼子偏愛性。還提供了一種多肽，它包含所述的HPV18L1多核苷酸序列。該多肽包含一種或多種點(diǎn)突變，從而使該多肽的一種或多種天然的生物功能表達(dá)物利于純化工藝和后續(xù)疫苗制備。進(jìn)一步，所述多肽包含HPV18晚期基因產(chǎn)物的全部或一部分。進(jìn)一步，上述的多核苷酸序列，以高表達(dá)的漢遜酵母基因的偏愛密碼子使用系數(shù)為參照，首選兼并密碼子中漢遜酵母使用系數(shù)最大的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數(shù)情況使用第三位的密碼子。同時，上述多核苷酸序列為保持了漢遜酵母密碼子偏愛使用方式的片段或類似物。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，它包含上述的多核苷酸序列，該多核苷酸序列與載體調(diào)控序列可操作連接，所述調(diào)控序列能使宿主細(xì)胞表達(dá)該多核苷酸序列。所述的表達(dá)載體，它能使所述多核苷酸序列在漢遜酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸序列并能夠引導(dǎo)該多核苷酸序列的表達(dá)，該多核苷酸序列編碼HPV18L1氨基酸序列，所述表達(dá)載體是PMPT-HPV18L1，其構(gòu)建方法如附圖5所示。所述表達(dá)載體還包括的漢遜酵母甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子、甲醇氧化酶基因(MOX)終止子、I. Okb的自主復(fù)制序列HARS、脲嘧啶基因ScURA3及pBluescrip II質(zhì)?；驇讉€元件?？梢詫⒏鞣N方法用于上述元件中HPV18L1基因的分子克隆、突變與鑒定。這些方法包括，但不限于，在合成HPV18L1人工序列后所構(gòu)建含HPV18L1基因的細(xì)菌(如JM109、DH5a等)的cDNA或基因組DNA文庫，在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體系統(tǒng)中可直接完成HPV18L1基因的功能表達(dá)。另一個方法包括用編碼HPV18L1的部分DNA篩選質(zhì)粒穿梭載體在細(xì)菌或漢遜酵母中構(gòu)建的含HPV18L1的cDNA或基因組DNA文庫。這一部分DNA是根據(jù)上述漢遜酵母優(yōu)選HPV18L1核苷酸序列的設(shè)計的寡核苷酸引物，通過特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增HPV18L1的DNA片段得到的。另一個方法是從產(chǎn)生HPV18L1的細(xì)胞分離RNA并通過體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)將RNA翻譯成蛋白質(zhì)。將RNA翻譯成肽或蛋白質(zhì)將導(dǎo)致產(chǎn)生至少一部分的HPV18L1蛋白，這部分HPV18L1蛋白可以通過與抗HPV18L1抗體的免疫反應(yīng)性得到鑒定。在這一方法中可以分析從產(chǎn)生HPV18L1細(xì)胞分離的RNA庫中至少編碼一部分HPV18L1的RNA的存在,可以進(jìn)一步分級分離RNA庫以便從中純化HPV18L1RNA，分析這一方法產(chǎn)生的肽或蛋白質(zhì)，以提供氨基酸序列，這些氨基酸序列用于提供生產(chǎn)HPVlSLlcDNA的引物，或可以分 析用于翻譯的RNA，它提供編碼HPV18L1的核苷酸序列并產(chǎn)生用于篩選HPV18LlcDNA文庫的探針。這些方法是本領(lǐng)域已知的并能在例如《分子克隆》(實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，1989)中找到。通過分子克隆方法得到的克隆HPV18L1DNA或其突變體片段，要插入所述表達(dá)載體，該載體含有適當(dāng)?shù)?MOX)啟動子和其它適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件如(MOX)終止子、自主復(fù)制序列HARS、尿嘧啶基因URA3及pBluescrip II質(zhì)?；?。所述表達(dá)載體按照分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)來構(gòu)建，例如，可使用質(zhì)粒DNA和適當(dāng)?shù)钠鹗济艽a子，啟動子，增強(qiáng)子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信號，將它們以正確的方向連接后具有調(diào)控功能，以便實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)。適當(dāng)?shù)妮d體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含上述的多核苷酸序列或表達(dá)載體。所述宿主為一種零回復(fù)突變的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型多型漢遜酵母受體菌株，應(yīng)用基因敲除技術(shù)建立的URA3-營養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞株HU-II。所述的宿主細(xì)胞具有表達(dá)載體能夠補(bǔ)償用于轉(zhuǎn)化子篩選的URA3營養(yǎng)缺陷。本發(fā)明還提出了上述的多核苷酸序列對應(yīng)產(chǎn)物在治療或預(yù)防HPV感染制劑方面應(yīng)用。本發(fā)明還提出了上述多核苷酸序列或多肽或表達(dá)載體或宿主細(xì)胞在治療或預(yù)防皮疣，非典型鱗狀細(xì)胞，宮頸發(fā)育異常，頸上皮內(nèi)瘤形成或?qū)m頸癌藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及漢遜酵母表達(dá)HPV18L1多肽、多肽片段或其類病毒顆粒在制備宮頸癌疫苗中的用途。有多種適用的漢遜酵母表達(dá)HPV18L1多肽、多肽片段或其類病毒顆粒純化方法。包括但不限于鹽分級分離，離子交換層析，分子篩層析，羥磷灰石吸附層析、疏水作用層析和親和層析(通過使用特異于全長HPV18L1、HPV18L1的多肽片段的單克隆或多克隆抗體制成的免疫親和柱，或融合特異蛋白標(biāo)簽的全長新生HPV18L1、HPV18L1的多肽片段使用特異于標(biāo)簽的親和柱)的各種組合或分別應(yīng)用，從細(xì)胞溶胞物和提取液中純化漢遜酵母重組HPV18L1 蛋白。
DNA代碼有4種(A、T、C和G)，其中每三個字母組成的密碼子代表生物體的基因所編碼的蛋白的氨基酸。沿DNA分子線性排列的密碼子被翻譯成所述基因所編碼的蛋白質(zhì)中氨基酸的線性序列。密碼子有高度的簡并性，61種密碼子編碼20種天然氨基酸。因此，大部分氨基酸由一種以上的密碼子編碼-實(shí)際上數(shù)種氨基酸由4種或更多種不同的密碼子編碼。由于遺傳密碼是簡并的，一個以上的密碼子可用于編碼特定的氨基酸，所以，氨基酸序列可以被任何一組類似的DNA寡核苷酸編碼。當(dāng)有一種以上的密碼子編碼一種特定的氨基酸時，不同物種在密碼子的選擇方面顯示不同的偏愛性，且密碼子的使用在物種的高水平表達(dá)和低水平表達(dá)的基因之間也有顯著的不同。例如，在細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的病毒基因具有對于有效的表達(dá)來說不適當(dāng)?shù)拿艽a子分布。已發(fā)現(xiàn)數(shù)例將宿主中罕見的密碼子更改為宿主優(yōu)選的密碼子提高了異源表達(dá)水平的情況。如果異源DNA序列中存在宿主中罕見的密碼子，那么異源基因在所述宿主中的低水平異源表達(dá)可能性很大。有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)包括兩個主要元件啟動外源基因高效表達(dá)的載體系統(tǒng)和具有特定篩選標(biāo)記的宿主細(xì)胞。由于多形漢遜酵母同源重組的頻率較低，只有當(dāng)兩側(cè)的同源序列大于Ikb時才可能利用類似于釀酒酵母的基因破壞法獲得基因阻斷突變株，因此目前使用的營養(yǎng)缺陷型菌株多是通過化學(xué)誘變得到的，它們突出的缺點(diǎn)是遺傳穩(wěn)定性較低，難于獲得理想的轉(zhuǎn)化子，而且可能存在多重突變效應(yīng)，使細(xì)胞的生理生化特性與野生型細(xì)胞存在明顯差異，為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)帶來不便。我們構(gòu)建了一種零回復(fù)突變的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型多型漢遜酵母受體菌株，應(yīng)用基因敲除技術(shù)建立的URA3-營養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞株HU-Il (CGMCC No. 1218)已申請的發(fā)明專利為CN1651570A。所構(gòu)建的遺傳穩(wěn)定、尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的重組多形漢遜酵母宿主菌株，特別是多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-Il CGMCC No. 1218，該菌株比目前國內(nèi)外所用的營養(yǎng)缺陷型宿主菌遺傳穩(wěn)定性高，回復(fù)突變率低，便于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和重組菌株的篩選，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重組菌株的培養(yǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值?？梢酝ㄟ^許多技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融化，和電穿孔將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中?？寺》敝澈斜磉_(dá)載體的細(xì)胞并各個分析以確定它們是否轉(zhuǎn)入上述人工設(shè)計合成HPV18L1基因或其突變體(片段或融合標(biāo)簽的片段或全長)，是否 產(chǎn)生重組HPV18L1多肽或多肽片段，甚至是否形成該多肽的多聚物?？梢酝ㄟ^幾條途徑對HPV18L1表達(dá)宿主細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，這些途徑包括但不限于，與抗HPV18L1抗體的免疫反應(yīng)性。可以回收HPV18L1蛋白以提供純化形式的HPV18L1進(jìn)一步完成對目標(biāo)蛋白的鑒定，包括但不限于電鏡檢查、分子量測定、質(zhì)譜、等電點(diǎn)測定、動態(tài)光光散射的方法。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明通過對HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重組HPV18L1衣殼蛋白在漢遜酵母系統(tǒng)中高效表達(dá)，而且通過電鏡檢查證明表達(dá)得到的是與天然HPV18L1的VLP具有相同免疫原性和抗原性的50nm左右的類病毒顆粒。本發(fā)明使得利用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)HPV18L1衣殼蛋白成為現(xiàn)實(shí)，相對于目前采用的其他真核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)率更高、成本低等的優(yōu)點(diǎn)。


圖I是病毒編碼的HPV18L1核苷酸序列及編碼的氨基酸序列；圖2是本發(fā)明合成的HPV16L1核苷酸序列及編碼的氨基酸序列；
圖3是序列2所示的DNA序列同病毒碼及漢遜酵母偏愛密碼子模式分布比較情況表;圖4是HPV18截短LI合成編碼基因?qū)?yīng)氨基酸序列；圖5是表達(dá)載體構(gòu)建不意圖；圖6是瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖7是west-blot (蛋白印跡)圖；圖8是HPV18L1類病毒顆粒(VLPs)電鏡照片。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :HPV18L1基因序列優(yōu)化將HPV18L1氨基酸序列全長508氨基酸，轉(zhuǎn)換為漢遜酵母偏愛密碼子模式的核苷酸序列，首選兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一位的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數(shù)情況使用第三位的密碼子完成局部調(diào)整，利用DNAMAN軟件避免過長互補(bǔ)序列、重復(fù)序列，通過RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測，避免過長復(fù)雜的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，排除強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)，增加特異性的分子內(nèi)部穩(wěn)定性。基因的核苷酸序列中還避免出現(xiàn)可能對基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯效率帶來不利影響的序列，如內(nèi)含子剪接序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、內(nèi)部啟動子序列(TATA)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(GGAGG)等。轉(zhuǎn)錄終止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG (富含 T) TA (G) GT、(富含 AT) TTT 等。最終確定由1524個堿基組成的整個序列，如序列表中序列2所示，編碼的氨基酸序列如附圖2，同序列表中病毒碼序列I編碼的如附圖I的氨基酸序列相比一致，利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，該漢遜酵母偏愛的核苷酸序列密碼子同病毒碼及漢遜酵母偏愛密碼子模式分布比較情況如附圖3所示。實(shí)施例2 HPV18L1基因及HPV18L1突變基因表達(dá)載體構(gòu)建利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，序列兩端加上限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I的識別位點(diǎn)。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列，電泳回收酶切后的片段，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｒ远嘈螡h遜酵母CGMCC 2. 2497基因組DNA為模板，克隆I. 5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)終止子、I. Okb的自主復(fù)制序列HARS ；并從YIp5 (GeneBank Acession NO. L09157)質(zhì)粒中克隆出I. Ikb的釀酒酵母脲嘧啶基因ScURA3 ;將上述4部分連接后，插入pBluescrip II質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成穿梭載體pMPT-02。用EcoR I和BamH I酶切載體pMPT_02，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的大片段，T4-DNA連接酶的作用下，與同樣雙酶切的合成的DNA序列連接，連接反應(yīng)16 °C隔夜，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化天根生化科技(北京)有限公司TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，用帶氨芐青霉素抗性的平皿篩選轉(zhuǎn)化子，對平皿上長出的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子使用引物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3 和 primer :5 ‘-GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG-’3 通過PCR擴(kuò)增篩選含載體PMPT-HPV16L1的轉(zhuǎn)化子，篩選得到的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，用寶生物工程大連有限公司的質(zhì)粒回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0)提純得到表達(dá)載體PMPT-HPV18L1，載體構(gòu)建示意圖見附圖5。
使用引物primer fd :5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’ 3 和引物 pl8J2 :5 ^-CGGGATCCAGATCTTCATTACAGTCCTGCCTGCACCAG-’3，以 pMPT-HPV 18L1 模板 PCR 擴(kuò)增，得到序列 3所示的DNA序列，為HPV18截短LI合成編碼基因序列，其對應(yīng)的氨基酸序列如附圖4所示。序列3用上述同樣的雙酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選和提純得到相應(yīng)的表達(dá)載體。實(shí)施例3 :表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化漢遜酵母感受態(tài)宿主細(xì)胞用Sac I酶切載體pMPT_HPV18Ll，使載體線性化。線性化的載體通過電轉(zhuǎn)化法(天津理工大學(xué)生產(chǎn)的LN-101型基因脈沖導(dǎo)入儀，I. 5kV，50 μ F，200 Ω，3_5mSec)轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha) CGMCC NO. 1218。在含有 I. 34g/100ml YNB (酵母氣源基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，2g/100ml葡萄糖的培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例4 目的基因多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選、基因測序及拷貝數(shù)檢測 I.細(xì)胞破碎取約ImLlOOD酵母菌體至I. 5mL離心管,6000rpm離心5min后去上清,加入與沉淀菌體體積相同的酸洗玻璃珠，100 μ L細(xì)胞破碎液，置于振蕩器上振蕩5min lOmin。2. DNA 抽提細(xì)胞破碎完成后，在離心管中加入100 μ L無菌水，再加100 μ L酚/氯仿抽提液，混勻后4°C放置十分鐘，IOOOOrpm離心5min,取上清I μ L用于擴(kuò)增反應(yīng)。3. PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測使用弓丨物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-，3 和 primer rs 5 ‘ -GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG- ’ 3對以上制備的DNA模板PCR擴(kuò)增，以上引物可同時擴(kuò)增漢遜酵母單拷貝的MOX基因和通過載體轉(zhuǎn)化整合到漢遜酵母中的目的基因即HPV16L1基因。所擴(kuò)增HPV16L1片段長度為1500bp，擴(kuò)增的MOX片段長度為2061bp，在I. O %瓊脂糖凝膠加樣孔中上樣5 μ L，電泳完畢取出凝膠攝像，電泳照片見附圖6，其中1500bp左右條帶為HPV16L1基因條帶，2000bp左右條帶為MOX基因條帶。其中，2、3、5、6、7道是高拷貝轉(zhuǎn)化子；4、9道是較高拷貝轉(zhuǎn)化子；8道是地拷貝轉(zhuǎn)化子；1道是宿主菌(陰性對照)；10道是DL2000Marker，從上至下依次為 2000bp、IOOObp、750bp。4.多拷貝株目標(biāo)基因測序以上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后用DNA純化試劑盒抽提1500bp的DNA片段進(jìn)行基因測序，與設(shè)計基因比對結(jié)果一致。5.多拷貝轉(zhuǎn)化子實(shí)時定量PCR檢測拷貝數(shù)已知MOX基因?yàn)闈h遜酵母的單拷貝基因，以MOX基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，設(shè)計引物對同一樣品同時擴(kuò)增MOX基因片段和HPV18L1基因片段并用熒光定量PCR儀檢測，通過相對比較而確定單個細(xì)胞包含的HPV18L1基因拷貝數(shù)?；蛲ㄟ^質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到受體菌并穩(wěn)定整合后才能高效表達(dá)，其拷貝數(shù)一定程度上反映高效表達(dá)的工程菌株表達(dá)目的蛋白的特性。由于MOX基因在漢遜酵母基因組中是單拷貝，故HPV18L1片段的量/MOX片段的量即為每個細(xì)胞的HPV18L1基因的拷貝數(shù)。設(shè)HPV18L1片段擴(kuò)增到達(dá)閾值時的DNA分子數(shù)為Xnh,原樣品即PCR反應(yīng)模板的DNA分子數(shù)為Xtlh ；Μ0Χ片段擴(kuò)增到達(dá)閾值時的DNA分子數(shù)為Xnm,原樣品即PCR反應(yīng)模板的DNA分子數(shù)為Xtlm ；HPV18L1和MOX片段擴(kuò)增到達(dá)閾值時的臨界循環(huán)數(shù)分別為Cth和Ctm ;熒光閾值為Rt ；HPV18L1和MOX擴(kuò)增片段結(jié)合的熒光染料熒光強(qiáng)度系數(shù)分別為Kh和Km。Em為MOX片段的擴(kuò)增效率；Eh為HPV18L1片段的擴(kuò)增效率。
則有Χ = Xoh(l+Eh)cth.........· ·⑴Mnm = M0m(l+Em)cth...........(2)達(dá)到閾值時Rt= Kh · Xnh = Km · Xnm............ (3)由于擴(kuò)增時兩種片段都采用SYBR Green I作為熒光指示劑，故Kh = Km則有XQh(l+Eh)cth= M0ffl(1+Effl)cth............ (4)每個細(xì)胞含有的HPV18L1基因拷貝數(shù)的計算公式為N = X0h/M0m = (I +Em)ctm/ (I +Eh)cth、
當(dāng)不考慮MOX基因和HBsAg基因擴(kuò)增效率不一致即E111 = Eh = E時，HPV18L1基因拷貝數(shù)的計算公式為N = X0h/M0m = (1+E)似其中 Λ Ct = Ctffl-Cth兩對引物均使用在線軟件Primer3 (http://cbr-cnrc. gc. ca/cgi-bin/Primer3)設(shè)計，由大連寶生物工程有限公司代理合成。引物序列HPV18L1 primer forward(SpI) :5 ‘-CCTCCATCTTCTACCACGCT-， 3HPV18L1 primer reverse (Asl) :5 ‘-GGAATGTCCTGCTTGTTGC-，3MOX primer forward(Sp2) :5 ‘-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-， 3MOX primer reverse (As2) :5 ‘-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-，3其中，所擴(kuò)增HPV18L1片段長度為97bp，擴(kuò)增的MOX片段長度為145bp模板DNA制備同上述DNA抽提方法，其稀釋如下標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，取某一樣品抽提得到的DNA溶液先稀釋20倍，然后進(jìn)行系列稀釋，每次稀釋10倍，稀釋4次，此稀釋要求精確。樣品稀釋，取其他樣品用抽提得到的DNA溶液先稀釋20倍，然后進(jìn)行系列稀釋，每次稀釋10倍，稀釋2次，此稀釋不要求精確。實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系總體積20yL，其中正反向引物(IOmM)各O. 5 μ L，EX Premix Taq (含 4mM Mg2+、0. 4mM dNTP、0. 5MExTaq) 10 μ L, SYBR 0· 5 μ L 模板 5 μ L。實(shí)時定量PCR檢測使用澳大利亞Corbett Research公司的熒光定量PCR儀(型號Rotor-Gene3000)。實(shí)時定量PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)預(yù)變性94°C 5min，變性94°C 15secs，退火及延伸60°C 50secs, 35個循環(huán)。熔解檢驗(yàn)反應(yīng)特異性從60°C緩慢升溫到94°C，每5秒升溫一次，每次升溫O. 5°C,每升高一次進(jìn)行信號米集。利用Rotor-Gene 5. O. 28 (CorbettResearch)軟件分析樣品拷貝數(shù)。實(shí)施例5 :細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)操作將凍存菌種從_70°C冰箱取出迅速溶解，用O. 2mL吸管將菌懸液吹打/攪拌均勻后，接40 μ L菌懸液到裝有IOmL MD培養(yǎng)基的三角瓶中，每個樣品接2只以上的三角瓶。接種后搖床培養(yǎng)24小時左右，培養(yǎng)溫度31±2°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm。用吸管接培養(yǎng)得到的菌懸液O. ImL到裝有IOmL MD培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)24小時左右，培養(yǎng)溫度31 ±2°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm。將得到的菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的IOmL離心管，在臺式離心機(jī)上3000rpm離心10分鐘，棄上清液。加無菌水IOmL左右,充分混勻后,在臺式離心機(jī)上3000rpm離心10分鐘,棄上清液。用IOmL無碳源培養(yǎng)基將洗滌后的菌體震蕩混勻，轉(zhuǎn)入三角瓶中。在以上培養(yǎng)得到的細(xì)胞懸液中加O. 5% (50 μ L)的甲醇，將三角瓶置培養(yǎng)搖床上，開啟搖床并調(diào)整溫度至31±2°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速至160rpm，震蕩培養(yǎng)。次日起每天上午、下午各加甲醇一次，兩次甲醇流加之間盡量間隔時間長一些。誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，補(bǔ)加ImL無碳源培養(yǎng)基，加O. 5% (55 μ L)的甲醇，將三角瓶置培養(yǎng)搖床上，開啟搖床并調(diào)整溫度至31 ±2°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速至160rpm，震蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)共72小時后取樣檢測，菌懸液稀釋30倍，用分光光度計測OD6tltl值，計算誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌懸液的OD6tltl值，取相當(dāng)lmL200D細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)水平的檢測。實(shí)施例6 :漢遜酵母重組疫苗工程菌三時相中試發(fā)酵工藝將菌株構(gòu)建中篩選的高拷貝高表達(dá)菌株制備為原代種子、主代種子、工作種子三級種子庫，放在-70°C冰柜中凍存，工作種子用于發(fā)酵工藝開發(fā)及疫苗發(fā)酵生產(chǎn)。培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基2g/100ml葡萄糖、I. 34g/100ml YNB ;一級種子培養(yǎng)基200mL，二級種子培養(yǎng)基1600mL，高壓滅菌。從_70°C冰柜中取一支(lmL、0D6(IQ ^ 100)接 入200mL 一級種子培養(yǎng)基，31°C培養(yǎng)24小時轉(zhuǎn)接1600mL 二級種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，31°C培養(yǎng)22小時細(xì)胞0D600達(dá)到10以上，作為發(fā)酵種子。2.發(fā)酵過程補(bǔ)料培養(yǎng)基NH4H2PO4 87g溶于540mL水中，高壓滅菌；另取260g甘油，高壓滅菌。去阻遏培養(yǎng)基共計3L，NH4H2PO4 27g、MgSO4 · 7H20 6g、KCl 6. 8g、NaCl 0. 7g，以上原料溶于660mL水中，高壓滅菌；另取I. 8L甘油，高壓滅菌。誘導(dǎo)培養(yǎng)基甘油400mL，高壓滅菌，滅菌后加O. 6L甲醇。發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵起始體積12L ；NH4H2PO4 175g、MgSO4 · 7H20 40g、KCl 44g、NaCl
4.4g、甘油520g,另加4mL消泡劑，罐內(nèi)110_115°C高壓滅菌30分鐘。發(fā)酵工藝用日本丸菱理化裝置研究所生產(chǎn)的30L發(fā)酵罐(型號MSJ_J2)進(jìn)行發(fā)酵工藝，對發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行在線滅菌，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院的FC-280型溶解氧監(jiān)控儀進(jìn)行溶氧的監(jiān)測和控制。將ISOOmL二級種子接入裝有12L發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，發(fā)酵工藝主要包含三個時相，即生長時相、去阻遏時相和誘導(dǎo)表達(dá)時相。生長時相發(fā)酵罐pH值控制設(shè)定在5. 4-5. 5 ;發(fā)酵溫度控制30°C;罐壓O. 5Kg/cm2。發(fā)酵罐內(nèi)溶氧會緩慢下降，當(dāng)下降至60%左右時(發(fā)酵約16小時)，連接好補(bǔ)料管路，用蠕動泵勻速打入約SOOmL補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)發(fā)酵罐溶氧水平降至40%以下時，將空氣流量調(diào)至15L/min，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)至700rpm。生長時相后期(發(fā)酵約22小時左右)，若細(xì)胞生長狀態(tài)良好，發(fā)酵罐溶氧水平可下降至20%以下；細(xì)胞OD6tltl達(dá)到80以上。去阻遏時相溶氧回升前將蠕動泵電源插頭與溶解氧監(jiān)控儀信號輸出電源連接；監(jiān)控儀溶氧控制40，死區(qū)為2，高端打開；蠕動泵電源開關(guān)關(guān)閉。當(dāng)觀察到發(fā)酵罐溶氧由最低點(diǎn)回升到60%以上時，進(jìn)入去阻遏時相；此時打開蠕動泵電源開關(guān)，設(shè)定泵速22rpm，開始流加去阻遏培養(yǎng)基。去阻遏后期，若細(xì)胞生長良好，OD6tltl可達(dá)到300以上。誘導(dǎo)時相去阻遏時相持續(xù)24小時左右，進(jìn)入誘導(dǎo)時相，開始補(bǔ)加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過甲醇電極控制甲醇濃度O. 3% (V/V)，整個發(fā)酵時間大約96小時。該發(fā)酵工藝使得通過實(shí)施例1-5獲得的工程菌株獲得高效表達(dá)。發(fā)酵細(xì)胞懸液10L,加3mL的Tween80,攪拌均勻2小時，用Sigma 6K-15離心機(jī)8000rpm離心25min,棄上清液，細(xì)胞加洗液[200mMPH6. 2磷酸鹽緩沖液，O. 5M NaCl，4mMEDTA,0. 03% Tween80]攪拌重懸，_72°C凍存?zhèn)溆谩?shí)施例7:LI蛋白純化樣品預(yù)處理-72°C凍存細(xì)胞4°C融解，加200mM PMSF至終濃度4mM，懸液混勻后，用高壓均質(zhì)機(jī)在1300BAR條件下將細(xì)胞破碎兩遍。用Sigma 6K-15離心機(jī)8000rpm離心25min,取上清液，用賽多利斯Sartocon 2Plus切向流系統(tǒng)IOKDa膜超濾，濃縮3倍，用8倍緩沖液A[25mMpH7. 2磷酸鹽緩沖液，O. IM NaCl，4mM EDTA，0. 03% Tween80]充分置換，去除小分子雜質(zhì)。強(qiáng)陽離子交換層析應(yīng)用QXL強(qiáng)陰離子-交換層析樹脂填充層析柱(26mmIDX IOOmm),該柱在使用前用0.5M NaOH清潔消毒。在室溫下用緩沖液A平衡層析柱。室溫超濾樣品，以15毫升/分鐘的速度泵上柱，用8個柱體積HPV室溫bufferA以15毫升/分鐘流洗，100% bufferA到100% bufferB[25mMpH7. 2 磷酸鹽緩沖液，2M NaCl, 4mM EDTA,0. 03% Tween80]的線性梯度洗脫層析柱，總的線性梯度是10個柱體積，收集具有吸收峰的流分。梯度洗脫后，用5個柱體積室溫bufferB以15毫升/分鐘沖洗柱，10個柱體積IN的NaOH沖洗柱，用bufferA以15毫升/分鐘沖洗柱，平衡。羥基磷灰石柱層析以平衡液[50mM M0PS,pH7. 2,0. 7M氯化鈉]用IOKDa膜超濾充分置換QXL強(qiáng)陰離
子交換層析洗脫有效流分，用于羥基磷灰石柱層析上樣樣品。40g羥基磷灰石用200mM，pH7. O磷酸鹽緩沖液充分溶漲后裝填(16mmIDX 360mm)層析柱。流速3mL/min (約90cm/h線速度)，6個柱體積的平衡液。樣品為平衡液超濾濃縮、恒濾,取50mL用平衡液3倍稀釋，流速3mL/min上樣。4個柱體積的平衡液，2個柱體積的洗脫液I [50mM M0PS，ρΗ7· 2，O. 7Μ氯化鈉，5mM磷酸鈉]，流速3mL/min流洗。用8個柱體積100%洗脫液I到100%洗脫液II[50mM MOPS, ρΗ7· 2,0. 7Μ氯化鈉，200mM磷酸鈉]梯度洗脫，收集洗脫峰。用I. 5個柱體積100%洗脫液III[50mM M0PS，pH7. 2,0. 7M氯化鈉，500mM磷酸鈉]洗脫，收集洗脫峰。用Bradford法(Iowry法)、SDS-PAGE電泳、west-blot分析各洗脫峰含量純度。實(shí)施例8 目標(biāo)蛋白west-blot檢測I.實(shí)施例5獲得的細(xì)胞使用Novagen的酵母專用蛋白抽提試劑(YeastBuster)提取工程菌搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)或?qū)嵤├?發(fā)酵表達(dá)細(xì)胞總蛋白，離心去掉細(xì)胞碎片，上清液用2Xloading Buffer [IOOmM Tris-Cl,pH6. 8,20% (w/v)甘油，2% (w/v) SDS,0. 2M DTT，少許溴酚藍(lán)]I I混合后沸水浴10分鐘。2.經(jīng)SDS-PAGE電泳，應(yīng)用《分子克隆》第二版蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，將電泳條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上,通過預(yù)染蛋白Marker指示轉(zhuǎn)膜效果。3.使用 BSA 包被，HPV16L1 (CAMVIR-I) :sc_47699 單克隆抗體作為一抗，Goatanti Mouse IgG-AP作為二抗，檢測目標(biāo)蛋白特異性，用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色。轉(zhuǎn)化子west-blot方法篩選結(jié)果見附圖7。其中，1、4為蛋白Marker,從上至下依次為170、130、100、70、55、40、35、25KDa。2道為HPV18全長LI表達(dá)轉(zhuǎn)化子，3道為HPV18截短LI表達(dá)轉(zhuǎn)
化子。、
實(shí)施例9:電鏡檢查每個樣品(粗始澄清液、純化的樣品或經(jīng)過重組裝的VLPs樣品)取一滴置于200目碳覆蓋的銅網(wǎng)上。一滴2%的PH7. O的磷鎢酸(PTA)置于銅絲上20-60秒。銅網(wǎng)氣干后進(jìn)行透射電鏡檢查，所有的顯微鏡以IOOkv的遞增電壓用JEOL 100CE透視電子顯微鏡(JEOLUSA LAC)完成。產(chǎn)生的顯微圖片最終放大為100，000X。其中實(shí)施例7中HPV18L1超濾樣品電鏡檢查結(jié)果如附圖8。實(shí)施例10 :動物免疫試驗(yàn)小鼠的免疫測定HPV18L1 VLP疫苗的ED50 :使用60只6 8周齡的SPF級NIH或Balb/c小鼠，分為6組，每組10只小鼠。每只小鼠各免疫ImL HPV18 VLP疫苗稀釋液，濃度分別為原倍、I 5倍稀釋液、I 20倍稀釋液、I 80倍稀釋液、I 160倍稀釋液、I 320倍稀釋液。采用腹腔注射，免疫后六周處死采血，血清分離不少于O. 5mL，存放 于_20°C備用。HPV18抗原免疫小鼠ELISA方法檢測ED50 (Reed-Muench法)計算的疫苗ED50 值為 O. 088 μ go大白兔的免疫用含完全弗式佐劑的HPV18 VLP顆粒抗原，免疫2只大耳白兔。免疫劑量為160 μ g,免疫后4周和10周各加強(qiáng)一次。免疫后每二周采血一次,將采集的血液置37°C中2h，再移入4°C過夜，4000g離心lOmin，吸取上清，獲得的多抗血清存放于_20°C備用。第10周處死采血,血清分離不少于50mL,存放于-20°C備用?？寡錏LISA檢測用純化得到的HPV18VLP顆粒抗原包被96孔酶標(biāo)板過夜；用1% BSA封閉各孔沒有結(jié)合HPV18VLP顆?？乖奈稽c(diǎn)；加小鼠或大耳白兔的抗血清，與孔中HPV18VLP顆粒抗原結(jié)合；加結(jié)合有辣根過氧化物酶的小鼠或大耳白兔酶標(biāo)二抗；加入辣根過氧化物酶的顯色底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺；2N H2SOj*止顯色后用酶標(biāo)儀在405nm處檢測各反應(yīng)孔的吸光度值。HPV18抗原免疫兔ELISA方法檢測抗體滴度結(jié)果，最終取抗血清時，大白兔的抗血清的滴度大于I : 10240。序列表<110>天津超然生物技術(shù)有限公司〈120〉一種HPV18L1多核苷酸序列及其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用〈130〉<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1〈211>1524<212>DNA<213>HPV18L1病毒編碼基因<400>1atggctttgt ggcggcctag tgacaatacc gtatatcttc cacctccttc tgtggcaaga 60gttgtaaata ccgatgatta tgtgactcgc acaagcatat tttatcatgc tggcagctct 120agattattaa ctgttggtaa tccatatttt agggttcctg caggtggtgg caataagcag 180gatattccta aggtttctgc ataccaatat agagtattta gggtgcagtt acctgaccca 240aataaatttg gtttacctga tactagtatt tataatcctg aaacacaacg tttagtgtgg 300
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權(quán)利要求
1.一種HPV18L1多核苷酸序列，其特征在于其多核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.一種多肽，其特征在于它包含權(quán)利要求I所述的多核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽包含HPV18晚期基因產(chǎn)物的全部或一部分。
4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列，以高表達(dá)的漢遜酵母基因的偏愛密碼子使用系數(shù)為參照，首選兼并密碼子中漢遜酵母使用系數(shù)最大的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數(shù)情況使用第三位的密碼子。
5.上述權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多核苷酸序列為保持了漢遜酵母密碼子偏愛使用方式的片段或類似物。
6.—種表達(dá)載體,它包含上述權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多核苷酸序列，該多核苷酸序列與載體調(diào)控序列可操作連接，所述調(diào)控序列能使宿主細(xì)胞表達(dá)該多核苷酸序列。
7.一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含權(quán)利要求I所述的多核苷酸序列或權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
8.依照權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞具有表達(dá)載體能夠補(bǔ)償用于轉(zhuǎn)化子篩選的URA3營養(yǎng)缺陷。
9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列對應(yīng)產(chǎn)物在治療或預(yù)防HPV感染制劑方面的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)在治療或預(yù)防皮疣，非典型鱗狀細(xì)胞，宮頸發(fā)育異常，頸上皮內(nèi)瘤形成或?qū)m頸癌藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPV18L1多核苷酸序列及其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用，包括重組人乳頭瘤病毒L1衣殼蛋白的氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的合成核苷酸序列，和包含該核苷酸序列的重組表達(dá)載體和漢遜酵母表達(dá)宿主菌株。本發(fā)明還涉及由該氨基酸序列及其衍生物所組成的HPV18L1蛋白在制備疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重組HPV18L1衣殼蛋白在漢遜酵母系統(tǒng)中高效表達(dá)，使得利用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)HPV18L1衣殼蛋白成為現(xiàn)實(shí)，相對于目前采用的其他真核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)率更高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/37GK102719453SQ20121001323
公開日2012年10月10日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者孫長海, 宋立娜, 張濤, 李建, 楊珺, 汪和睦, 汪志良, 王昌華, 王玉香, 王艷俠, 齊懷豐 申請人:天津超然生物技術(shù)有限公司