專利名稱：一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的SNP 標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2008年全球范圍內(nèi)大約100萬胃癌新發(fā)病例，占全部腫瘤發(fā)病的7.8%，僅次于肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。超過 70%的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中50%發(fā)生在中國。在我國，胃癌年齡標(biāo)化發(fā)病率男性為41. 3/10萬，女性為18. 5/10萬，僅次于肺癌。大約90% -95%的胃癌為腺癌，起源于胃部上皮組織。從解剖學(xué)上可分為賁門癌和非賁門癌。賁門癌是發(fā)生在胃賁門部食管胃交界線下2cm范圍內(nèi)的腺癌。非賁門癌主要包括發(fā)生在胃底、胃角、胃竇和幽門部惡性腫瘤。 根據(jù)國內(nèi)以往的統(tǒng)計，賁門癌約占全部胃癌的20%，而非賁門癌占據(jù)了 80%。盡管在全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率及死亡率均處于下降趨勢，而我國仍處于較高發(fā)病的及死亡水平。隨著人口基數(shù)的不斷增大和胃癌期望壽命的延長，龐大的胃癌，特別是非賁門癌患病和死亡人數(shù)，將在未來相當(dāng)長一段時期內(nèi)給我國帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，仍然是腫瘤預(yù)防及控制的重點。目前，胃癌的初步診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、實驗室檢查、胃腸X線檢查、纖維內(nèi)窺鏡檢查、脫落細(xì)胞學(xué)檢查、B超以及CT檢查、腫瘤標(biāo)記物檢測等。鑒別診斷主要依靠X線鋇餐造影、胃鏡和活組織病理檢查。但是現(xiàn)在臨床常用的X線鋇餐造影和纖維內(nèi)窺鏡檢查也存在一些弊端。X線鋇餐造影對局部粘膜上較小的腫瘤難以發(fā)現(xiàn)，或難以肯定；檢查有一定的盲區(qū)，可能漏掉小病變，不能確定病變的性質(zhì)，可能有假陽性或假陰性。纖維內(nèi)窺鏡檢查對胃壁整體蠕動情況及胃的形態(tài)觀察欠完整；對腫瘤的浸潤深度、有無轉(zhuǎn)移了解不清；對外壓性腫物還是胃壁內(nèi)腫物難以區(qū)別。目前臨床所用胃癌標(biāo)志物特異性不強。血清癌胚抗原(CEA)對診斷意義不大，雖半數(shù)患者的胃液中CEA有明顯升高，超過lOOng/ml， 但也與慢性萎縮性胃炎的胃液中含量有重疊。病理活組織檢查作為胃癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床胃癌確診中居于重要地位，但由于需要做胃鏡取尾部組織，不適合作為臨床健康篩查。胃癌的形成是一個復(fù)雜的多因素、多階段的過程，從慢性萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生等癌前病變最終進(jìn)展為胃癌。不過目前其確切發(fā)病機制還不是很清楚。宏觀流行病學(xué)及遺傳流行病學(xué)研究表明，胃癌的發(fā)生是環(huán)境因素和個體遺傳因素共同作用的結(jié)果。 其中，幽門螺桿菌(H. pylori)感染已經(jīng)在1993年被世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)為一級致癌物，是胃癌的明確危險因素。然而，相同的環(huán)境危險因素暴露下僅有少數(shù)個體最終發(fā)生胃癌，這說明不同個體對環(huán)境暴露的反應(yīng)存在不同的易感性，這種易感性目前被認(rèn)為是由個體的遺傳因素所決定。例如，全球人群的H. pylori感染率大約在40% -80%，但其中只有
的H. pylori感染患者進(jìn)展為胃癌，這說明遺傳因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP 的存在被認(rèn)為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性，因此SNP可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的SNP譜預(yù)測疾病的發(fā)生，不僅靈敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng)用前景，而且通過SNP預(yù)測譜的構(gòu)建，還可以實現(xiàn)中國古語中“上醫(yī)治未病”的理想，對疾病作出前瞻性的 “基因診斷”。近年來，利用SNP預(yù)測疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和心腦血管疾病等常見重大疾病預(yù)測上的應(yīng)用價值已初見端倪。然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于非賁門癌診斷的報道，若能篩選出非賁門癌易感的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國非賁門癌診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明的第二個目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性引物。本發(fā)明的第三個目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對。本發(fā)明的第四個目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性引物和特異性熒光探針在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第五個目的是提供非賁門癌輔助診斷試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究非賁門癌患者及與其年齡匹配的健康對照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與非賁門癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的非賁門癌輔助診斷試劑盒，為非賁門癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為rsl950476、rs238889、 rs7973779、rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、rsl7032274、 rs3027247、rs9578831、rs714842、rsl7262413、rsl6924994、rsl3361707、rsl2496648、 rs2826151、rsl2416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rsl2974407、rsl7248007、 rsl345355 和 rsl0260816 的組合。所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物，這些引物為rsl950476 的引物序列為 SEQ ID No:liPSEQ ID No :2 ;rs238889 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs7973779 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ；rsl445227 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ；rs7528071 的引物序列為 SEQ ID No:17 禾口 SEQ ID No :18 ;rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No: 22 ;rs9841504 的引物序列為 SEQ ID No 25 禾Π SEQ ID No :26 ;rs749130 的引物序列為 SEQ ID No 29 和 SEQ ID No 30 ；rsl7032274 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No 34 ；rs3027247 的引物序列為 SEQ ID No 37 和 SEQ ID No 38 ；rs9578831 的引物序列為 SEQ ID No 41 和 SEQ ID No 42 ；rs714842 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ；rsl7262413 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rsl6924994 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rsl3361707 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ;rslM96648 的引物序列為 SEQ ID No :61 禾口 SEQ ID No :62 ;rs2826151 的引物序列為SEQ ID No 65 和 SEQ ID No :66 ；rsl2416175 的引物序列為 SEQ ID No :69 和 SEQ ID No 70 ；rs3753473 的引物序列為 SEQ ID No 73 和 SEQ ID No 74 ；rs7349868 的引物序列為 SEQ ID No:77 禾口 SEQ ID No :78 ;rs6026313 的引物序列為 SEQ ID No :81 禾口 SEQ ID No:
82；rsl2974407 的引物序列為 SEQ ID No 85 和 SEQ ID No 86 ；rsl7248007 的引物序列為 SEQ ID No :89和 SEQ ID No 90 ；rsl345355 的引物序列為 SEQ ID No :93和 SEQ ID No 94 ； rsl0260816 的引物序列為 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No :98。所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對，這些熒光探針為rsl950476的熒光探針對序列為SEQ ID No :3和SEQ ID No 4 ；rs238889的熒光探針對序列為SEQ ID No :7和SEQ ID No 8 ；rs7973779的熒光探針對序列為SEQ ID No :11和 SEQ ID No 12 ；rsl445227 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15和 SEQ ID No 16 ；rs7528071 的熒光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rslM9058的熒光探針對序列為SEQ ID No 23 和 SEQ ID No 24 ；rs9841504 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 ；rs749130的熒光探針對序列為SEQ ID No :31和SEQ ID No 32 ；rsl7032274的熒光探針對序列為SEQ ID No :；35和SEQ ID No 36 ；rs3027247的熒光探針對序列為SEQ ID No :39禾口 SEQ ID No 40 ；rs9578831 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :43 和 SEQ ID No 44 ；rs714842 的熒光探針對序列為SEQ ID No 47和SEQ ID No 48 ；rsi7262413的熒光探針對序列為 SEQ ID No :51 禾口 SEQ ID No 52 ；rs 16924994 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 55和 SEQ ID No 56 ；rsl3361707 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 59 和 SEQ ID No :60rsl2496648 的熒光探針對序列為SEQ ID No 63和SEQ ID No 64 ；rs2826151的熒光探針對序列為SEQ ID No 67 和 SEQ ID No 68 ；rsl2416175 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 71 和 SEQ ID No 72 ；rs3753473的熒光探針對序列為SEQ ID No 75和SEQ ID No 76 ；rs7349868的熒光探針對序列為SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ；rs6026313的熒光探針對序列為SEQ ID No
83和 SEQ ID No :84 ;rsU974407 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :87 和 SEQ ID No 88 ； rsl7248007的熒光探針對序列為SEQ ID No 91和SEQ ID No 92 ；rsl345355的熒光探針對序列為SEQ ID No :95和SEQ ID No 96 ；rsl0260816的熒光探針對序列為SEQ ID No 99 和 SEQ ID No :100ο所述的SNP標(biāo)志物在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種非賁門癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中rsl950476、 rs238889、rs7973779、rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、 rsl7032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rsl7262413、rsl6924994、rsl3361707、 rsl2496648、rs2826151、rsl2416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rsl2974407、 rsl7248007、rsl345355 和 rsl0260816。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標(biāo)志物的特異性引物和/或特異性熒光探針。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性引物為rsl950476 的引物序列為 SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 ;rs238889 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs7973779 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No
10；rsl445227 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ；rs7528071 的引物序列為 SEQ ID No:17 禾口 SEQ ID No :18 ;rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No: 22 ;rs9841504 的引物序列為 SEQ ID No 25 禾Π SEQ ID No :26 ;rs749130 的引物序列為 SEQ ID No 29 和 SEQ ID No 30 ；rsl7032274 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No 34 ；rs3027247 的引物序列為 SEQ ID No 37 和 SEQ ID No 38 ；rs9578831 的引物序列為 SEQ ID No 41 和 SEQ ID No 42 ；rs714842 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ；rsl7262413 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rsl6924994 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rsl3361707 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ;rslM96648 的引物序列為 SEQ ID No :61 禾口 SEQ ID No :62 ;rs2826151 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rsl2416175 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs3753473 的引物序列為 SEQ ID No 73 和 SEQ ID No 74 ；rs7349868 的引物序列為 SEQ ID No:77 禾口 SEQ ID No :78 ;rs6026313 的引物序列為 SEQ ID No :81 禾口 SEQ ID No: 82 ；rsl2974407 的引物序列為 SEQ ID No 85 和 SEQ ID No 86 ；rsl7248007 的引物序列為 SEQ ID No :89和 SEQ ID No 90 ；rsl345355 的引物序列為 SEQ ID No :93和 SEQ ID No 94 ； rsl0260816 的引物序列為 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No :98。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對為rs 1950476 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 3 和 SEQ ID No 4 ；rs238889 的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rs7973779的熒光探針對序列為SEQ ID No
11和 SEQ ID No :12 ;rsl445227 的熒光探針對序列為 SEQ ID No:15 和 SEQ ID No 16 ； rs7528071的熒光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rslM9058的熒光探針對序列為SEQ ID No 23和SEQ ID No 24 ；rs9841504的熒光探針對序列為SEQ ID No 27和 SEQ ID No 28 ；rs749130 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :31 和 SEQ ID No 32 ；rsl7032274 的熒光探針對序列為SEQ ID No :35和SEQ ID No 36 ；rs3027247的熒光探針對序列為SEQ ID No 39 和 SEQ ID No 40 ；rs9578831 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 43 和 SEQ ID No 44 ；rs714842 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 47 和 SEQ ID No 48 ；rsl7262413 的熒光探針對序列為SEQ ID No 51和SEQ ID No 52 ；rsl6924994的熒光探針對序列為SEQ ID No :55 和 SEQ ID No 56 ；rsl3361707 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :59 和 SEQ ID No 60 rsl2496648的熒光探針對序列為SEQ ID No:63和SEQ ID No :64 ;rs2826151的熒光探針對序列為SEQ ID No :67和SEQ ID No 68 ；rsl2416175的熒光探針對序列為SEQ ID No :71禾口 SEQ ID No -J2 ；rs3753473 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :75和 SEQ ID No 76 ；rs7349868 的熒光探針對序列為SEQ ID No:79和SEQ ID No 80 ；rs6026313的熒光探針對序列為SEQ ID No :83和 SEQ ID No 84 ；rsl2974407 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :87和 SEQ ID No 88 ；rsl7248007 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :91 和 SEQ ID No 92 ；rsl345355 的熒光探針對序列為SEQ ID No :95和SEQ ID No 96 ；rsl(^60816的熒光探針對序列為SEQ ID No 99 和 SEQ ID No 1000所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)基因型檢測選擇非賁門癌病例，與非賁門癌病例年齡、性別匹配的對照，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與非賁門癌相關(guān)的SNP。(3)對篩選出的陽性關(guān)聯(lián) SNP，進(jìn)一步在另外的樣本中進(jìn)行檢測，以判斷其關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定性。(4)非賁門癌輔助診斷試劑盒的研制根據(jù)非賁門癌病例和健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描，TaqMan基因分型進(jìn)行單個位點的檢測等。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分1.研究樣本的選擇(1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的非賁門癌病例；(2)與病例年齡、性別匹配的對照；本研究共采用7263例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/ μ 1DNA,純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1. 6-2. 0。3. Affymetrix 6. 0 芯片檢測(1)取受試者全基因組DNA樣本；(2)在Affymetrix 6. 0芯片(購于美國昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；(3)檢測并比較各基因型在非賁門癌病例與健康對照中的分別差異。4.單個SNP的TaqMan基因分型(1)取受試者DNA樣本；(2)設(shè)計單個SNP的特異性引物和特異性熒光探針對；(3)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；(4)檢測并比較非賁門癌病例與健康對照中不同基因型的分布差異。5.診斷試劑盒制備方法Affymetrix6. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描和單個SNP檢測后確定非賁門癌病例與健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為非賁門癌診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與非賁門癌發(fā)病有關(guān)的SNP組成輔助診斷試劑盒(rsl950476、rs238889、rs7973779、 rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、rsl7032274、rs3027247、 rs9578831、rs714842、rsl7262413、rsl6924994、rsl3361707、rsl2496648、rs2826151、 rsl2416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rsl2974407、rsl7248007、rsl345355 和 rsl(^60816)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性引物和特異性熒光探針對，以及Taq酶、 dNTP等試劑。6.統(tǒng)計分析方法運用x2檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為了進(jìn)一步研究這25個SNP構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構(gòu)建了一個數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個SNP與非賁門癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強度。具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進(jìn)行評分，野生純合型=“0”，雜合型 =“1”，變異純合型=“2”，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究研究對照確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下危險分值=(0. 220Xrs 1950476的評分)+ (0. 183Xrs238889的評分)+ (0. 176Xrs7973779 的評分)+ (0. 275Xrsl445227 的評分)+ (-0. 328Xrs7528071 的評分)+ (-0. 225Xrsl549058 的評分)+ (-0. 567Xrs9841504 的評分)+ (0. 205Xrs749130 的評分) + (-0. 413Xrsl7032274 的評分) + (0. 194 X rs3027247 的評分)+ (0. 239Xrs9578831 的評分)+ (0. 251 Xrs714842 的評分)+ (-0. 278Xrsl7262413 的評分) + (-0. 409 X rs 16924994 的評分)+ (-0. 391 X rs 13361707 的評分)+ (0. 203 X rs 12496648 的評分)+ (-0. 185Xrs2826151 的評分)+ (-0. 214 X rs 12416175 的評分)+ (0. 370Xrs3753473 的評分)+ (-0. 254Xrs7349868 的評分)+ (-0. 482Xrs6026313 的評分)+ (-0. 134Xrsl2974407 的評分)+ (0. 359Xrsl7248007 的評分)+ (0. 287Xrsl345355 的評分)+ (-0. 252Xrsl0260816的評分)，獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的3279例樣本中。統(tǒng)計學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成(PLINK1. 07)。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為0. 05，所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明在上述1006例符合條件的非賁門癌病例及2273例健康對照中，兩組年齡、性別均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。根據(jù)Affymetrixe. 0芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在“非賁門癌病例”組和“健康對照”組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括rsl950476、rs238889、rs7973779、 rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、rsl7032274、rs3027247、 rs9578831、rs714842、rsl7262413、rsl6924994、rsl3361707、rsl2496648、rs2826151、 rsl2416175、 rs3753473、 rs7349868、 rs6026313、 rsl2974407、 rsl7248007、 rsl345355 和 rsl0260816o根據(jù)上述檢測結(jié)果，我們將這25個與非賁門癌發(fā)病相關(guān)的SNP在另外1894例非賁門癌病例和與其年齡、性別匹配的2090例健康對照中進(jìn)行了單個SNP的檢測，結(jié)果與芯片檢測一致。單因素和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這25個SNP與非賁門癌的發(fā)病
存在著顯著關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步分析這25個SNP的組合用于非賁門癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分病例與對照。根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于非賁門癌輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性引物、特異性熒光探針對和其他檢測試劑。具體而言，這25個SNP的組合，或者這25個SNP的特異性引物及特異性熒光探針對的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于非賁門癌的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。本發(fā)明有益效果
本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為非賁門癌輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(I)SNP是ー種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為非賁門癌的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。O) SNP試劑盒是ー種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于非賁門癌的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴(yán)密的驗證和評價體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾病相關(guān)的SNP譜，并應(yīng)用TaqMan基因分型方法在大樣本中進(jìn)行了驗證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。本發(fā)明通過控制年齢、性別、吸畑、飲酒等對疾病發(fā)展的影響因素，研究SNP在非賁門癌輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述SNP對于非賁門癌進(jìn)展的影響，掲示其診斷價值。因此， 本發(fā)明獲得了非賁門癌發(fā)病相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo)志物；通過SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得非賁門癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖1 顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究病例組和對照組的ROC曲線。顯示非賁門癌病例組對健康對照組為參照的ROC曲線。
具體實施例方式實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2004年開始至2010年從南京醫(yī)科大學(xué)腫瘤中心收集了大量的非賁門癌患者血標(biāo)本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 7263例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全基因組芯片掃描和單個SNP TaqMan基因分型的實驗樣品1、病理學(xué)明確診斷的非賁門癌患者；2、與病例年齡、性別匹配的健康對照；并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。實施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描在上述符合條件的1006例非賁門癌患者和2273例健康對照中，兩組年齢、性別匹配。將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe.O芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、向儲存于2ml凍存管中的白細(xì)胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。2、去除紅細(xì)胞用溶血試劑將5ml離心管補至細(xì)1，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入細(xì)1溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14.4ml 0. 5M乙ニ胺四乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同)和8 μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。4、去除蛋白質(zhì)加Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿異戊醇=M 1，v/v，下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1. 5ml的離心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。6、DNA洗滌在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心lOmin，棄上清后真空抽
干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。7、測量濃度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6-2. O。8、進(jìn)行全基因組掃描；9、數(shù)據(jù)分析與處理在“非賁門癌病例”組和“健康對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。實施例3單個SNP的TaqMan基因分型將上述全基因組掃描發(fā)現(xiàn)與非賁門癌發(fā)病有關(guān)的SNP在另外1894非賁門癌病例和2090健康對照中進(jìn)行檢測，具體步驟為1、向儲存于2ml凍存管中的白細(xì)胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。2、去除紅細(xì)胞用溶血試劑將5ml離心管補至細(xì)1，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入細(xì)1溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA 向沉淀中加Iml抽提液和8 μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻， 37 °C水浴過夜。4、去除蛋白質(zhì)加Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿異戊醇=M 1)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1. 5ml 的離心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。6、DNA洗滌在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心lOmin，棄上清后真空抽
干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。7、測量濃度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6-2. O。8、進(jìn)行TaqMan基因分型。對全基因組掃描發(fā)現(xiàn)的25個陽性關(guān)聯(lián)的SNP設(shè)計特異性引物和特異性熒光探針對(表2)。反應(yīng)體系包括2. 5 μ 1 2Χ TaqMan基因分型Master Mix、每對正向和反向引物的混合物0.25μ lOOpmol/μ 1)、0. 125 μ 1 iTaqMan熒光探針 (lOpmol/μ 1,同時含有相應(yīng)的兩種等位基因的熒光探針)和1. 25 μ 1雙蒸水。加入0. 5 μ 1 DNA。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)條件為95°C、5分鐘進(jìn)行1 個循環(huán)ヰ950C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。
9、基因型判讀采用ABI Prism 7900熒光定量PCR儀進(jìn)行。10、數(shù)據(jù)處理和分析利用logistic回歸模型中的addtive模型比較每個SNP的三種基因型在病例組合對照組中分布頻率的差異，結(jié)果與全基因組掃描類似不再列出。實施例4利用危險度評分方法進(jìn)ー步分析SNP與非賁門癌發(fā)病根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人通過對2組樣品(“非賁門癌病例組”和“健康對照組”) 基因型分布頻率的比較，選擇陽性關(guān)聯(lián)的SNP，以全基因組掃描樣本中單個SNP回歸系數(shù)為權(quán)重，進(jìn)ー步求得危險分值，繪制ROC來評估預(yù)測的靈敏性和特異性，進(jìn)而評估這些SNP對非賁門癌發(fā)病的判斷能力。對25個SNP標(biāo)志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，這25個SNP以74%的AUC 將健康對照組和非賁門癌病例組分開，最佳臨界點的靈敏度為75. 85%，特異度56. 02% (圖 1)。因此，本發(fā)明人證明了采用 rsl950476、rs238889、rs7973779、rsl445227、 rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、rsl7032274、rs3027247、rs9578831、 rs714842、 rsl7262413、 rsl6924994、 rsl3361707、 rsl2496648、 rs2826151、 rsl2416175、 rs3753473、rs7349868、rs6026313、rsl2974407、rsl7248007、rsl345355 和 rsl0260816 的
組合能夠很好地將健康對照和非賁門癌患者區(qū)分。實施例5用于非賁門癌輔助診斷SNP試劑盒的制作SNP試劑盒的制作和操作流程是基于AffymetriX6. 0芯片檢測和I1aqMan基因分型技木。試劑盒含有ー批SNP特異性引物(包括下列引物rsl950476的引物序列為SEQ ID No :1 和 SEQ ID No 2 ；rs238889 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs7973779 的引物序列為SEQ ID No 9和SEQ ID No 10 ；rsl445227的引物序列為SEQ ID No 13和 SEQ ID No 14 ；rs7528071 的引物序列為 SEQ ID No :17 禾ロ SEQ ID No 18 ；rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ；rs9841504 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs749130 的引物序列為 SEQ ID No ツ9 和 SEQ ID No 30 ；rsl7032274 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No 34 ；rs3027247 的引物序列為 SEQ ID No 37 和 SEQ ID No 38 ；rs9578831 的引物序列為 SEQ ID No 41 和 SEQ ID No 42 ；rs714842 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ；rsl7262413 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rsl6924994 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rsl3361707 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ；rsl2496648 的引物序列為 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ;rs2826151 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No :66 ;rslM16175 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs3753473 的引物序列為 SEQ ID No 73 和 SEQ ID No 74 ；rs7349868 的引物序列為 SEQ ID No:77和 SEQ ID No 78 ；rs6026313 的引物序列為 SEQ ID No 81 和 SEQ ID No 82 ；rsl2974407 的引物序列為 SEQ ID No 85 和 SEQ ID No 86 ； rsl7248007 的引物序列為 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ；rsl345355 的引物序列為 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ；rsl0260816 的引物序列為 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No 98)、 特異性熒光探針對(包括下列熒光探針rsl950476的熒光探針對序列為SEQ ID No 3和 SEQ ID No 4 ；rs238889 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 7 和 SEQ ID No 8 ；rs7973779 的熒光探針對序列為SEQ ID No:ll和SEQ ID No 12 ；rsl445227的熒光探針對序列為SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ；rs7528071 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 19 和 SEQ ID No 20 ； rsl549058的熒光探針對序列為SEQ ID No:23和SEQ ID No 24 ；rs9841504的熒光探針對序列為SEQ ID No :27和SEQ ID No 28 ；rs749130的熒光探針對序列為SEQ ID No :31和SEQ ID No :32 ;rsl7032274 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :；35 和 SEQ ID No 36 ；rs3027247 的熒光探針對序列為SEQ ID No:39和SEQ ID No 40 ；rs9578831的熒光探針對序列為SEQ ID No 43 和 SEQ ID No 44 ；rs714842 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 47 和 SEQ ID No 48 ；rsl7262413 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rsl6924994 的熒光探針對序列為SEQ ID No 55和SEQ ID No 56 ；rsl3361707的熒光探針對序列為SEQ ID No :59和 SEQ ID No 60 rsl2496648 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :63和 SEQ ID No 64 ； rs2826151的熒光探針對序列為SEQ ID No:67和SEQ ID No 68 ；rsl2416175的熒光探針對序列為SEQ ID No 71和SEQ ID No 72 ；rs3753473的熒光探針對序列為SEQ ID No 75和 SEQ ID No 76 ；rs7349868 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :79 和 SEQ ID No 80 ；rs6026313 的熒光探針對序列為SEQ ID No:83和SEQ ID No :84 ;rsl2974407的熒光探針對序列為SEQ ID No :87和 SEQ ID No 88 ；rsl7248007 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :91 禾ロ SEQ ID No 92 ；rsl345355 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 95 和 SEQ ID No 96 ；rsl0260816 的熒光探針對序列為SEQ ID No:99和SEQ ID No :100)，還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑， 如dNTPs，MgCl2,雙蒸水，熒光探針，Taq酶等，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的， 另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照等)。此試劑盒的價值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過最精簡和特異的引物及熒光探針對檢測SNP， 再通過SNP譜輔助判斷非賁門癌，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個體化治療。
表1.病例組與對照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為rsl950476、 rs238889、rs7973779、rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、rs749130、 rsl7032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rsl7262413、rsl6924994、rsl3361707、 rsl2496648、rs2826151、rsl2416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rsl2974407、 rsl7248007、rsl345355 和 rsl0260816 的組合。
2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物，其特征在于該引物為 rs 1950476 的引物序列為 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No 2 ；rs238889 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ； rs7973779 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rsl445227 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ； rs7528071 的引物序列為 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ； rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ； rs9841504 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ； rs749130 的引物序列為 SEQ ID No 29 和 SEQ ID No 30 ； rsl7032274 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No 34 ； rs3027247 的引物序列為 SEQ ID No 37 和 SEQ ID No 38 ； rs9578831 的引物序列為 SEQ ID No 41 和 SEQ ID No 42 ； rs714842 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ； rsl7262413 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ； rs 16924994 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ； rsl3361707 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ； rsl2496648 的引物序列為 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ； rs2826151 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No 66 ； rsl2416175 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ； rs3753473 的引物序列為 SEQ ID No 73 和 SEQ ID No 74 ； rs7349868 的引物序列為 SEQ ID No 77 和 SEQ ID No 78 ； rs6026313 的引物序列為 SEQ ID No 81 和 SEQ ID No 82 ； rsl2974407 的引物序列為 SEQ ID No 85 和 SEQ ID No 86 ； rsl7248007 的引物序列為 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ； rsl345355 的引物序列為 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ； rsl0260816 的引物序列為 SEQ ID No :97 禾口 SEQ ID No :98。
3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對，其特征在于該熒光探針為 rsl950476的熒光探針對序列為SEQ ID No 3和SEQ ID No 4 ；rs238889的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rs7973779的熒光探針對序列為SEQ ID No 11和SEQIDNo 12 ；rsl445227的熒光探針對序列為SEQ ID No 15和SEQIDNo 16 ；rs7528071的熒光探針對序列為SEQ ID No 19和SEQIDNo 20 ；rsl549058的熒光探針對序列為SEQ ID No 23和SEQIDNo 24 ；rs9841504的熒光探針對序列為SEQ ID No 27和SEQIDNo 28 ；rs749130的熒光探針對序列為SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ； rsl7032274 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 35 和 SEQ ID No 36 ； rs3027247的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和SEQ ID No 40 ； rs9578831的熒光探針對序列為SEQ ID No 43和SEQ ID No 44 ； rs714842的熒光探針對序列為SEQ ID No 47和SEQ ID No 48 ； rsl7262413 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ； rs 16924994 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 55 和 SEQ ID No 56 ； rsl3361707 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 59 和 SEQ ID No 60 ； rsl2496648 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 63 和 SEQ ID No 64 ； rs2826151的熒光探針對序列為SEQ ID No 67和SEQ ID No 68 ； rsl2416175 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 71 和 SEQ ID No 72 ； rs3753473的熒光探針對序列為SEQ ID No 75和SEQ ID No 76 ； rs7349868的熒光探針對序列為SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ； rs6026313的熒光探針對序列為SEQ ID No 83和SEQ ID No 84 ； rsl2974407 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 87 和 SEQ ID No 88 ； rsl7248007 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 91 和 SEQ ID No 92 ； rsl345355的熒光探針對序列為SEQ ID No 95和SEQ ID No 96 ； rsl0260816 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :99 和 SEQ ID No :100。
4.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對在制備非賁門癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.一種非賁門癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rsl950476、rs238889、rs7973779、rsl445227、rs7528071、rsl549058、rs9841504、 rs749130、 rsl7032274、 rs3027247、 rs9578831、 rs714842、 rsl7262413、 rsl6924994、 rsl3361707、rsl2496648、rs2826151、rsl2416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、 rsl2974407、rsl7248007、rsl345355 和 rsl0260816。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述SNP 標(biāo)志物的特異性引物和/或權(quán)利要求3所述SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)常用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與非賁門癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313等25個SNP的組合。該標(biāo)志物可用于制備非賁門癌輔助診斷試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102534008SQ20121001297
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者朱陳, 沈洪兵, 胡志斌, 董靜, 靳光付, 馬紅霞 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)