專利名稱：擬南芥熱激蛋白基因hsp101在種子萌發(fā)和保藏中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于種子生理和植物基因工程領域。具體地，涉及擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hot I在改變種子保藏、種子萌發(fā)特性中的應用，同時還涉及該基因T-DNA插入突變株hotl在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長 素(IAA)的種子中的應用。
背景技術：
種子的保藏是植物種質(zhì)資源保存的重要手段，其對生物多樣性的保護、對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。據(jù)統(tǒng)計，世界上已收集的植物種質(zhì)資源有610萬份，其中90%是以種子形式保存在低溫種質(zhì)庫中的，我國長期貯存的種質(zhì)數(shù)量已達34萬份，居世界首位。但是種質(zhì)低溫保存也存在很多問題，其中對種質(zhì)遺傳完整性影響最大的就是種子老化問題，表現(xiàn)為發(fā)芽率降低。種子在自然儲藏中發(fā)芽力也會逐漸喪失，這就是自然老化(Machado Neto,Custodio et al.2001)。自然老化歷時較長，在品種改良中進行種質(zhì)篩選時難以應用；人工老化則可克服常溫下自然老化所需時間較長的不足，而被廣泛應用于種子耐貯性的研究，人工老化常采用高溫高濕的方法。種子老化的過程中會發(fā)生一系列的生理生化及遺傳變化，包括質(zhì)膜傷害、物質(zhì)能量代謝的變化、有機物質(zhì)含量及種類的變化和遺傳結構的變化(Galleschi,Capocchi et al. 2002 ；Andreev,Spiridonova et al. 2004 ；Freitas,Dias etal. 2006)。因此，進行種子老化的相關研究，揭示種子老化機理并進一步找出相關應對策略，對于種質(zhì)資源保存具有重要的現(xiàn)實意義。種子是農(nóng)林、園藝生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)資料，其萌發(fā)直接影響農(nóng)林園藝的生產(chǎn)。人們?yōu)椴シN獲得齊苗狀苗而設法使種胚打破休眠迅速整齊恢復生長，為豐產(chǎn)奠定基礎。種子的萌發(fā)受環(huán)境因素(如光、溫度和濕度等)和內(nèi)部因素(如基因、激素、糖、含氮化合物、種皮的顏色和結構等)的協(xié)同調(diào)控(Bewley 1997)。激素調(diào)控方面，赤霉素(GA3)、生長素(IAA)和脫落酸(ABA)是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的主要植物激素。ABA抑制萌發(fā)，誘導休眠，赤霉素和生長素促進萌發(fā)，是拮抗ABA的主要因子，為種子萌發(fā)所必需(Flores，Jurado etal. 2006 ；Rizza, Boccaccini et al. 2010)。目前，由休眠到萌發(fā)的“開關”機制尚未明確，尤其是對種子萌發(fā)調(diào)控相關基因的研究方面。熱激蛋白質(zhì)Heat Shock Protein(HSP)廣泛存在于植物細胞膜、細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等組織中(Zhang, Wang et al. 2007),是一組結構保守的蛋白質(zhì),依其分子量大小與序列的同源性，可分為 small HSPs (sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90 與 HSPlOO 等五類(Papp，Nardai et al. 2003)。它們的主要功能有(I)防止受熱變性的蛋白質(zhì)聚集；(2)將已聚集的變性蛋白質(zhì)分開；(3)輔助變性的蛋白質(zhì)折疊回其原有的構形；(4)協(xié)助分解已變形的蛋白質(zhì)(Suk-Whan and Elizabeth 2001)。大部分的熱激蛋白質(zhì)在演化上是高度保守的。以反義抑制方式，阻止擬南芥HSP101的表達，會使突變株喪失獲得性耐熱性，突變株在經(jīng)38°C，90分鐘的前處理下仍然無法在45°C的環(huán)境生存(Gurley 2000 ;Suk-Whan and Elizabeth2001)。熱激蛋白和熱激轉錄因子除了在熱激下起作用外，還和其它多種非生物脅迫有關，如干旱，高鹽和低溫脅 迫 等(Kotak, Larkindale et al. 2007)。番爺sHSP可被低溫誘導，HSP21被發(fā)現(xiàn)包含在抗氧化途徑中，At HSP17.6則可被滲透壓所誘導。在種子萌發(fā)，特別是早期，基因轉錄活躍，蛋白質(zhì)大量合成，細胞的增殖和分化非常劇烈，細胞的環(huán)境在不斷變化，細胞對外界刺激十分敏感。這個時期的HSPs變化和作用表現(xiàn)得非常突出(Hsu，Laiet al.2010)。目前，現(xiàn)有技術中未見擬南芥基因HSPlOl缺失及該基因的T-DNA插入突變株hotl能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在種子萌發(fā)、保藏和農(nóng)作物生產(chǎn)中的應用。本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有提高種子萌發(fā)和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的種子中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發(fā)中的應用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲藏中的應用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長素IAA升高，有利于萌發(fā)。擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發(fā)的轉基因植物中的應用。擬南芥基因HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲藏的轉基因植物中的應用。擬南芥HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。本發(fā)明所述的基因HSPIOI在GenBank中的編號是AT 1G74310，該基因的CDS長2736bp，編碼911個氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I所示。利用從擬南芥生物資源中心 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)獲得的 HSPlOl 基因 T-DNA 插入的擬南芥突變體hotl作為研究對象，突變體株系的種子編號為SALK_066374，突變體hotl源于載體PR0K2上的一段T-DNA插入基因HSP101的外顯子中，導致基因突變，插入位點處的側翼序列如表2所示。本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSP101功能與種子的萌發(fā)和老化有關，該基因缺失可使得擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢，但對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏，同時內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSP101能夠改變種子保藏和萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應用前景。


圖I 為 Western Blot 鑒定；圖2為PCR試驗，圖2A為PCR引物設計示意圖；圖2B為電泳結果理論預期示意圖； 圖3為PCR鑒定電泳結果；圖4為擬南芥種子萌發(fā)勢；圖5為擬南芥種子自然老化，圖5A為擬南芥種子自然老化兩年；圖5B為擬南芥種子自然老化兩年萌發(fā)率；圖6為擬南芥種子人工老化；圖7為擬南芥種子內(nèi)源激素含量；圖7A為種子內(nèi)源GA3含量；圖7B為種子內(nèi)源IAA含量；圖7C為種子內(nèi)源ABA含量。實施例I :突變株的獲得本發(fā)明所述擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在GenBank中的編號是AT1G74310，該基因的CDS長2736bp，核苷酸序列如序列表所示(表I)，編碼911個氨基酸，氨基酸序列如序列表所示(表I)。從美國擬南芥生物資源中心Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)購買了此基因的T-DNA插入株系種子(SALK_066374)，突變株名稱為hotl，其插入位點側翼序列如表2。表1HSP101的⑶S序列和氨基酸序列I ATGAATCCAGAGAAATTCACACACAAGACAAACGAGACAATTGCTACAGCTCATGAGCTAI METAsnProGluLysPheThrHisLysThrAsnGluThrIIeAlaThrAlaHisGluLeu61 GCTGTGAATGCAGGACATGCTCAATTCACTCCTTTGCATTTAGCTGGTGCTTTGATCTCT21 AlaValAsnAlaGlyHisAlaGlnPheThrProLeuHisLeuAlaGlyAlaLeuIIeSer121GATCCCACCGGTATATTTCCTCAAGCAATCTCTAGTGCCGGTGGCGAGAACGCAGCTCAA41 AspProThrGlyIIePheProGlnAlaIIeSerSerAlaGlyGlyGluAsnAlaAlaGln181TCTGCTGAAAGAGTGATCAATCAAGCCTTGAAGAAGCTTCCTTCACAATCTCCTCCACCT61 SerAlaGluArgValIleAsnGlnAlaLeuLysLysLeuProSerGlnSerProProPro241GATGATATTCCAGCGAGTTCTAGTCTTATTAAGGTCATTCGTCGTGCTCAAGCTGCTCAG81 AspAspIleProAlaSerSerSerLeuIIeLysValIIeArgArgAlaGlnAlaAlaGln301AAGTCACGAGGTGATACTCATTTGGCTGTTGACCAGTTGATTATGGGTCTTCTTGAAGAT10ILysSerArgGlyAspThrHisLeuAlaValAspGlnLeuIIeMETGlyLeuLeuGluAsp
、
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54I GTGATTGGTCGTGATGAGGAGATTAGAAGAGTCGTGAGGATTCTTTCGAGGAGAACGAAG181 ValIIeGlyArgAspGluGluIIeArgArgValValArgIIeLeuSerArgArgThrLys60I AACAATCCTGTGCTATTGGAGAGCCAGGAGTTGGTAAAACAGCTGTGGTTGAAGGTTTA201 AsnAsnProValLeuIleGlyGluProGlyValGlyLysThrAlaValValGluGlyLeu66I GCACAAAGGATTGTGAAAGGAGATGTGCCCAACAGTCTTACTGATGTGAGATTAATTTCG221 AlaGlnArgIleValLysGlyAspValProAsnSerLeuThrAspValArgLeuIIeSer721 TTGGACATGGGTGCGTTAGTTGCTGGTGCTAAATACCGAGGAGAGTTTGAAGAAAGGTTG241 LeuAspMETGlyAlaLeuValAlaGlyAlaLysTyrArgGlyGluPheGluGluArgLeu 78I AAATCTGTTTTGAAAGAAGTTGAGGACGCTGAAGGCAAAGTGATTCTCTTTATTGATGAG261 LysSerValLeuLysGluValGluAspAlaGluGlyLysValIIeLeuPheIIeAspGlu84I ATTCATTTGGTTCTTGGTGCTGGCAAAACTGAAGGGTCGATGGATGCAGCTAATCTGTTC281 IleHisLeuValLeuGlyAlaGlyLysThrGluGlySerMETAspAlaAlaAsnLeuPhe90I AAGCCCATGTTAGCTAGAGGGCAGCTTCGATGCATTGGTGCTACAACGCTTGAAGAATAC301 LysProMETLeuAlaArgGlyGlnLeuArgCysIIeGlyAlaThrThrLeuGluGluTyr96I AGGAAATATGTTGAGAAAGATGCTGCCTTTGAGAGGAGGTTCCAACAAGTCTATGTTGCG321 ArgLysTyrValGluLysAspAlaAlaPheGluArgArgPheGlnGlnValTyrValAla1021GAGCCAAGTGTGCCTGACACCATTAGTATCCTTAGAGGACTCAAGGAGAAGTATGAGGGA341 GluProSerValProAspThrIIeSerIIeLeuArgGlyLeuLysGluLysTyrGluGly1081CATCATGGTGTGCGAATCCAAGACAGAGCTCTTATAAATGCTGCTCAGCTGTCTGCTCGT361 HisHisGlyValArgIIeGlnAspArgAlaLeuIIeAsnAlaAlaGlnLeuSerAlaArg1141TACATAACTGGTCGGCATTTACCGGATAAAGCAATTGATTTGGTTGATGAGGCTTGTGCG381 TyrlleThrGlyArgHisLeuProAspLysAlalleAspLeuValAspGluAlaCysAlaI201AATGTGAGAGTCCAGCTTGATAGTCAACCTGAAGAGATTGATAACCTTGAAAGGAAGAGG401 AsnValArgValGlnLeuAspSerGlnProGluGluIIeAspAsnLeuGluArgLysArg126IATGCAGCTGGAAATTGAACTTCACGCCTTGGAAAGGGAGAAGGATAAAGCCAGCAAAGCT421 METGlnLeuGlulleGluLeuHisAlaLeuGluArgGluLysAspLysAlaSerLysAla1321CGACTTATAGAGGTGCGGAAAGAGCTTGATGACCTGAGAGACAAGCTTCAGCCTCTCACG441 ArgLeuIIeGluValArgLysGluLeuAspAspLeuArgAspLysLeuGlnProLeuThr1381ATGAAATACAGAAAGGAGAAAGAGAGAATTGATGAGATTCGAAGGCTTAAACAGAAAAGA461 METLysTyrArgLysGluLysGluArglleAspGluIleArgArgLeuLysGlnLysArg1441GAAGAGCTCATGTTTTCTTTGCAGGAGGCAGAACGAAGATATGACCTTGCAAGAGCTGCT481 GluGluLeuMETPheSerLeuGlnGluAlaGluArgArgTyrAspLeuAlaArgAlaAlaI501GATCTAAGATATGGCGCAATTCAAGAAGTGGAATCTGCAATTGCCCAACTTGAAGGAACT501 AspLeuArgTyrGlyAlaIleGlnGluValGluSerAlalIeAlaGlnLeuGluGlyThr1561TCTTCTGAAGAGAATGTGATGCTCACAGAAAACGTTGGGCCTGAACACATTGCTGAGGTT521 SerSerGluGluAsnValMETLeuThrGluAsnValGlyProGluHisiIeAlaGluVal1621GTGAGCCGTTGGACAGGGATTCCAGTGACGAGACTTGGCCAAAATGAGAAGGAGAGGTTG541 ValSerArgTrpThrGlyIIeProValThrArgLeuGlyGlnAsnGluLysGluArgLeu1681ATTGGTCTTGCTGATAGGTTGCATAAGCGGGTTGTGGGACAGAATCAAGCGGTAAATGCA
561 IIeGlyLeuAlaAspArgLeuHisLysArgValValGlyGlnAsnGlnAlaValAsnAla1741GTTTCTGAGGCAATTCTAAGGTCAAGGGCAGGACTTGGAAGGCCACAACAGCCAACTGGA581 ValSerGluAlaIIeLeuArgSerArgAlaGlyLeuGlyArgProGlnGlnProThrGly1801TCATTCTTATTCCTTGGACCAACTGGTGTTGGCAAAACTGAGCTCGCCAAGGCTCTTGCT601 SerPheLeuPheLeuGlyProThrGlyValGlyLysThrGluLeuAlaLysAlaLeuAla
1861GAGCAGCTGTTTGATGATGAAAACCTCTTAGTTCGGATTGATATGTCGGAATATATGGAA621 GluGlnLeuPheAspAspGluAsnLeuLeuValArgIIeAspMETSerGluTyrMETGlu1921CAACACTCTGTCTCTCGCCTCATTGGGGCACCACCAGGGTATGTTGGTCACGAGGAAGGT641 GlnHisSerValSerArgLeuIIeGlyAlaProProGlyTyrValGlyHisGluGluGly1981GGACAACTAACTGAGGCTGTGAGGAGGCGACCTTATTGTGTCATACTCTTTGATGAAGTG661 GlyGlnLeuThrGluAlaValArgArgArgProTyrCysValIleLeuPheAspGluVal2041GAGAAGGCTCATGTTGCTGTCTTCAACACTCTGCTCCAAGTTTTGGATGATGGTCGATTG681 GluLysAlaHisValAlaValPheAsnThrLeuLeuGlnValLeuAspAspGlyArgLeu2101ACAGACGGGCAAGGCAGGACAGTCGATTTCAGGAACTCGGTGATAATCATGACATCAAAC701 ThrAspGlyGlnGlyArgThrValAspPheArgAsnSerValIIeIIeMETThrSerAsn2161CTTGGTGCTGAACACCTCCTTGCAGGGCTAACTGGGAAAGTAACAATGGAAGTGGCCCGG721 LeuGlyAlaGluHisLeuLeuAlaGlyLeuThrGlyLysValThrMETGluValAlaArg2221GACTGTGTGATGCGGGAGGTGAGGAAACACTTCAGACCAGAGCTCTTGAACAGGCTTGAC741 AspCysValMETArgGluValArgLysHisPheArgProGluLeuLeuAsnArgLeuAsp2281GAGATTGTGGTGTTCGACCCCCTTTCACATGACCAGTTGAGGAAAGTAGCTCGGCTTCAA761 GluIleValValPheAspProLeuSerHisAspGlnLeuArgLysValAlaArgLeuGln2341ATGAAAGACGTTGCTGTCCGGCTTGCTGAAAGAGGAGTTGCTTTGGCAGTCACTGATGCT781 METLysAspValAlaValArgLeuAlaGluArgGlyValAlaLeuAlaValThrAspAla2401GCTTTGGACTATATCTTGGCAGAGAGTTATGACCCGGTGTATGGTGCTAGGCCTATAAGG801 AlaLeuAspTyrIleLeuAlaGluSerTyrAspProValTyrGlyAlaArgProIIeArg2461AGATGGATGGAGAAGAAGGTGGTGACAGAACTGTCAAAGATGGTTGTGCGTGAGGAAATC821 ArgTrpMETGluLysLysValValThrGluLeuSerLysMETValValArgGluGluIIe2521GATGAAAACTCCACTGTTTACATAGATGCAGGCGCTGGTGATCTTGTGTACCGGGTAGAA841 AspGluAsnSerThrValTyrIIeAspAlaGlyAlaGlyAspLeuValTyrArgValGlu2581AGTGGAGGTCTAGTGGACGCTTCAACAGGCAAGAAGTCAGATGTGCTGATTCATATTGCT861 SerGlyGlyLeuValAspAlaSerThrGlyLysLysSerAspValLeuIIeHisiIeAla264IAACGGGCCAAAGAGAAGTGATGCAGCTCAGGCGGTGAAGAAGATGAGGATCGAGGAAATA881 AsnGlyProLysArgSerAspAlaAlaGlnAlaValLysLysMETArgIIeGluGluIIe2701GAAGATGACGATAATGAGGAAATGATCGAGGATTAA901 GluAspAspAspAsnGluGluMETIleGluAsp * 女 *表2插入位點側翼序列IATCTC TGATC CCACC GGTAT ATTTC CTCAA GCAAT CTCTA GTGCC GGTGG5ICGAGA ACGCA GCTCA ATCTG CTGAA AGAGT GATCA ATCAA GCCTT GAAGA10IAGCT (Length :104)
實施例2
突變株的檢驗和純合子鑒定Western Blot鑒定野生型Col和突變體hotl種子提取總蛋白，用Western Blot檢測蛋白HSPlOl的表達。結果如圖I所示，野生型種子中hsplOl基因正常表達，出現(xiàn)陽性結果，能檢測到HSPlOl蛋白；而突變體hotl，出現(xiàn)陰性結果，不能檢測到HSPlOl蛋白，說明突變體hotl中該基因確實被敲除了，不能表達。PCR鑒定純合子=T-DNA插入株系基因型的鑒定需要三條引物，分別是LP(5’_AATAAT GCG GCA AAA GAG GAG-3’)，位于基因組上T-DNA插入位點左臂端處；RP(5’ -CTG CTTGCT CAA AAT CTC-3 ’)，位于T-DNA插入位點右臂端處；T-DNA左臂端上引物BP :LBb3 :(5，-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3). PCR 引物設計參照 SIGNA(http://signal, salk. edu/tdnaprimers. 2. html)相關資料.PCR原理如圖2所不。研磨提取野生型Col和突變體hotl葉片基因組DNA做為模板進行PCR。如圖3所示，當用LP和RP這對引物進行PCR擴增并進行電泳時，在野生型植株Col中產(chǎn)生一條PCR產(chǎn)物帶，分子量大約是IlOObp，而突變體hotl植株中沒有PCR產(chǎn)物形成；當用RP和LBb3這對引物PCR擴增時，在野生型植株中沒有PCR產(chǎn)物，而在突變體hotl植株中有一條PCR產(chǎn)物帶。因此鑒定突變體hotl植株為純合子homozygote (HM)。實施例3:擬南芥中hsplOl基因敲除后具有更高的萌發(fā)勢野生型Col和突變體hotl種子置于培養(yǎng)皿中25°C光照萌發(fā)，按標準發(fā)芽試驗方法進行，每個處理設四個重復，以胚根長度與種子等長，胚芽長度達到種子一半時為發(fā)芽標準，6天計算萌發(fā)率。如圖4所示，野生型Col種子在24h、48h萌發(fā)率低于突變體hotl，突變體hotl種子具有更高的萌發(fā)勢。實施例4:擬南芥中hsplOl基因被敲除后自然儲藏中活力喪失更快種子在自然儲藏或種質(zhì)庫保存的條件下，其發(fā)芽力會逐漸喪失，發(fā)生自然老化。本實驗取2009年8月收的野生型Col和突變體hotl種子貯存在室溫下，2011年9月取貯存了兩年的種子進行萌發(fā)實驗檢測活力。置于培養(yǎng)皿中25°C光照發(fā)芽，培養(yǎng)皿中用濾紙保濕。按標準發(fā)芽試驗方法進行，15天統(tǒng)計萌發(fā)率。如圖5所示，經(jīng)過兩年的自然老化野生型Col和突變體hotl種子萌發(fā)率都有不同程度的下降，野生型Col萌發(fā)率還能達到85%，而突變體hotl種子萌發(fā)率卻降到了 60%，擬南芥中hsplOl基因被敲除后自然老化過程中活力喪失更快，更不耐儲存。實施例5:擬南芥中hsplOl基因被敲除后在人工老化過程中更加敏感將野生型Col和突變體hotl種子放在溫度為45°C，相對濕度100%的環(huán)境中，處理時間0h、12h、24h、48h、72h。處理完畢取出種子，置于用濾紙保濕的培養(yǎng)皿中25°C光照發(fā)芽。按標準發(fā)芽試驗方法進行，15天統(tǒng)計萌發(fā)率。如圖6所示，隨著高溫高濕老化處理時間的延長，野生型Col和突變體hotl種子均呈下降趨勢；突變體hotl種子更加敏感，活力下降得更快，老化處理24h開始，隨著老化時間的延長而發(fā)芽勢迅速下降。48h時萌發(fā)率幾乎為0%。
實施例6 野生型Col和突變體hotl種子中內(nèi)源激素檢測一、樣品的提取稱取O. 2g野生型Col和突變體hotl種子加入2ml樣品提取液80%的甲醇，在冰浴中研磨成勻漿，轉入IOml試管，再用2ml提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉入試管中，搖勻后放置在4°C冰箱中。4°C提取4h，3500轉/min離心8min，取上清液。沉淀中加入Iml提取液，攪勻，置4°C下再提取lh，離心，合并上清液并記錄體積，殘渣稱干重。將上清液轉入15ml玻璃離心管中，用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇，用樣品液定容。二、樣品測定(酶聯(lián)免疫測定ELISA)(I)包被在IOml包被緩沖液中加入一定量的包被抗原混勻，在酶標板每個孔中 加入lOOuL。然后將酶標板用保鮮膜包扎好，于37°C下3h。(2)洗板將包被好的板去處，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液。加入洗滌液，放置O. 5min再甩掉洗滌液。重復3此。(3)競爭加入標準物、待測樣和抗體，37°C左右O. 5h。(4)洗板將反應液甩干，加洗滌液洗板四次。(5)加二抗置 37°C溫育 O. 5h。(6)洗板將反應液甩干，加洗滌液洗板四次。(7)加底物顯色液稱取10-20mg鄰苯二胺(OPD)溶于IOml底物緩沖液中，完全溶解后加入2-4ul30%雙氧水?；靹?，在每孔中加入lOOul，然后放入濕盒內(nèi)，當顯色適當后，每孔加入50ul 2mol/L硫酸終止反應。(8)比色在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次測定標準物各濃度和各樣品490nm處的OD值。計算結果比較，如圖7所示，擬南芥中hsplOl基因被敲除后種子中赤霉素(GA3)和生長素(IAA)含量升高，而脫落酸(ABA)含量降低，有利于萌發(fā)。
權利要求
1.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發(fā)中的應用。
2.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲藏中的應用。
3.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。
4.根據(jù)權利要求I的應用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢。
5.根據(jù)權利要求2的應用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏。
6.根據(jù)權利要求3的應用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子 中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長素IAA升高，有利于萌發(fā)。
7.擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發(fā)的轉基因植物中的應用。
8.擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲藏的轉基因植物中的應用。
9.擬南芥HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。
全文摘要
提供擬南芥基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏中的應用，該基因T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的種子中的應用。本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSP101功能與種子萌發(fā)和老化有關，該基因缺失可使得擬南芥種子對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏，同時內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSP101能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/82GK102643855SQ20121001230
公開日2012年8月22日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權日2012年1月16日
發(fā)明者李唯奇, 禹曉梅, 郁步竹, 陶發(fā)清 申請人:中國科學院昆明植物研究所