專利名稱：：細(xì)胞擴增方法和藉此產(chǎn)生的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基用于治療的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞擴增方法、藉此產(chǎn)生的細(xì)胞群及其用途。具體地本發(fā)明涉及擴增來自胎盤或脂肪組織(貫穿于整個PCT中)的粘附細(xì)胞(adherentcell)的方法及其例如用于造血干細(xì)胞移植的治療用途。在曰益發(fā)展的醫(yī)學(xué)界，為了細(xì)胞移入和組織工程目的越來越需要大量成人干細(xì)胞。另外，成人干細(xì)胞療法正持續(xù)不斷地開發(fā)用于治療和治愈各種病癥，例如造血功能障礙、心臟病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、燒傷、肌肉萎縮癥、自身免疫病、糖尿病和關(guān)節(jié)炎。造血干細(xì)胞(HSC)是祖細(xì)胞，其產(chǎn)生髓系和淋巴系的所有血細(xì)胞類型。移植的HSC的移入和啟動造血作用取決于HSC在受者骨髓中的歸巢和增生的能力。普遍公認(rèn)千細(xì)胞在體內(nèi)與骨髓中離散的龕(niche)有密切的聯(lián)系，所述龕提供了經(jīng)由細(xì)胞間接觸或短距離作用共同介導(dǎo)干細(xì)胞分化和自我更新的分子信號。這些龕是"造血誘導(dǎo)性微環(huán)境"(HIM)的部分，由骨髓細(xì)胞即巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成。骨髓細(xì)胞通過提供促進(jìn)細(xì)胞間接觸的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和基底膜組分來保持HIM功能完整性。它們還提供用于控制造血細(xì)胞分化和增殖所需的各種可溶性或常駐性細(xì)胞因子。需要HSC和基質(zhì)之間的相互作用以保護HSC生存力并防止其分化。在HSC移植后，移植的HSC在其增殖和分化之前必須歸巢到骨髓(BM)微環(huán)境并駐留在合適龕中。在歸巢過程中，移植的HSC離開血流，并通過隨趨化因子梯度穿過BM內(nèi)皮細(xì)胞屏障到達(dá)專用龕來轉(zhuǎn)移。然后供者HSC必須歸巢到造血龕，在那里它們遇到對其分裂更有利的微環(huán)境，在那里HSC與間充質(zhì)細(xì)胞、ECM和分泌的生長因子之6間可建立連續(xù)統(tǒng)一的物理和化學(xué)接觸。所有這些過程涉及一系列復(fù)雜的分子，例如細(xì)胞因子、趨化因子、激素、類固醇、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、細(xì)胞間相互作用蛋白、熟附蛋白和基質(zhì)蛋白。移入到BM專用龕的細(xì)胞總數(shù)構(gòu)成HSC移植成功的基礎(chǔ)。為了完成移入，移植到血液循環(huán)的供者HSC應(yīng)該歸巢到其產(chǎn)生功能性血細(xì)胞生成集落(hematopoiesisfoci)的受者骨髓中。這些灶的數(shù)目可從輸注的HSC總數(shù)乘以其移入效率的積來推算。HSC移植涉及的主要問題之一是這些細(xì)胞在接受者系統(tǒng)中存活率低。充分證明的是，靜脈內(nèi)移植的HSC被從循環(huán)中清除并在其灌輸后數(shù)分鐘內(nèi)在BM中顯現(xiàn)。HSC移植后3-5小時，在受者的外周血中檢測不到供者細(xì)胞[Askenasy等2002,移植的造血細(xì)胞在體內(nèi)叢生于受者骨髓中(Transplantedhematopoieticcellsseedinclustersinrecipientbonemarrowinvivo).StemCells.20:301-10]。灌輸后不久大量的移植細(xì)胞被破壞。因此，受者骨髓建群有效性低，移植后2-3天在受者BM中檢測到的所輸注細(xì)胞僅為1-5%[Kerre等2001，CD3々+M+和CD34+38-兩種細(xì)胞特異性歸巢到NOD/LtSZscid/scid小鼠骨髓但顯示不同的擴增動力學(xué)(BothCD34+38+andCD34+38-cellshomespecificallytothebonemarrowofNOD/LtSZsdd/scidmicebutshowdifferentkineticsinexpansion).JImmunol.167:3692-8;Jetmore等2002，移植到條件化NOD/SCID受者中的靜止和循環(huán)的人CD34(+)細(xì)胞的歸巢效率、細(xì)胞周期動力學(xué)和存活率(Homingefficiency,cellcyclekinetics,andsurvivalofquiescentandcyclinghumanCD34(+)cellstransplantedintoconditionedNOD/SCIDrecipients).Blood.99:1585-93]。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MesenchymalStromalCell)(MSC)為異質(zhì)細(xì)胞群，能夠分化為不同類型的成熟間充質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞受到各種生物活性因子影響而分化為網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨祖細(xì)胞(osteogenicprecursorcell)。MSC支持HSC移入的用途已為本領(lǐng)域所知。若干出版物已經(jīng)證明當(dāng)與間充質(zhì)干細(xì)胞共同移植時，HSC的移入效率更高[Gurevitch等1999，在供體基質(zhì)微環(huán)境中同種異體或異種骨髓移植(Transplantationofallogeneicorxenogeneicbonemarrowwithinthedonorstromalmicroenvironment).Transplantation.68:1362-8;Fan等2001，通過纟至門靜脈注射骨髓細(xì)胞成功實施同種異體骨髓移植(BMT):基質(zhì)細(xì)胞作為促進(jìn)BMT6勺纟田月包(Successfblallogeneicbonemarrowtransplantation(BMT)byinjectionofbonemarrowcellsviaportalvein:stromalcellsasBMT-facilitatingcells).StemCells.19:144-50]。還證明了在人羊移入模型中共同移植人間充質(zhì)干細(xì)胞導(dǎo)致促i^AHSC嵌合BM在動物中的長期移入[Almeida-Porada等2000,將人基質(zhì)細(xì)胞祖先共同移植到免疫前的胎羊中導(dǎo)致在循環(huán)中早期出現(xiàn)人供者細(xì)胞并在移植后的稍后時間點提高骨髓中的細(xì)胞7K平(Co-transplantationofhumanstromalcellprogenitorsintopreimmunefetalsheepresultsinearlyappearanceofhumandonorcellsinthecirculationandboostscelllevelsinbonemarrowatlatertimepointsaftertransplantation).Blood.95:3620-7]。發(fā)J見同時注射HSC和間充質(zhì)干細(xì)胞加速血細(xì)胞生成[Zhang等2004，StemCells.22:1256-62]。最近，這些發(fā)現(xiàn)擴展到更近緣的動物模型一獼猴。當(dāng)共同移植單倍體同一性(haploidentical)的HSC和間充質(zhì)干細(xì)胞時，證明是促進(jìn)了HSC移入[Liu等2005，ZhonghuaXueYeXueZaZhi.26:385-8]。最近還報道了使用間充質(zhì)干細(xì)胞來促進(jìn)HSC移入人類對象[KocON,JClinOncol.2000;18:307-316:LazarusHM,BiolBloodMarrowTransplant.2005May;11(5):389-98]。顯然，MSC對造血移入的貢獻(xiàn)在于產(chǎn)生幫助介導(dǎo)并平衡所移植HSC的歸巢、自我更新和定向潛能的HSC支持性細(xì)胞因子；復(fù)原受損的HSC歸巢和增殖所需造血微環(huán)境；以及抑制源自供者的T細(xì)胞(可引起移植物抗宿主病(GvHD))，[CharbordP.和Moore，K.,爿朋.iV:K5W.1044:159-167(2005);美國專利第6,010,696號；第6555374號]。例如，在Maitra的研究中[MaitraB等，BoneMarrowTransplant.33(6):597-604.(2004)]發(fā)現(xiàn)在NOD-SCID小鼠模型中，人間充質(zhì)干細(xì)胞8支持非親緣供者造血干細(xì)胞和受抑制的T細(xì)胞激活，表明非親緣源自人骨髓的MSC可改進(jìn)同種異體移植結(jié)果。使用MSC的一個主要障礙是難以分離大量的這些正常存在的細(xì)胞群，其從技術(shù)上來說是困難的且耗費大，部分是由于細(xì)胞數(shù)量有P艮。MSC最明顯的來源是骨髓，但涉及獲得骨髓吸出物和活檢風(fēng)險的顯著不便之處成為這些方法的缺點。人胚胎和胎兒形成獨立生命這一普遍持有觀點使得人胚胎作為干細(xì)胞來源有了疑問，在已經(jīng)存在的邏輯困難之上又增加了宗教和倫理方面的問題。近來已在嘗試從備選來源中發(fā)現(xiàn)可收獲的干細(xì)胞。這樣的備選來源有例如脂肪組織、毛嚢、睪丸、人嗅粘膜、胚胎卵黃嚢、胎盤、青少年皮膚和血液(例如臍帶血甚至月經(jīng)血)。然而，從備選來源收獲足夠量的干細(xì)胞用于治療和研究目的仍受限制且通常是費事的，其涉及例如從供者對象或患者收獲細(xì)胞或組織、體外培養(yǎng)和/或繁殖細(xì)胞、解剖(dissection)等等。胎盤被認(rèn)為是干細(xì)胞最有可能的來源之一，不涉及任何不便之處或倫理約束。發(fā)現(xiàn)源自胎盤的MSC具有與源自BM的MSC相似的特性。它們能粘附塑料，表達(dá)CD105、CD73和CD90膜標(biāo)記，且缺乏CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR表面分子的表達(dá)。然而，不象源自BM的MSC，經(jīng)干擾素-y處理的源自胎盤的MSC(placentaderived-MSC,PD-MSC)極低P艮度地上調(diào)HLA-DR。此外，PD-MSC細(xì)胞在干擾素-Y存在下顯示出提高的免疫抑制特性。(ChangCJ,YenML,ChenYC,ChienCC，HuangHI，BaiCH，YenBL.在干擾素-y存在下源自胎盤多潛能細(xì)胞顯示出提高的免疫抑制特性(Placenta-derivedMultipotentCellsexhibitimmunosuppressivepropertiesthatareenhancedinthepresenceofinterferon-gamma).StemCells.2006Nov;24(11):2466畫77,)。除MSC標(biāo)記之外，PD-MSC還顯示出獨特的ESC表面標(biāo)記SSEA-4、TRA-1-61和TRA-l-80，提示這些可能是極為原始的細(xì)胞。(YenBL,HuangHI，ChienCC，JuiHY,KoBS,YaoM,ShunCT,YenML,LeeMC,ChenYC.從人足月胎盤分離多潛能細(xì)胞(Isolationofmultipotentcellsfromhumantermplacenta).StemCells.2005;23(1):3-9)。此外，PD-MSC(胎兒來源)而非源自BM的MSC對于細(xì)胞內(nèi)人白細(xì)胞抗原-G(HLA)為陽性(ChangCJ,YenML,ChenYC，ChienCC，HuangHI,BaiCH,YenBL,在干擾素-y存在下源自胎盤多潛能細(xì)胞顯示出提高的免疫抑制特性(Placenta-derivedMultipotentCellsexhibitimmunosuppressivepropertiesthatareenhancedinthepresenceofinterferon-gamma).StemCells.2006Nov;24(11):2466-77.)。研究表明PD-MSC的擴增潛能顯著高于源自成人BM的MSC(YenBL,HuangHI,ChienCC,JuiHY，KoBS,YaoM,ShunCT,YenML，LeeMC,ChenYC，從人足月胎盤分離多潛能細(xì)胞(IsolationofMultipotentcellsfromHumanTermPlacenta).StemCells.2005;23(l):3-9;M丄S.deGroot-Swings,FransH丄Claas,WillemE.Fibbe和HumphreyH.H.PieternellaS.in'tAnker，SiccoA.Scherjon,CarinKleijburg-vanderKeur,Godelieve.從人中胎盤分離胎兒或母體來源的間充質(zhì)干細(xì)月包(PlacentaIsolationofMesenchymalStemCellsofFetalorMaternalOriginfromHuman).ce〃s,2004;22;1338-1345)。另外，源自胎盤的粘附細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)源自胎盤的MSC如源自BM的MSC—樣阻抑臍帶血(UCB)淋巴細(xì)胞增殖，這表明聯(lián)合移植HSC和源自胎盤(PD)-MSC可降低受者潛在的移植物抗宿主病(GvHD)[LiCD等，CellRes.Jul;15(7):539-47(2005)]，并且可增強造血支持[ZhangYi等，ChineseMedicalJournal117(6):882-887(2004)]。胎盤作為羊膜上皮細(xì)胞來源的應(yīng)用教導(dǎo)于例如WO00/73421中，但得到這些細(xì)胞仍很麻煩，并且MSC產(chǎn)率極低。解決MSC量有限問題的另一方法是用不同的培養(yǎng)條件離體擴增這些細(xì)胞[例如美國專利第6,326,198號；第6030836號；第6555374號；第6,335,195號；第6,338,942號]。然而，這樣的方法的缺點仍在于耗時、需要特定選擇和分離程序，使得這些方法花費大、難實施。在若干研究中發(fā)現(xiàn)三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)在產(chǎn)量上更為有效[MaT等，生物工程進(jìn)展(BiotechnologyProgress).BiotechnolProg15:715-24(1999);YubingXie,TissueEngineering7(5):585-598(2001)]。模擬MSC天然環(huán)境的3D培養(yǎng)方法的應(yīng)用基于將這些細(xì)胞接種到以下生物反應(yīng)器中含有Polyactive泡沫的灌注式生物反應(yīng)器[Wendt,D.等，BiotechnolBioeng84:205-214,(2003)]、管狀聚L乳酸(PLLA)多孔支架的徑向流灌注式生物反應(yīng)器[Kitagawa等，BiotechnologyandBioengineering93(5):947-954(2006)]、和用于培養(yǎng)和擴增造血干細(xì)胞的推流式生物反應(yīng)器(美國專利第6,911,201號)。在美國專利第6,022,743號中提出粘附基質(zhì)細(xì)胞的三維框架，在Hosseinkhani,H等，[TissueEngineering11(9-10):1476-1488(2005)]中提出海綿膠原作為3D基質(zhì)。然而，這些研究中無一曾提及在這些條件下生長的MSC用于在HSC移植后支持體內(nèi)移入HSC的用途。還需要耗時來為特定細(xì)胞類型優(yōu)化各種條件(例如灌注條件)或各種分離技術(shù)。在美國專利第7045148號和美國專利申請第20020123141號、第20030032179號和第2005011871號中提出灌注的產(chǎn)后胎盤作為3D反應(yīng)器用于培養(yǎng)MSC的用途。然而，該方法受限于要待到胎盤分離后24小時并涉及灌注，因此，細(xì)胞的群集生長(massgrowth)且其在延長的時間周期內(nèi)維持是不可能的。因此，普遍公認(rèn)需要且將極為有利的是具備不存在上述限制的新穎，途。發(fā)明簡述本發(fā)明一方面提供細(xì)胞擴增方法，所述方法包括在支持細(xì)胞擴增的三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞。本發(fā)明另一方面提供產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括在允許細(xì)胞擴增的三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞；和收集擴增的粘附細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，藉此產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。本發(fā)明又一方面提供根據(jù)上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群。本發(fā)明再一方面提供分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞分泌比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自SCF、IL-6和Flt-3的至少一種因子。本發(fā)明另外方面提供分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)的更高水平的選自H2A組蛋白家族(H2AF)、醛脫氫酶X(ALDHX)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(EEEF2)、網(wǎng)釣結(jié)合蛋白3、EF-手形4丐結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RCN2)和4丐調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(CNN1)的至少一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明又一方面提供分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)的更低表達(dá)水平的選自核內(nèi)不均一核糖核蛋白H1(Hnrphl)、CD44抗原同種型2前體、3磷酸腺苷5磷酰疏酸合成酶2同種型a(Papss2)和核糖體蛋白L7a(rpL7a)的至少一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明再一方面提供分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞特征為比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞的免疫抑制活性更高。根據(jù)下述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的另外特征，免疫抑制活性包含降低T細(xì)胞增殖。本發(fā)明另一方面提供藥物組合物，其包含作為活性成分的按照上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群。本發(fā)明另一方面提供藥物組合物，其包含作為活性成分的按照上述方法產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明又一方面提供藥物組合物，其包含作為活性成分的上述分離的細(xì)胞群。本發(fā)明再一方面提供治療有其需要的對象中可受益于基質(zhì)細(xì)胞移植的病癥的方法，所述方法包括給予該對象治療有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞，藉此治療該對象中可受益于干細(xì)胞移植的病癥。本發(fā)明再一方面提供治療有其需要的對象中可受益于基質(zhì)細(xì)胞移植的病癥的方法，所述方法包括給予該對象治療有效量的源自選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，藉此治療對象中可受益于千細(xì)胞移植的病癥。本發(fā)明再一方面提供降低有其需要的對象中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予該對象治療有效量的權(quán)利要求3、4、5、6或7的分離的細(xì)胞群，以此降低該對象的免疫應(yīng)答。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，用細(xì)胞療法治療該對象。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，該方法進(jìn)一步包括給予干細(xì)胞。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，該干細(xì)胞包含造血干細(xì)胞。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，將所述細(xì)胞與條件培養(yǎng)基或粘附細(xì)胞同時給予。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，在給予條件培養(yǎng)基或粘附細(xì)胞后給予所述細(xì)胞。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，該粘附細(xì)胞從三維培養(yǎng)獲《曰付。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，該粘附細(xì)胞從二維培養(yǎng)獲4曰付。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述病癥選自干細(xì)胞缺乏癥、心臟病、帕金森氏病、癌癥、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、燒傷、組織缺損(lossoftissue)、失血、貧血癥、自身免疫病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、移植物抗宿主病(GvHD)、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、Sjorgen綜合征、多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無力(MG)、格-巴綜合征(GBS)、橋本曱狀腺炎(HT)、格雷夫斯病、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和炎癥性腸病。才艮據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述三維培養(yǎng)包含3D生物反應(yīng)器。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述生物反應(yīng)器選自推流式生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器和固定床生物反應(yīng)器。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，細(xì)胞培養(yǎng)在連續(xù)流動培養(yǎng)基中進(jìn)行。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，三維培養(yǎng)包含粘附材料選自聚酯、聚鏈烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶瓷顆粒、matrigel(基質(zhì)膠)、細(xì)胞外基質(zhì)組分、膠原、聚L乳酸和惰性金屬纖維。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，直到粘附細(xì)胞達(dá)到至少60%匯合(confluence)才完成所述培養(yǎng)。才艮據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述病癥可受益于對造血干細(xì)胞移入的促進(jìn)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞包含選自CD73、CD90、CD29和CD105的陽性標(biāo)記表達(dá)系歹寸(markerexpressionarray)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞包含選自CD45、CD80、HLA-DR、CDllb、CD14、CD19、CD34和CD79的陰性標(biāo)記表達(dá)系列。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞分泌比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自SCF、Flt-3和IL-6的至少一種因子。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自H2A組蛋白家族(H2AF)、醛脫氬酶X(ALDHX)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(EEEF2)、網(wǎng)釣結(jié)合蛋白3、EF-手形鉤結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RCN2)和鈣調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(CNN1)的至少一種蛋白質(zhì)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更低表達(dá)水平的選自核內(nèi)不均一核糖核蛋白Hl(Hnrphl)、CD44抗原同種型2前體、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同種型a(Papss2)和核糖體蛋白L7a(rpL7a)的至少一種蛋白質(zhì)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述粘附細(xì)胞或培養(yǎng)基特征為比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞免疫抑制活性更高。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述免疫抑制活性包含降低T細(xì)胞增殖。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述細(xì)胞包含具有基質(zhì)干細(xì)胞表型的細(xì)胞根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述基質(zhì)干細(xì)胞表型包含T細(xì)胞抑制活性。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，所述基質(zhì)干細(xì)胞表型包含造血干細(xì)胞支持活性。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的再一特征，上述細(xì)胞群的用途為制備用于鑒定移植的藥物。本發(fā)明通過提供新穎的細(xì)胞擴增方法和藉此產(chǎn)生的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基用于治療的用途，成功解決目前已知結(jié)構(gòu)(configuration)中的缺點。除非另外定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解相同的含義。在本發(fā)明實踐或試驗中，盡管可使用與本文所述相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧希m宜的方法和材料15如下文所述。在有沖突的情況下，包括定義在內(nèi)的本專利說明書將起主導(dǎo)作用。另外，材料、方法和實施例僅為說明性的，并非意欲限制。附圖簡述本發(fā)明于此僅通過與附圖有關(guān)的實例來闡述。強調(diào)的是，于此與具體附圖有關(guān)的詳細(xì)內(nèi)容通過實施例出示且僅旨在闡述性地討論本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且是為了提供什么被認(rèn)為是本發(fā)明原理和構(gòu)思方面的最有用和最易理解的說明而提出。在這一點上，不試圖比基本理解本發(fā)明所需的更詳細(xì)地顯示本發(fā)明結(jié)構(gòu)性細(xì)節(jié)，對附圖所作的說明使得本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明的幾種形式在實踐中是怎樣具體化的。在附圖中圖1a-g描述在含有3-D載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中創(chuàng)造的類骨微環(huán)境。圖la-b是描述天然骨(圖la)與在接種粘附基質(zhì)細(xì)胞(3D-ASC)后7天PluriXTM3D栽體結(jié)構(gòu)的仿造骨微環(huán)境(圖lb)的比較電子顯微圖。圖lc-f是描述用從骨髓產(chǎn)生的3D-ASC接種的PluriXTM3D基質(zhì)在接種后20天(圖lc-d，分別放大X150和250)和40天(圖le-f,分別放大X350和500)的電子顯《敬圖。圖lg是具有由編號定義的單獨部件的Plurix3D推流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)基庫(l)、混合氣體供給(2)、過濾器(3)、注射點(4)、在其中放置3D載體的柱(5)、流量監(jiān)控器(6)、流量閥(6a)、分離容器(7)、細(xì)胞生長分析儀(8)、蠕動泵(9)、取樣點(IO)、溶02測量電極(11)、pH測量電極(12)、控制系統(tǒng)(13)、新鮮生長培養(yǎng)基(14)、用過的生長培養(yǎng)基(15)。圖2是描述在生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)3D生長條件下生長的來源于胎盤的粘附基質(zhì)細(xì)胞不同生產(chǎn)批次(lot)圖(3D-ASC;批次5-8)。將ASC(2X106)以10000-15000個細(xì)胞/載體的密度接種到生物反應(yīng)器。培養(yǎng)12天后，3D-ASC的密度達(dá)到150，000-250,000個細(xì)胞/載體或含有150個載體的生物反應(yīng)器中22.5-37.5X106個。。圖3a-b是描述比較在源自胎盤的3D-ASC中表達(dá)的膜標(biāo)記(暗紫色)與在常規(guī)2D培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的胎盤細(xì)胞中的膜標(biāo)記(淡紫色)的表達(dá)水平差異的條形圖。粘附細(xì)胞在培養(yǎng)瓶(2D)中生長4-6周，或在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中于聚苯乙烯載體(3D)上生長2-3周。使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶或載體經(jīng)收獲后，孵育并與識別MSC(圖3a)或造血細(xì)胞(圖3b)膜標(biāo)記特征的一組單克隆抗體(MAb)結(jié)合。注意到在2D培養(yǎng)細(xì)胞中的MSC膜標(biāo)記表達(dá)(如對于CD90、CD105、CD73和CD29膜標(biāo)記所示)比在3D培養(yǎng)的粘附細(xì)胞中表達(dá)的MSC膜標(biāo)記明顯更高，尤其是CD105，在3D培養(yǎng)細(xì)胞中顯示56。/。表達(dá)，相比較在2D培養(yǎng)細(xì)胞中為87%(圖3a)。2D和3D二者培養(yǎng)物中的ASC都不表達(dá)任何造血膜標(biāo)記(圖3b)。圖4a-d是描述比較在2D和3D條件或在2D和3D條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)的從胎盤產(chǎn)生的ASC的蛋白質(zhì)水平的條形圖。圖4a-c描述由ELISA分析以pg/ml(標(biāo)準(zhǔn)化為1X106個細(xì)胞/ml)2D和3D條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ASC的Flt-3配體(圖4a)、IL-6(圖4b)和SCF(圖4c)的水平。結(jié)果代表三個獨立實驗之一。圖4d顯示不同細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平，根據(jù)用iTRAQ試劑標(biāo)記之間比較的蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜法分析。蛋白樣品采自在2D(白條)和3D(灰條)條件下生長的ASC。該圖代表兩個重復(fù)實驗中的一個。注意到2D和3D培養(yǎng)條件的條件培養(yǎng)基及細(xì)胞中某些蛋白的表達(dá)水平的差異。圖5a-d是描述源自胎盤的3D-ASC在體外分化為成骨細(xì)胞的能力的顯微照片。源自人胎盤的ASC在導(dǎo)成骨分化的培養(yǎng)基(含有10%FCS、100nM地塞米松、0.05mM抗壞血酸2-磷酸鹽、10mMB-甘油磷酸鹽的DMEM)中培養(yǎng)3周時間。圖5a-b顯示表達(dá)4丐化基質(zhì)的細(xì)胞，才艮據(jù)由AlizzarinRedS染色所示。圖5c-d顯示不用導(dǎo)成骨分化的培養(yǎng)基處理的對照細(xì)胞，其保持成纖維細(xì)胞樣表型并證明沒有礦化。圖6是描述在移植后用化學(xué)療法(連續(xù)2周腹膜內(nèi)注射25mg/kg白消安(busulfan))治療3.5周的NOD-SCID小鼠骨髓(BM)中檢測的人CD45+細(xì)胞百分比的圖表。將從源自臍帶血的單核細(xì)胞純化的CD34+細(xì)胞(100，000)單獨移植(5只小鼠，a)，或與在2D條件下培養(yǎng)的0.5X1()6個源自胎盤的粘附細(xì)胞共同移植(2D-ASC;2只小鼠，b)，或與在pluriXTM生物反應(yīng)器中3D條件下培養(yǎng)的源自胎盤的粘附細(xì)胞(3D-ASC)共同移植(5只小鼠，c)。然后從小鼠大腿骨和脛骨收集BM。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BM中的人細(xì)胞。通過讓細(xì)胞與抗人CD45-FITC孵育來測定表達(dá)CD45的人細(xì)胞的百分比。注意到與單用HSC處理小鼠中的人類細(xì)胞的百分比(a)相比，與2D-ASC(b)以及與3D-ASC(c)共同移植的小鼠骨髓中的人細(xì)胞(hCD45+)的百分比更高。在經(jīng)3D-ASC培養(yǎng)細(xì)胞處理的小鼠中觀察到比經(jīng)2D-ASC培養(yǎng)細(xì)胞處理的小鼠更高的移入，表明了經(jīng)3D培養(yǎng)的ASC所特有的更高治療優(yōu)勢。圖7a-b是僅用CD34+細(xì)胞移植的小鼠中的人移植CD45+細(xì)胞(圖7a)與CD34+細(xì)胞加源自脂肪組織的ASC(圖7b)比較的FACS分析。注意到與單用人CD34+處理的小鼠中的(7b-12。/。)相比，用源自脂肪組織的ASC共同移植的小鼠中的人造血群體(hCD45+)百分比(7a-290/0)明顯更高。圖8是描述在人臍帶血單核細(xì)胞(CB)與等輻射量(3000Rad)臍帶血細(xì)胞(iCB)、源自人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、2D培養(yǎng)的(2D)或3D培養(yǎng)的(3D)胎盤ASC、或PBMC和2D及3D培養(yǎng)的胎盤ASC的聯(lián)合(PBMC+2D和PBMC+3D)之間進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的條形圖。CB細(xì)胞群大小由311-胸苷吸收(以CPM測量)來表示，在培養(yǎng)的最后18小時內(nèi)測量。受刺激的CB細(xì)胞增殖升高說明較高的免疫應(yīng)答水平。注意到與粘附細(xì)胞孵育的細(xì)胞顯示出較低的免疫應(yīng)答水平，特別是在與粘附細(xì)胞共同孵育時，對PBMC的CB免疫應(yīng)答減少。每一反應(yīng)作三個重復(fù)。優(yōu)選實施方案說明本發(fā)明為新穎的細(xì)胞擴增方法和藉此產(chǎn)生的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基用于干細(xì)胞相關(guān)治療、干細(xì)胞移入和HSC支持的用途。參考附圖和隨附說明可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)解釋至少一種本發(fā)明實施方案之前，應(yīng)該理解本發(fā)明申請不限于在以下說明所闡述的或?qū)嵤├C中的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實施方案或以各種方式實踐或?qū)嵤?。還應(yīng)該理解，本文所用措辭和術(shù)語是為了說明目的，不應(yīng)該認(rèn)作限制。在曰益發(fā)展的醫(yī)學(xué)界，為了臨床和研究目的越來越需要干細(xì)胞，更具體地是基質(zhì)干細(xì)胞(也稱為"間充質(zhì)干細(xì)胞")。MSC用于支持HSC移植和移入，也用于治療越來越多種病癥，例如心臟病、BM缺乏癥、神經(jīng)元相關(guān)疾病和需要器官或組織移植的病癥。使用干細(xì)胞的障礙在于分離大量正常存在的干細(xì)胞或祖細(xì)胞群技術(shù)上困難，原因為這些細(xì)胞在大部分組織中數(shù)量有限，在得到干細(xì)胞的方法中涉及不便之處和風(fēng)險，并且用目前的收獲方法伴隨記憶B細(xì)胞和造血干細(xì)胞損失。從人胚胎獲得細(xì)胞在已經(jīng)存在的技術(shù)困難之上又增加了宗教和倫理方面的問題。源自骨髓的干細(xì)胞的備選來源包括脂肪組織和胎盤。然而，目前尚無有效擴增來自這些組織的干細(xì)胞的方法。在將本發(fā)明付諸于實踐時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞可在3D培養(yǎng)條件下有效繁殖。本發(fā)明人出乎意料之外地發(fā)現(xiàn)這樣的細(xì)胞包含與MSC相似的功能特性，因此，這些細(xì)胞和由此產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基可用作治療目的，例如移植、組織再生和體內(nèi)HSC支持。如下文和以下實施例部分所述，本發(fā)明人能夠在3D環(huán)境中擴增包含基質(zhì)干細(xì)胞特性的源自脂肪組織和胎盤的粘附細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)據(jù)此擴增的細(xì)胞在低溫P&藏后有活力，這由粘附和重形成群體測定(repopulationassay)證明(參見實施例1)。源自胎盤的粘附細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)記表達(dá)型式(參見圖3a-b)。最重要的是，在2D或3D環(huán)境中繁殖的源自脂肪組織和胎盤的粘附細(xì)胞能夠支持HSC移入(參見實施例2)，其證實了本發(fā)明細(xì)胞作為基質(zhì)干細(xì)胞在臨床上的用途。因此，本發(fā)明一方面提供細(xì)胞擴增的方法。所述方法包括在支持細(xì)胞擴增的三維(3D)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞。本文所用術(shù)語"擴增的"和"擴增"指基本上不分化地維持細(xì)胞及最終細(xì)胞生長，即使細(xì)胞群增加(例如至少到2倍)而不存在伴隨所述增加的分化。本文所用術(shù)語"維持的"和"維持"指基本上不分化的細(xì)胞更新，即基本上穩(wěn)定細(xì)胞群而不存在伴隨所述穩(wěn)定的分化。本文所用短語"粘附細(xì)胞"指具有貼壁依賴性的同質(zhì)或異質(zhì)細(xì)胞群，即細(xì)胞為了在體外生長需要粘附表面。本文所用短語"脂肪組織"指包含脂肪細(xì)胞(adipocyte)的結(jié)締組織。本文所用術(shù)語"胎盤組織，，指沿著子宮壁并在懷孕期間包裹胎兒的哺乳動物雌性器官的任何部分，胎盤和胎兒通過臍帶連接。出生后胎盤剝離(稱為產(chǎn)后胎盤)。本文所用短語"三維培養(yǎng)條件"指將細(xì)胞置于與細(xì)胞生長相容同時使得細(xì)胞可以在多于一層上生長的條件。完全可將細(xì)胞在活生物體(或組織)中的原位環(huán)境理解為三維構(gòu)造。細(xì)胞被其它細(xì)胞圍繞。它們被固定在使得可建立各種局部微環(huán)境的納米級細(xì)胞外基質(zhì)纖維的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)中。它們的胞外配體不僅介導(dǎo)對基底膜的附著，而且還通向多種血管和淋巴管。氧、激素和營養(yǎng)素被運送到細(xì)胞而廢物則被運出。本發(fā)明三維培養(yǎng)條件設(shè)計為模擬例如以下進(jìn)一步作為例證的環(huán)境。因此，本發(fā)明這方面的粘附細(xì)胞從脂肪組織或胎盤組織提取?？蓮淖阍禄蛟绠a(chǎn)胎盤得到胎盤細(xì)胞。優(yōu)選一旦外出血就收集胎盤。優(yōu)選在足以除去殘留細(xì)胞的時間內(nèi)灌注胎盤。本文所用術(shù)語"灌注(perfiise或perfusion)"指將液體傾注或使液體通過器官或組織的行為。胎盤組織可來自任何哺乳動物；最優(yōu)選的胎盤組織是人的胎盤組織。胎盤組織方便的來源是產(chǎn)后胎盤(例如1-6小時)，然而，胎盤組織或細(xì)胞的來源或分離胎盤組織的方法對于本發(fā)明而言并不重要。源自胎盤的粘附細(xì)胞可來自胎盤的胎兒(即羊膜或胎盤內(nèi)部部分，參見實施例l)和母體(即基蛻膜和壁蛻膜)部分。在生理鹽水緩沖液[例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或Hank緩沖液)中洗滌組織樣品。通過用消化酶處理組織(參見下面)或/和切碎(mince)并用洗滌培養(yǎng)基經(jīng)過尼龍濾器沖洗組織部分或通過輕輕吹打(Falcon,Becton,Dickinson,SanJose,CA)，制備單細(xì)胞懸浮液。源自脂肪組織的粘附細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來分離。例如，這樣的方法闡述于美國專利第6,153,432號。脂肪組織可源自網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳腺、性腺或其它脂肪組織部位。優(yōu)選脂肪組織來源為網(wǎng)膜脂肪組織。在人類中，脂肪組織通常通過吸脂來分離。從脂肪組織分離粘附細(xì)胞可通過在如下條件處理組織得到用消化酶(例如膠原酶、胰蛋白酶和/或分散酶；和/或有效濃度的透明質(zhì)酸酶或DNA酶)；和乙二胺四乙酸(EDTA);在25-50。C的溫度作用10分鐘-3小時。然后可以讓細(xì)胞通過20微米-800微米的尼龍或粗棉布網(wǎng)濾器。然后讓細(xì)胞直接在培養(yǎng)基中或經(jīng)過Ficoll或Percoll或其它顆粒梯度進(jìn)行差速離心。細(xì)胞在4-50。C溫度以100-3000xg速度離心1分鐘-1小時(參見美國專利第7,078,230號)。除源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞外，本發(fā)明還展望特征為基質(zhì)干細(xì)胞表型(其將在下文進(jìn)一步闡述)的來自其它細(xì)胞來源的粘附細(xì)胞的用途?？蓮钠渲刑崛≌掣郊?xì)胞的組織來源包括但不限于臍帶血、毛嚢[例如美國專利申請第200601W3(M號所述]、睪丸[例如GuanK.等，Nature.2006Apr27;440(7088):1199-203所述]、人嗅粘膜[例如Marshall,CT.等，HistolHistopathol.2006Jun:21(6):633-43所述]、胚胎卵黃嚢[例如GeijsenN,Nature.2004Jan8;427(6970):148-54所述]和羊膜水[Pietemella等(2004)StemCells.22:1338-1345]，已知它們所有的都包括間充質(zhì)干細(xì)胞。來自這些組織來源的粘附細(xì)胞可以通過使這些細(xì)胞在粘附表面上培養(yǎng)分離，由此從其它細(xì)胞原始群中分離出粘附細(xì)胞。不管是什么來源(例如胎盤或脂肪組織)，優(yōu)選在無菌條件下提取細(xì)胞。一旦得到分離的細(xì)胞，就使其粘附到粘附材料(例如構(gòu)成表面)上，藉此分離粘附細(xì)胞。這可在于3D培養(yǎng)條件中培養(yǎng)之前(參見實施例l)或同時進(jìn)行。本文所用"粘附材料"指具有可讓細(xì)胞保持在其表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如荷有表面暴露基團)的人工合成、天然存在或其組合的無毒(即生物相容)材料?？捎糜诒景l(fā)明這方面的粘附材料實例包括但不限于聚酯、聚鏈烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶資顆粒、matrigel、細(xì)胞外基質(zhì)組分(例如纖維粘連蛋白、軟骨粘連蛋白、層粘連蛋白)、膠原、聚L乳酸和惰性金屬纖維。用本領(lǐng)域熟知方法可實現(xiàn)進(jìn)一步純化或富集基質(zhì)干細(xì)胞的步驟(例如通過用基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的FACS,其在下文進(jìn)一步闡述)。養(yǎng)基Eagle、ADC-1、LPM(無牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培養(yǎng)基(進(jìn)行和不進(jìn)行Fitton-Jackson改良)、基本培養(yǎng)基Eagle(BME-加入Earle堿鹽)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM-無血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、LeibovitzL-15培養(yǎng)基、McCoy5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-含Earle堿鹽)、培養(yǎng)基M199(M199H-含Hank堿鹽)、極限必須培養(yǎng)基Eagle(MEM-E-含Earle堿鹽)、極限必須培養(yǎng)基Eagle(MEM-H-含Hank堿鹽)和極限必須培養(yǎng)基Eagle(MEM-NAA，含非必須氨基酸)，在數(shù)目眾多的其他培養(yǎng)基中包括培養(yǎng)基199、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、MAB8713、DM145、Williams，G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB301、MCDB202、MCDB501、MCDB401、MCDB411、MDBC153。用于本發(fā)明的優(yōu)選培養(yǎng)基為DMEM。這些和其它有用的培養(yǎng)基購自GIBCO，GrandIsland,N.Y.,USA和BiologicalIndustries,BetHaEmek,Israel等等。大量這些培養(yǎng)基概述于酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)第LVIII冊，"細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)",第6272頁，WilliamB.Jakoby和IraH.Pastan編輯，Academic出版公司出版。培養(yǎng)基可補充例如血清(例如?；蚱渌锓N的胎血清或)和任選或備選以皮克/ml-毫克/ml水平濃度的生長因子、細(xì)胞因子和激素(例如生長激素、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、骨保護素配體、胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板源生長因子和骨形成蛋白)。應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識到可將另外組分加入培養(yǎng)基中。這樣的組分可為抗生素、抗真菌素、白蛋白、氨基酸和本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞培養(yǎng)的其它組分。此外，需要時可加入組分以提高分化過程(參見以下進(jìn)一步闡述)。一旦取得粘附細(xì)胞就可將其轉(zhuǎn)移到三維環(huán)境(參見以下實施例部分的實施例1)。但是應(yīng)該了解，可在分離后立即將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D構(gòu)造基質(zhì)中(如上文所述)。因此，使本發(fā)明這方面的粘附材料成形用于3D培養(yǎng)，藉此提供基本上增加對基質(zhì)細(xì)胞粘附有用附著表面的生長基質(zhì)，以便模擬組織(例如胎盤)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。例如，對于0.5mm高的生長基質(zhì)而言，增加到至少5-30倍，其通過投影到生長基質(zhì)基部來計算。所述增加到約5-30倍是對于每一單層而言，若使用許多所述層(無論是堆疊的還是由間隔物隔開或諸如此類)，則5-30倍都適用于每一層如此結(jié)構(gòu)。當(dāng)基質(zhì)以片(sheet)形式使用時，優(yōu)選非編織纖維片或開孔發(fā)泡聚合物片，優(yōu)選片厚度為約50-1000pm或更厚，其提供供細(xì)胞進(jìn)入、營養(yǎng)素進(jìn)入和從片除掉廢物用的足夠的多孔性。根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述孔具有10nm-100pm的有效直徑。這樣的片可從各種厚度的纖維制備，優(yōu)選纖維厚度或纖維直徑范圍為約0.5|im，更優(yōu)選纖維直徑范圍為10pm。本發(fā)明結(jié)構(gòu)可由提供空間穩(wěn)定性和物理強度的多孔支撐片或篩網(wǎng)支撐，或甚至更好與其結(jié)合。還可切割、沖孔或切碎這樣的基質(zhì)片，以提供投影面積約0.2mm-約10mm且大約同樣厚度(約50-1000pm)的顆粒。更多與用于使本發(fā)明付諸于實踐的生長基質(zhì)的制作、用途和/或優(yōu)點闡述于美國專利第5,168,085號和特別是第5,266,476號中，它們都在此引作參考。粘附表面可具有選自正方形、環(huán)形、圓形和十字形的形狀。對于大規(guī)模生產(chǎn)而言，優(yōu)選在3D生物反應(yīng)器中實現(xiàn)培養(yǎng)。這樣的物反應(yīng)器實例包括但不限于推流式生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌槽罐生物反應(yīng)器和固定床生物反應(yīng)器。如實施例部分的實施例1所示，三維(3D)推流式生物反應(yīng)器(如美國專利第6911201號所述)能夠支持基質(zhì)細(xì)胞的生長和長期維持。在該生物反應(yīng)器中，基質(zhì)細(xì)胞被接種到裝于玻璃柱中由非編織纖維聚酯基質(zhì)構(gòu)成的porrosive載體上，藉此使大量細(xì)胞在相對小的體積內(nèi)繁殖。在推流式生物反應(yīng)器中所用的基質(zhì)可為片形式，為非編織纖維片或開孔發(fā)泡聚合物片，優(yōu)選片厚度為約50-1000(im或更厚，其提供供細(xì)胞進(jìn)入、營養(yǎng)素進(jìn)入和從片除掉廢物用的足夠的多孔性?？膳c本發(fā)明使用的其它3D生物反應(yīng)器包括但不限于連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器(其中使培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)料到生物反應(yīng)器中，將產(chǎn)物連續(xù)抽出，以維持反應(yīng)器內(nèi)的恒時穩(wěn)態(tài)。帶有纖維床籃的攪拌罐生物反應(yīng)器可購自例如NewBrunswickScientific^>司Edison，NJ)、固定床生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器(其中空氣通常通入中央導(dǎo)管的底部，向上流動同時形成氣泡，在柱頂分離廢氣)、帶有Polyactive泡沫塑料的細(xì)胞接種灌注式生物反應(yīng)器(如Wendt,D.等，BiotechnolBioeng84:205-214,(2003)所述)、管狀聚L乳酸(PLLA)多孔支架徑向流灌注式生物反應(yīng)器[長口Kitagawa等，BiotechnologyandBioengineering93(5):947-954(2006)所述]。符合本發(fā)明的其它生物反應(yīng)器闡述于美國專利第6,277,151號、第197,575號、第139,578號、第132,463號、第902,741號和第5，629，186號。接種時優(yōu)選細(xì)胞接種達(dá)到100,000-1,500,000個細(xì)胞/mm。優(yōu)選一旦達(dá)到至少約40%匯合、60%匯合或80%匯合就收獲細(xì)胞，同時優(yōu)選避免不受控制的分化和老化。培養(yǎng)進(jìn)行至少約2天、3天、5天、10天、20天、l個月或甚至更長。應(yīng)該了解，在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)可能延長這一時間。可能實現(xiàn)傳代以增加細(xì)胞數(shù)目。優(yōu)選本發(fā)明粘附細(xì)胞包含至少一種"基質(zhì)干細(xì)胞表型"。本文所用"基質(zhì)干細(xì)胞表型"指源自骨髓基質(zhì)(即間充質(zhì))千細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)或功能表型。本文所用短語"干細(xì)胞"指沒有終末分化的細(xì)胞。因此，例如，細(xì)胞可能具有紡錘形。作為備選或另外，細(xì)胞可表達(dá)基質(zhì)干細(xì)胞象征的一種或一群(例如表面標(biāo)記)標(biāo)記?；|(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記(陽性和陰性)實例包括但不限于CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD34陽、CD45-、CD80-、CD19匿、CD5-、CD20-、CDllB-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其它基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記包括但不限于酪氨酸羥化酶、巢蛋白和H-NF?；|(zhì)干細(xì)胞代表性功能表型實例包括但不限于T細(xì)胞抑制活性(不刺激T細(xì)胞而相反地對其抑制)、造血干細(xì)胞支持活性以及脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞定向分化。這些結(jié)構(gòu)或功能特征中的任一項都可用于評定本發(fā)明細(xì)胞(參見以下實施例部分的實施例1-2)。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞群特征為獨特的蛋白質(zhì)表達(dá)i普，其如實施例部分的實施例1所示。因此，例如，才艮據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn)生的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞能夠表達(dá)和/或分泌高水平的所選擇的因子。例如，這樣的細(xì)胞表達(dá)或分泌SCF、Flt-3、H2AF或ALDHX比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的高達(dá)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或優(yōu)選12倍。另外或作為備選，本發(fā)明細(xì)胞群分泌或表達(dá)IL-6、EEEF2、RCN2或CNN1比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的高達(dá)至少2、3或5倍水平。另外或作為備選，本發(fā)明細(xì)胞群特征為與2D培養(yǎng)的細(xì)胞比較各種其它蛋白表達(dá)水平較低。因此，例如，分泌或表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的Hnrphl、CD44抗原同種型2前體、P叩ss2或rpL7a的表達(dá)水平低至0.6、0.5、0.25或0.125。當(dāng)進(jìn)一步將本發(fā)明具體化到實踐中時，本發(fā)明人認(rèn)識到粘附基質(zhì)細(xì)胞尤其是3D-ASC顯示免疫抑制活性。如以下實施例部分的實施例3所示，在MLR測定中發(fā)現(xiàn)粘附基質(zhì)細(xì)胞尤其是3D-ASC抑制人類臍帶血單核細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明細(xì)胞可包含可優(yōu)先用于臨床的生物活性(例如T細(xì)胞抑制活性、造血干細(xì)胞支持活性)。當(dāng)進(jìn)一步將本發(fā)明具體化到實踐中時，本發(fā)明人認(rèn)識到本發(fā)明細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可包含可優(yōu)先用于臨床的生物活性(例如T細(xì)胞抑制活性、造血干細(xì)胞支持活性)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步展望條件培養(yǎng)基的收集和其照原樣的或在用本領(lǐng)域熟知方法濃縮、富集或分餾的另外步驟后的應(yīng)用。優(yōu)選本發(fā)明條件培養(yǎng)基來自高生存力的細(xì)胞培養(yǎng)對數(shù)中期。如上所述，本發(fā)明細(xì)胞和條件培養(yǎng)基特征為基質(zhì)干細(xì)胞表型，因此可用于任何研究和可能受益于使用這樣的細(xì)胞的任何臨床應(yīng)用中。移植的HSC移入并啟動血細(xì)胞生成依賴于復(fù)雜的過程，包括隨趨化因子梯度穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障歸巢到骨髓并駐留在合適龕，同時在龕中的移植細(xì)胞、ECM和間充質(zhì)細(xì)胞之間建立物理接觸。所有這些過程涉及一群復(fù)雜的分子，例如細(xì)胞因子、激素、類固醇、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、細(xì)胞間作用和黏附蛋白和基質(zhì)蛋白。26已知移植后2-3天于受者BM中僅檢測到1-5%灌輸?shù)腍SC[Kerre等，JImmunol.167:3692-8.(2001);Jetmore等，Blood.99:1585-93(2002)]。MSC對造血移入的貢獻(xiàn)部分在于抑制引起移植物抗宿主病的源自供者的T細(xì)胞產(chǎn)生[(GvHD，CharbordP.,和Moore,K.,Ann.N.Y.Acad.Scl1044:159-167(2005);MaitraB等，BoneMarrowTransplant.33(6):597-604.(2004);美國專利第6,010,696號；第6555374號]，部分在于提供造血干細(xì)胞(HSC)支持(即維持并幫助造血干細(xì)胞增殖、成熟和/或歸巢)。如以下實施例部分的實施例2所述，意想不到地發(fā)現(xiàn)源自胎盤和脂肪組織的粘附細(xì)胞即使在化療后也支持HSC移入?？紤]到這些結(jié)果，可想象到本發(fā)明細(xì)胞或培養(yǎng)基可用于使用基質(zhì)干細(xì)胞移植的任何臨床應(yīng)用中。因此，本發(fā)明另一方面提供在需要治療的對象中治療可受益于基質(zhì)干細(xì)胞移植的醫(yī)學(xué)病癥(例如病理、疾病、綜合征)的方法。本文所用術(shù)語"治療"指抑制或阻滯病理進(jìn)展和/或引起病理的減輕、消除或消退。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可使用各種方法和測定來評估病理進(jìn)展，同樣地，可使用各種方法和測定來評估病理的減輕、消除或消退。術(shù)語"治療"優(yōu)選指減緩或縮小與癌病有關(guān)的癥狀。優(yōu)選治療治愈例如基本上消除與醫(yī)學(xué)病癥有關(guān)的癥狀。本文所用"可受益于基質(zhì)干細(xì)胞移植的醫(yī)學(xué)病癥"指可通過給予本發(fā)明細(xì)胞/培養(yǎng)基減緩的任何醫(yī)學(xué)病癥。術(shù)語或短語"移植"、"細(xì)胞置換"或"移入"在本文中可交替使用，指將本發(fā)明細(xì)胞引入到靶組織中。本文所用術(shù)語"對象，，指任何對象(例如哺乳動物)，優(yōu)選人類對象。本發(fā)明這方面的方法包括給予所述對象治療有效量的本發(fā)明細(xì)胞或培養(yǎng)基(上述)，藉此治療對象的可受益于基質(zhì)千細(xì)胞移植的醫(yī)學(xué)病癥。27根據(jù)本發(fā)明這方面可給予的細(xì)胞包括上述可在二維或三維環(huán)境衍生來自本發(fā)明基質(zhì)干細(xì)胞的特定i普系細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域熟知。參見例如美國專利第5,486,359號、第5,942,225號、第5,736,396號、第5,908,784號和第5,902,741號。細(xì)胞可為天然的，或遺傳改良例如以便衍生的目的語系(參見美國專利申請第20030219423號)。細(xì)胞和培養(yǎng)基可為新鮮或冷凍(例如冷凍保存)制備的自體或非自體來源(即同種異體或異種)。根據(jù)醫(yī)學(xué)病癥可給予所述對象另外的化學(xué)藥物(例如免疫調(diào)節(jié)劑、化療等)或細(xì)胞。因此，為了改進(jìn)干細(xì)胞移入(例如增加受者BM中的有存活力的HSC數(shù)目和最優(yōu)化改進(jìn)正常白血細(xì)胞計數(shù))，例如可將本發(fā)明細(xì)胞/培養(yǎng)基在HSC移植之前、同時或之后給予。優(yōu)選HSC和基質(zhì)細(xì)胞享有共同的HLA抗原。優(yōu)選HSC和基質(zhì)細(xì)胞來自單一個體?；蛘?，HSC和基質(zhì)細(xì)胞來自不同個體。術(shù)語或短語"移植"、"細(xì)胞置換"或"移入"在本文中可交替使用，指將本發(fā)明細(xì)胞引入到靶組織中。所述細(xì)胞可源自受者或源自同種異體或異種供者。因為當(dāng)將非自體細(xì)胞給予身體時可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所以已開發(fā)了幾種方法來降低排斥非自體細(xì)胞的可能性。這些方法包括在移植前抑制受者免疫系統(tǒng)或?qū)⒎亲泽w細(xì)胞包被在免疫隔離(immunoisolating)半滲透膜中。膠嚢化(encapsulation)技術(shù)通常分為涉及小的球狀載體的微膠嚢和涉及較大的平板中空纖維膜的大膠嚢(macroencapsulation)(Uludag，H.等，哺乳動物細(xì)胞膠嚢化技術(shù)(Technologyofmammaliancellencapsulation).AdvDrugDelivRev.2000;42:29-64)。制備微膠嚢的方法為本領(lǐng)域所述，包括例如如下公開的方法Lu28MZ等，用藻酸鹽和a-苯氧基亞肉桂基乙?；?丙烯胺)的細(xì)胞膠嚢化(Cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine)).BiotechnolBioeng.2000,70:479-83;ChangTM和PrakashS,酶、細(xì)胞和遺傳工程」微生物的微膠嚢封裝方法(Proceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms).MolBiotechnol.2001，17:249-60;和LuMZ等，用光敏聚(丙烯胺a-氰基亞肉桂基乙酸面旨)月交嚢去于裝纟田月包的新穎的方法(Anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepoly(allylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate))。JMicroencapsul.2000,17:245-51。例如，通過將改良的膠原與曱基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)、曱基丙烯酸(MAA)和曱基丙烯酸曱酯(MMA)三元聚合物殼混合來制備微膠嚢，導(dǎo)致膠嚢厚2-5pm。這樣的微膠嚢可進(jìn)一步用另外的2-5三元聚合物殼包被，以提供負(fù)電荷的光滑表面并使血漿蛋白吸收最小化(Chia,S.M.等，用作細(xì)胞膠嚢化生物材料的多層微膠嚢(Multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulationBiomaterials).200223:849-56)。其它微膠嚢基于藻酸鹽、海洋多糖(Sambanis，A,糖尿病治療中的月交嚢月夷島(Encapsulatedisletsindiabetestreatment).Technol.Ther.2003,5:665-8)或其^f汙生物。例如，可通過在氯化鈣存在下聚陰離子藻酸鈉和纖維素硫酸鈉與聚陽離子亞曱基-胍共聚物鹽酸鹽之間的聚合電解質(zhì)絡(luò)合作用來制備微膠嚢。應(yīng)該了解，當(dāng)使用較小的膠嚢時改進(jìn)了細(xì)胞膠嚢化。因此，當(dāng)膠嚢大小從1mm減小到400時，膠嚢化細(xì)胞的質(zhì)量控制、機械穩(wěn)定性、分散特性和體外活性都得到改進(jìn)(CanapleL.等，通過大小控制改進(jìn)細(xì)胞膠嚢化(Improvingcellencapsulationthroughsizecontrol).JBiomaterSciPolym編輯，2002;13:783-96)。此外，發(fā)現(xiàn)孔徑很好地控制在小至7nm的、經(jīng)處理(tailored)表面化學(xué)和精確微構(gòu)造的納米孔生物膠嚢成功地為細(xì)胞免疫隔離出微環(huán)境(WilliamsD.小即是美醫(yī)療裝置中的微粒和納米粒技術(shù)(Smallisbeautiftil:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices).MedDeviceTechnol.1999,10:6-9;Desai,T.A.胰腺細(xì)胞膠嚢化的微構(gòu)造技術(shù)(Microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation).ExpertOpinBiolTher.2002，2:633-46)。免疫抑制劑實例包括但不限于氨曱蝶呤(methotrexate)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、環(huán)孢霉素(cyclosporine)、環(huán)孑包霉素A(cyclosporinA)、氯會(chloroquine)、羥氯唾、柳氮磺口比咬(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青霉胺(D-penicillamine)、來氟米特(leflunomide)、硫哇噪呤(azathioprine)、阿那白滯素(anakinra)、英夫利昔單抗(infliximab)(REMICADE)、依那西普(etanercept)、TNFa阻斷劑、靶向炎性細(xì)胞因子的生物藥物、和非固醇類抗炎藥物(NSAID)。NSAID實例包括但不限于乙酰水楊酸、水楊酸膽堿鎂、二氟尼柳(diflunisal)、水楊酸鎂、雙水楊酸酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸(diclofenac)、依托度酸、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲咮美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸、曱氯芬那酸酯、萘普生(naproxen),萘丁美酉同(nabumetone)、保泰^^(phenylbutazone)、p比羅昔康(piroxicam)、舒林酸、托美丁(tolmetin)、對乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、Cox畫2抑制劑和曲馬多(tramadol)。在本文所述任一方法中，可以給予細(xì)胞或培養(yǎng)基本身，或優(yōu)選作為進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物部分來給予。本文所用"藥物組合物"指含其它化學(xué)組分(例如藥學(xué)上合適的載體和賦形劑)的本文所述一種或多種化學(xué)綴合物的制劑。藥物組合物目的是方Y(jié)更將化合物給予對象。下文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指載體或稀釋劑，其對對象不引起明顯刺激，不消除所給予化合物的生物學(xué)活性和特性。載體的非限制性實例為丙二醇、鹽水、乳液和有機溶劑與水的混合物。本文所用術(shù)語"賦形劑"指加到藥物組合物中以進(jìn)一步方便施用化合物的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鉤、磷酸鉤、各種糖和各種類型淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，藥學(xué)載體為水性鹽溶液。制備和給予藥物的技術(shù)可在"雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)",Mack出版公司，Eastern,PA，最新版本中找到，其在此引作參考?？梢匀矸绞浇o予藥物組合物(如上文所述)?；蛘?，可局部給予藥物組合物，例如直接將藥物組合物注射到患者的組織區(qū)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法來制備本發(fā)明藥物組合物，例如借助于常規(guī)混合、溶解、成粒、制成糖錠劑、研粉、乳化、膠嚢化、包埋或凍干的方法。因此，可用一種或多種包含賦形劑和輔助劑的生理學(xué)上可接受的載體以常規(guī)方式來調(diào)配用于本發(fā)明的藥物組合物，所述載體方便將活性成分加工成可在藥學(xué)上使用的制劑。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑。對于注射而言，可以以水溶液來調(diào)配藥物組合物的活性成分，優(yōu)選以生理上可容的緩沖液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩沖液。對于透過粘膜給藥而言，制劑中使用適于待滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常為本領(lǐng)域所知。對于用于本發(fā)明方法中的任何制劑而言，可從體外和細(xì)胞培養(yǎng)測定中初始估計治療有效量或劑量。優(yōu)選在動物才莫型中調(diào)配劑量以達(dá)到所需的濃度或滴度。這樣的資料可用于更準(zhǔn)確地確定人類使用的劑量。可通過體外標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏袦y定本文所述活性成分的毒性和療效。配供人類使用的一系列劑量。劑量可視所用劑型和所用給藥途徑而變化?？赏ㄟ^個別醫(yī)生考慮患者病癥選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量31(參見例如Fingl等，1975，載于"治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)",第1章第1頁)。例如，可對帕金森患者的顯示對治療積極反應(yīng)的運動功能進(jìn)行癥狀監(jiān)控。對于注射而言，可以以水溶液調(diào)配藥物組合物的活性成分，優(yōu)選以生理上可容的緩沖液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩沖液?？蓚€別調(diào)整劑量和給藥間隔，以使活性成分水平足以通過移植的細(xì)胞來有效調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成。達(dá)到理想效果所需的劑量將視個體特征和給藥途徑而定。檢測試驗可用于測定血漿濃度。根據(jù)待治療病癥的嚴(yán)重程度和反應(yīng)，可單次或多次給藥，且療程持續(xù)若干天到若干周，或達(dá)到減輕疾病狀態(tài)。當(dāng)然，待給予的組合物的量將^L正接受治療的個體、病痛的嚴(yán)重程度、給藥方式、主治醫(yī)生的判斷等等而定。給藥劑量和時間應(yīng)該對仔細(xì)連續(xù)監(jiān)測的個體病情變化做出反應(yīng)。例如，基于監(jiān)測的指示，將給予被治療的帕金森患者足以減輕疾病癥狀的細(xì)胞量。本發(fā)明細(xì)胞經(jīng)移植后優(yōu)選在患病區(qū)域存活一段時間(例如至少6個月)，以便觀察到治療效果。包括調(diào)配在藥物可容載體中的本發(fā)明制劑在內(nèi)的組合物可以經(jīng)制備；置于合適容器中；并標(biāo)上用于指定病癥的治療。若有需要，本發(fā)明組合物可以存于包或分配裝置(dipenserdevice)例如FDA核準(zhǔn)的試劑盒中，其可含有含活性成分的一個或多個單位劑型。所述包可例如包含金屬或塑料片，例如起泡包(blisterpack)。所述包或分配裝置可附有給藥說明。包或分配裝置還可提供與由管理藥物生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式的容器有關(guān)的公告，所述公告反映該機構(gòu)批準(zhǔn)的組合物形式或人類給藥或獸用給藥形式。這樣的公告例如可以是由美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)的處方藥物標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插入物。實施例成參考。本文所用術(shù)語和本發(fā)明所用實驗方法通常包括分子、生化、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見例如"分子克隆實驗手冊(MolecularCloning:AlaboratoryManual)"Sambrook等，(1989);"分子生物學(xué)通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)"第I-III巻，Ausubel,R.M.編輯(1994);Ausubel等，"分子生物學(xué)通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)",JohnWiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"分子克隆實用指南(APracticalGuidetoMolecularCloning)",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"重組DNA(RecombinantDNA)，，，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編輯)"基因組分子實驗手冊叢書(GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries)",第1-4巻,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美國專利第4,666,828號、第4,683,202號、第4,801,531號、第5,192,659號和第5,272,057號提出的方法；"細(xì)胞生物學(xué)實驗手冊(CellBiology:ALaboratoryHandbook)",第I-III巻Cellis,J.E.編輯(1994);"免疫學(xué)通用方案(CurrentProtocolsinImmunology)，，第I-III巻ColiganJ.E.編輯(1994);Stites等(編輯)，"基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(BasicandClinicalImmunology)"(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯)，"細(xì)胞免疫學(xué)選擇方法(SelectedMethodsinCellularIramunology)"，W.H.Freeman和Co.,NewYork(1980);廣泛闡述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中的有用的免疫測定，參見例如美國專利第3,791,932號、第3,839,153號、第3,850,752號、第3,850,578號、第3,853,987號、第3,867,517號、第3,879,262號、第3,901,654號、第3,935,074號、第3,984,533號、第3，996,345號、第4,034,074號、第4,098,876號、第4,879,219號、第5，011，771號和第5,281,521號；"寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)"Gait，M.J.編輯(1984);"核酸雜交(NucleicAcidHybridization)"Hames,B.D.,和HigginsS.J.編輯(1985);"轉(zhuǎn)錄和翁3譯(TranscriptionandTranslation)"Hames，B.D.,和HigginsS.J.編輯(1984);"動物細(xì)胞培養(yǎng)(AnimalCellCulture)"Freshney,R.L編輯(1986);"固定化細(xì)胞和酶(ImmobilizedCellsandEnzymes)"IRLPress,(1986);"分子克隆實4亍指南(APracticalGuidetoMolecularCloning)"Perbal,B.,(1984)和"酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)"第1-317巻，AcademicPress;"PCR方案方法和應(yīng)用指南(PCRProtocols:AGuideToMethodsandApplications)",AcademicPress,SanDiego，CA(1990);Marshak等，"蛋白質(zhì)純化和鑒定策略-實驗課手冊(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual)"CSHLPress(1996);以上所有如同本文完全提出一樣在此引作參考。貫穿本文獻(xiàn)提供了其它一般的參考資料。認(rèn)為其中的方法為本領(lǐng)域熟知，提供它們是為了方便讀者。其中所包含的所有資料在此引作參考。實施例1從骨髓、胎盤和脂肪組織生產(chǎn)和培養(yǎng)粘附基質(zhì)細(xì)胞(ASC)在含有3D載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)粘附細(xì)胞，以生產(chǎn)特征為特定細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)語的3D-ASC細(xì)胞。通過細(xì)胞計數(shù)測定生長效率。通過在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)來測定這些細(xì)胞的分化能力。材料和試驗方法骨g質(zhì)細(xì)胞-經(jīng)過心臟直視手術(shù)或BM活檢從血液學(xué)健康的供者吸出胸骨骨髓得到骨髓(BM)基質(zhì)細(xì)胞。用Hank平衡鹽溶液(HBSS;GIBCOBRL/Invitrogen，GaithersburgMD)將骨髓吸出物稀釋3倍,進(jìn)行Ficoll-Hypaque(RobbinsScientific公司,Sunnyvale,CA)密度梯度離心。此后收集骨髓單核細(xì)胞(<1.077gm/cm3),用HBSS洗滌3次，重新懸浮于生長培養(yǎng)基[補充10%FCS(GIBCOBRL)、10'4M巰基乙醇(Merck,WhiteHouseStation,NJ)、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合34物(IOOU/ml:100ug/ml:1.25un/ml;BeitHa，Emek)、2mML曙谷氨酰胺(BeitHa，Emek)的DMEM(BiologicalIndustries,BeitHa，emek，Israel)]。在組織培養(yǎng)培養(yǎng)瓶(Coming，Acton,MA)中于37。C(5。/。0)2)分開孵育來自各個供者的細(xì)胞且每周更換培養(yǎng)基。每3-4天用0.25%胰蛋白酶-EDTA(BeitHa，Emek)分裂(split)細(xì)胞。傳2-40代后，當(dāng)達(dá)到60-80%匯合時，收集細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。源自胎盤的基質(zhì)細(xì)胞-在無菌條件下切下足月分娩胎盤的里面部分(BneiZion醫(yī)學(xué)中心，Haifa,Israel),用Hank緩沖液洗滌3次，于37。C與0.1。/。膠原酶(lmg/ml組織；Sigma-Aldrich，St.Lewis,MO)孵育3小時。用吸管輕輕吹打，然后用補充10。/。FCS、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(IOOU/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和2mML-谷氨酰胺的DMEM洗滌懸浮的細(xì)胞，接種到75cn^培養(yǎng)瓶中并于37。C在5%C02增濕條件下于組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中孵育。此后使細(xì)胞在塑料表面貼壁72小時，然后每3-4天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)達(dá)到60-80%匯合(通常10-12天)時，用0.25。/o胰蛋白酶-EDTA從生長培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞，并接種到新培養(yǎng)瓶中。此后收集培養(yǎng)的細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。源自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞一從吸脂方法的人脂肪組織獲得基質(zhì)細(xì)胞(RambamHaifa,Ismel)。用等體積的PBS徹底洗滌脂肪組織，用膠原酶(20mg/ml)于37。C消化30分鐘。然后用含有10%FCS、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(lOOU/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和L-谷氨酰胺的DMEM洗滌細(xì)胞，以1200rpm在室溫離心10分鐘，用裂解液重新懸浮(1:10;BiologicalIndustries,BeitHa'emek，Israel,以棄才卓血細(xì)胞)，離心，用含有10%FCS、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(lOOU/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和L-谷氨酰胺的DMEM重新懸浮。然后以3-10x107個細(xì)胞/培養(yǎng)瓶將洗滌過的細(xì)胞接種到無菌組織培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。第二天用PBS洗滌細(xì)胞以除掉殘留的RBC和死細(xì)胞。于37。C在5%C02增濕條件下于組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中保持細(xì)胞。每3-4天更換培養(yǎng)35基。在60-80%匯合時，用0.25。/o胰蛋白酶-EDTA從生長培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞，并接種到新培養(yǎng)^f瓦中。傳2-40代后，當(dāng)達(dá)到60-80%匯合時，收集細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。PluriXTM推流式生物反應(yīng)器-用由非編織纖維聚酯基質(zhì)構(gòu)成的1-100ml包好的3Dporrosive載體(直徑4mm)裝載PluriXTM推流式生物反應(yīng)器(Pluristem,Haifa,Israel;如圖lg所述，也參見美國專利第6,911,201號)。這些載體使得可在相對小的體積內(nèi)繁殖大量細(xì)胞數(shù)。由Pluristem設(shè)計并制造玻璃器皿。生物反應(yīng)器在37。C培養(yǎng)箱中保持，且流速由閥門(圖lg中的6a)和蠕動泵(圖lg中的9)調(diào)節(jié)并監(jiān)控。生物反應(yīng)器含有取樣和注射點(圖lg中的4),使得可連續(xù)接種細(xì)胞。從庫(圖lg中的l)中供給pH6.7-7.4的培養(yǎng)基。該庫由含有不同比例的空氣/C02/02(由生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度而定)的已過濾氣體混合物(圖lg中的2、3)供給。02的比例適合生物反應(yīng)器出口的溶02水平，其由監(jiān)控器(圖lg中的6)測定。經(jīng)由硅膠管或擴散器(DeganiaBet,EmekHayarden，Israel)將氣體混合物提供給所述庫。培養(yǎng)基流經(jīng)能夠收集循環(huán)中的非粘附細(xì)胞的分離容器(圖lg中的7)。通過蠕動泵(圖lg中的9)使得培養(yǎng)基循環(huán)。生物反應(yīng)器進(jìn)一步配備有附加的取樣點(圖lg中的IO)和用于連續(xù)交換培養(yǎng)基的容器。生產(chǎn)3D-粘附基質(zhì)細(xì)胞(3D-ASC)-用胰蛋白酶處理按上所述培養(yǎng)的非匯合原代人粘附2D細(xì)胞培養(yǎng)物，用補充10%FBS、青霉素畫鏈霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和2mML-谷氨酰胺的DMEM洗滌并重新懸浮，經(jīng)由注射點接種(103-105個細(xì)胞/1111)到無菌推流式生物反應(yīng)器(參見圖lg)的3D載體。接種前將PBS-Ca-Mg(BiologicalIndustries,BeitHa，emek,Israel)填入生物反應(yīng)器，高壓滅菌(120。C,30分鐘)，用含有10%熱滅活的胎牛血清和青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(IOOU/ml:100ug/ml:1.25un/ml)的Dulbecco生長培養(yǎng)基洗滌。流速保持在0.1-5ml/分鐘。接種過程涉及停止循環(huán)2-48小時，藉此使得細(xì)胞沉積在載體上。生物反應(yīng)器保持在控制溫度(37。C)36和pH條件(pH二6.7-7.4)下；根據(jù)需要使用供給無菌空氣和C02的培養(yǎng)箱。每周置換2-3次生長培養(yǎng)基。用新鮮的DMEM培養(yǎng)基每4小時-7天替換循環(huán)培養(yǎng)基。在密度為1x106-lx107個細(xì)胞/1111(生長后12-40天)時，從生物反應(yīng)器除掉總培養(yǎng)基體積，用PBS將生物反應(yīng)器和載體洗滌3-5次。然后用胰蛋白酶-EDTA從載體分離3D-ASC細(xì)胞；(BiologicalIndustries,BeitHa，emek,Israel;輕輕攪動3-15分鐘，1-5次)，此后重新懸浮于DMEM并冷凍保存。3D-ASC質(zhì)量生物學(xué)測定-解凍并計數(shù)凍存的3D-ASC細(xì)胞。為評估細(xì)胞生存力，將2x105個細(xì)胞接種到150cm^且織培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中，在接種后7天內(nèi)評估其粘附能力和重形成群體(repopulation)。此后用熒光單克隆抗體流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter,Fullerton，CA)分析3D-ASC膜標(biāo)記表型。用流式細(xì)胞術(shù)測定比較3D和2D培養(yǎng)的粘附細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記譜-將來自2D培養(yǎng)物和3D流動系統(tǒng)培養(yǎng)物中的100,000-200,000個粘附細(xì)胞懸浮在5ml管中的0.1ml培養(yǎng)基中，與飽和濃度的下述各種單克隆抗體(MAb)孵育(4。C,30分鐘，暗環(huán)境)FITC-綴合的抗人CD90(ChemiconInternational公司，Temecula，CA)、PE綴合的抗人CD73(BactlabDiagnostic,Ceasarea,Israel)、PE綴合的抗人CD105(eBioscience,SanDiego,CA)、FITC綴合的抗人CD29(eBioscience,SanDiego,CA)、Cy7-PE綴合的抗人CD45(eBiosience)、PE綴合的抗人CD19(IQProducts,Groningen，TheNetherlands),PE綴合的抗人CD14Mab(IQProducts)、FITC綴合的抗人CDllb(IQProducts)和PE綴合的抗人CD34(IQProducts)或FITC綴合的抗人HLA-DRMab(IQProducts)。孵育后在含有1%熱滅活的FCS的水冷PBS中洗滌細(xì)胞兩次，重新懸浮于500pi0.5%曱醛中，用FC-500流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter,Fullerton，CA)分析。用質(zhì)譜分析比較3D和2D培養(yǎng)的粘附細(xì)胞的蛋白譜-如上所述生產(chǎn)來自胎盤的源自2D和3D培養(yǎng)程序的ASC。筒言之，通過在增濕5%C02環(huán)境(atmosphere)下于37。C在175cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)0.3-0.75x106個細(xì)胞4天直至達(dá)到60-80%匯合來生產(chǎn)2D培養(yǎng)物。通過在含有2000個載體的生物反應(yīng)器中接種2-10x106個細(xì)胞/克并培養(yǎng)18天來生產(chǎn)3D培養(yǎng)物。收獲后洗滌細(xì)胞(x3)以除去所有血清，沉淀并冷凍。根據(jù)廠商的方案，從沉淀物分離蛋白質(zhì)[使用Tri試劑盒(Sigma，SaintLouis,USA)，用胰蛋白酶消化并用iTRAQ試劑標(biāo)記(AppliedBiosciences,FosterCity,CA)]。簡言之，iTRAQ試劑為非聚合物的同量異位標(biāo)記試劑。用四種同量異位的同位素編碼標(biāo)記中的一種經(jīng)由其N末端和/或賴氨酸側(cè)鏈標(biāo)記每一樣品中的肽?；旌纤膫€經(jīng)標(biāo)記的樣品，用質(zhì)譜法分析肽。在肽片段上的每種標(biāo)記釋放獨特的質(zhì)量報告離子，因此，四種報告離子的比值給出樣品中特定肽的相對豐度(資料見http:〃docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf)。在Smoler蛋白質(zhì)組中心(departmentofBiology,Technion，Haifa,Ismel)用LC畫MS/MS在QTOF-Premier(Waters,SanFrancisco,CA)上實施源自胎盤的ASC的2D培養(yǎng)物對3D培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)組分析，且通過Pep-Miner軟件[Beer,L等，Proteomics,4,950-60(2004)]針對nr數(shù)據(jù)庫的人類部分進(jìn)行鑒別和分析。被分析的蛋白質(zhì)有核內(nèi)不均一核糖核蛋白HI(Hnrphl,GeneBank登錄號NP—005511)、H2A組蛋白家族(H2AF,GeneBank登錄號NP—034566.1)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(EEEF2,GeneBank登錄號NP—031933.1)、網(wǎng)釣結(jié)合蛋白3、EF-手形鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RCN2，GeneBank登錄號NP065701)、CD44抗原同種型2前體(GeneBank登錄號NP—001001389、鉤調(diào)理蛋白蛋白1堿性平滑肌(CNNl,GeneBank登錄號NP一001290)、3磷酸腺苦5磷酰硫酸合成酶2同種型a(Papss2,GeneBank登錄號NP—004661)、核糖體蛋白L7a(rpL7a，GeneBank登錄號NP—000963)和醛脫氫酶X(ALDHX,GeneBank登錄號P47738)。每一實驗進(jìn)行2次。因為分析的特性，每一蛋白質(zhì)按照出現(xiàn)在樣品中的肽數(shù)目來分析(在每一次分析中蛋白質(zhì)出現(xiàn)2-20次)。用ELISA比較3D和2D培養(yǎng)的粘附細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)-如上所述生產(chǎn)來自胎盤的源自2D和3D培養(yǎng)方法的ASC，且3D培養(yǎng)持續(xù)24天。此后收集條件培養(yǎng)基，在三個獨立實驗中，用ELISA(R&D系統(tǒng)，Minneapolis,MN)對Flt-3配體、IL-6、促血小板生成素(TPO)和干細(xì)胞因子(SCF)進(jìn)行分析。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為lxl(^個細(xì)胞/ml。成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基-通過在由補充10%FCS、100nM地塞米松、0.05mM抗壞血酸2-磷酸鹽、10mMB-甘油磷酸鹽的DMEM組成的成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞3周來評估成骨細(xì)胞分化。由AlizzarinRedS染色顯示4丐化基質(zhì)，由堿性磷酸酶測定試劑盒(所有試劑來自Sigma-Aldrich,St.Lewis,MO)檢測堿性磷酸酶。結(jié)果PluriXTM生物反應(yīng)器系統(tǒng)創(chuàng)造了生理樣微環(huán)境為了給粘附細(xì)胞提供有效的培養(yǎng)條件，用PluriX生物反應(yīng)器(Pluristem,Haifa,Israel;載體在圖lg中闡明，在接種前顯示于圖lb中)人工創(chuàng)造生理樣環(huán)境(圖la中所述)。如圖lc-f所示，骨髓產(chǎn)生的3D-ASC細(xì)胞在3D基質(zhì)上成功培養(yǎng)并在接種后擴增20天(圖lb-c，分別放大x150和250)和40天(圖lc畫d,分別放大x350和500)。生長在PluriX生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的細(xì)胞顯著擴增-不同生產(chǎn)批次的源自胎盤的3D-ASC細(xì)胞在PluriX生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長。接種密度為13,300個細(xì)胞/載體(至總量為2x106個細(xì)胞)。接種14天后，細(xì)胞密度增加到15倍，達(dá)到大約200,000個細(xì)胞/載體(圖2)，或者說在150載體的生物反應(yīng)器中30x106。在不同的實驗中，將細(xì)胞以1.5x104細(xì)胞/1111密度接種到生物反應(yīng)器，接種30天后，載體含有超過50倍的更大的細(xì)胞數(shù)量，即大約0.5x106個細(xì)胞/載體或0.5x107個細(xì)胞/ml。在各種水平生長柱的載體上的細(xì)胞密度一致，說明氧和營養(yǎng)素均一傳遞到細(xì)胞。由此證明3D培養(yǎng)系統(tǒng)為高密度間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的生長和長期維持提供支持條件，所述細(xì)胞培養(yǎng)物可以有效生長到足以用于支持移入和成功移植目的的量。393D-ASC顯示獨特的膜標(biāo)記特征-為了確定可溶性分子分泌i普及蛋白質(zhì)產(chǎn)生(通過模擬骨環(huán)境的3D培養(yǎng)方法來實施)的差異，進(jìn)行了FAC分析。如圖3a所示，細(xì)胞標(biāo)記的FACS分析描述的是，3D-ASC表現(xiàn)出與在2D條件中生長的粘附細(xì)胞不同的標(biāo)記表達(dá)型式。與3D培養(yǎng)的細(xì)胞相比，2D培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)明顯更高水平的陽性膜標(biāo)記CD90、CD105、CD73和CD29膜標(biāo)記。例如，3D培養(yǎng)的細(xì)胞顯示56%的CD105表達(dá)，對比2D培養(yǎng)的細(xì)胞為87%。2D和3D二者胎盤培養(yǎng)物的ASC都不表達(dá)任何造血膜標(biāo)記(圖3b)。3D-ASC顯示獨特的可溶性因子鐠-造血龕包括產(chǎn)生豐富細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的支持細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定2D和3D培養(yǎng)的ASC之間的差別，通過ELISA得到2D和3DASC培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基中四種主要的造血分泌蛋白語。圖4a-c顯示生長在3D條件的細(xì)胞產(chǎn)生含更高水平的Flt-3配體(圖4a)、IL-60(圖4b)和SCF(圖4c)的條件培養(yǎng)基，而在2D培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中檢測到較低水平的IL-6和接近零水平的Flt-3配體和SCF。在兩種培養(yǎng)物中促血小板生成素(TPO)產(chǎn)量都很低并不相上下。3D-ASC在質(zhì)鐠分析中顯示獨特的蛋白鐠-為了進(jìn)一步確定2D和3D培養(yǎng)的ASC之間的差異，用質(zhì)鐠分析這些細(xì)胞的蛋白語。圖4d表示2D和3D培養(yǎng)的ASC展現(xiàn)出明顯不同的蛋白質(zhì)表達(dá)語。如下表1所示，3D培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的H2AF和ALDHX表達(dá)水平(分別高出超過9和12倍)和更高的EEEF2、RCN2和CNN1蛋白水平(分別為大約3、2.5和2倍)。另外，3D培養(yǎng)的細(xì)胞展現(xiàn)大約一半的蛋白Hnrphl和CD44抗原同種型2前體表達(dá)水平和大約三分之一的Papss2和rpL7a表達(dá)水平。40<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>3D-ASC具有分化為成骨細(xì)胞的能力-為了進(jìn)一步表示3D-ASC的特征，在成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基中將細(xì)胞培養(yǎng)3周。此后實施鈣沉淀。分化的細(xì)胞顯示產(chǎn)生了4丐(圖5a-b中的紅色所描述)，反之對照細(xì)胞維持成纖維細(xì)胞樣表型并表明沒有礦化(圖5c-d)。這些結(jié)果表明源自胎盤的3D-ASC具有體外分化為成骨細(xì)胞的能力。實施例2源自胎盤的3D-ASC改進(jìn)HSC移入的能力評估通過在亞致死輻射或化療預(yù)處理的免疫缺陷NOD-SCID小鼠中檢測人造血細(xì)胞(hCD45+)水平，來評估3D-ASC支持HSC移入。材料和實驗方法分離CD34+細(xì)胞-在分娩期間于無菌條件下取臍帶血樣品(BneiZionMedicalCenter,Haifa,Israel),用Lymphoprep(Axis-ShieldPoCAs,Oslo,Norway)密度梯度離心分層單核細(xì)胞并冷凍保存。洗滌解凍的單核細(xì)胞并用抗CD34抗體孵育，用midiMACS(MiltenylBiotech,BergishGladbach,Germany)分離。將來自一個以上樣品的細(xì)胞合并達(dá)到所需的量(50,000-100,000個細(xì)胞)。在經(jīng)輻射小鼠中檢測移植的細(xì)胞-在無菌開放系統(tǒng)籠中供養(yǎng)7周齡雄性和雌性NOD-SCID小鼠(NOD-CB17-Prkdcscid/J;Harlan/WeizmannInst.,RehovotIsrael),給予無菌飲食和高壓滅菌的酸性水。亞致死(350cGy)輻射小鼠，此后(輻射后48小時)通過靜脈注射至尾靜脈，移植50,000-IOO，OOO個hCD34+細(xì)胞，加上或不加另外的源自胎盤或脂肪組織的ASC(0.5x106-1x106)(每組3-7只小鼠)。移植4-6周后，脫臼處死小鼠，用FACS緩沖液(50mlPBS,5mlFBS，0.5ml疊氮鈉5%)從大腿骨和脛骨兩處沖洗收集BM。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠BM中的人細(xì)胞，通過使細(xì)胞與抗人CD45-FITC(IQProducts,Groningen，TheNetherlands)孵育，產(chǎn)生在處理的NOD-SCID小鼠中表達(dá)人和鼠CD45造血細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞百分比。明確的人移入最低閥限指定為0.5%?；熖幚淼男∈笾幸浦布?xì)胞的檢測-如上述用于輻射小鼠的一樣供養(yǎng)的6.5周齡雄性NOD-SCID小鼠(NOD.CB17/JhkiHsd-scid;Harlan,RehovotIsrael)接受白消安(25mg/kg-連續(xù)2天)腹膜內(nèi)注射。第二次注射白消安2天后，單用CD34+細(xì)胞或與從胎盤產(chǎn)生的0.5x106個ASC—起注射小鼠。移植后3.5周，處死小鼠，如上文對輻射小鼠所述測定人造血細(xì)胞的存在情況。結(jié)果3D-ASC改進(jìn)輻射小鼠的HSC移入-在經(jīng)輻射NOD-SCID小鼠中共同移植人CD34+造血細(xì)胞和源自胎盤或脂肪組織的3D-ASC。在共同移植之后4周評估移入效率，并與單用HSC移植的小鼠比較。如表2和圖6所示，與單用UCBCD34+細(xì)胞處理的小鼠比較，3D-ASC和UCBCD34+細(xì)胞共同移植導(dǎo)致移入率高相當(dāng)多及受者小鼠BM中人細(xì)胞的水平高相當(dāng)多。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>3D-ASC改進(jìn)化療小鼠的HSC移入-將人€034+造血細(xì)胞與源自胎盤的500,000-2D-ASC或3D-ASC共同移植到經(jīng)化療預(yù)處理的NOD-SCID小鼠中。在共同移植之后3.5周評估移入效率，并與單用HSC移植的小鼠比較。如表3所示，與單用UCBCD34+細(xì)胞相比，ASC和UCBCD34+細(xì)胞共同移植導(dǎo)致受者小鼠BM中的移入水平更高。此外，如表3所示，用在PluriX生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的源自胎盤的粘附細(xì)胞(3D-ASC)共同移植的小鼠，比在常規(guī)靜態(tài)2D培養(yǎng)條件(培養(yǎng)瓶)中生長的來自同樣供者的細(xì)胞共同移植的'J、鼠的平均移入水平更高。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>圖7a-b中所示的FACS分析結(jié)果證明ASC與hHSC(圖7b)共同移植的優(yōu)勢，以及在HSC移植后ASC改進(jìn)造血系統(tǒng)恢復(fù)的能力。這些結(jié)果綜合起來表明，ASC可在HSC移植(自體或同種異體)之后作為支持細(xì)胞改進(jìn)造血恢復(fù)。3D-ASC在HSC移植之后提高造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞移入的能力可來自3D-ASC分泌可改進(jìn)移植細(xì)胞的歸巢、自我更新和增殖能力的支持HSC的細(xì)胞因子的能力，或來自那些細(xì)胞重建可移植的HSC歸巢和增殖所需的受損造血微環(huán)境的能力。實施例3通過2D和3D培養(yǎng)的ASC抑制淋巴細(xì)胞應(yīng)答在MLR分析中發(fā)現(xiàn)粘附基質(zhì)細(xì)胞尤其是3D-ASC抑制人類臍帶血單核細(xì)胞的免疫反應(yīng)。材料和實驗方法混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定-通過MLR測定法測定源自2D和3D培養(yǎng)方法的從胎盤產(chǎn)生的ASC的免疫抑制和免疫赦免(immunoprivilege)特性，MLR測定測量位于HLA基因座的組織相容性，根據(jù)在答應(yīng)細(xì)胞(增生)和刺激細(xì)胞(不能增生)的混合培養(yǎng)中不相容淋巴細(xì)胞的增殖率來實現(xiàn)。使用人臍帶血(CB)單核細(xì)胞(2x105)作為應(yīng)答細(xì)胞，其通過與等量(l()S)輻射(3000Rad)過的源自人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、或者與2D或3D培養(yǎng)的由胎盤產(chǎn)生的粘附細(xì)胞或粘附細(xì)胞和PBMC組合的共同培養(yǎng)來刺激。每一測定重復(fù)三次。細(xì)胞在96-孔板中的RPMI1640培養(yǎng)基(含20%FBS在增濕的5%C02環(huán)境于37匸)中共同培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)的最后18小時用ljiCSH-胸苷脈沖該板。然后經(jīng)玻璃纖維濾器收集細(xì)胞，用閃爍計數(shù)器定量胸苷吸收。結(jié)果圖8顯示CB細(xì)胞的免疫應(yīng)答，這根椐當(dāng)用PBMC刺激時這些細(xì)胞的增殖增加來表現(xiàn)，在不受任何理論的束縛下這很可能與響應(yīng)HLA的不相容性的T細(xì)胞增殖有關(guān)。然而，當(dāng)與本發(fā)明粘附細(xì)胞孵育時，這些細(xì)胞顯示出相當(dāng)?shù)偷拿庖邞?yīng)答水平。此外，當(dāng)與這些粘附細(xì)胞共同孵育時，CB對PBMC的免疫應(yīng)答基本降低了。因此，以與MSC相似的方式，發(fā)現(xiàn)ASC具有潛在的降低供者細(xì)胞的T細(xì)胞增殖(典型的是GvHD)的能力。盡管2D和3D兩種培養(yǎng)物都降低了淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，但與上文所述的3D-ASC的其它優(yōu)點一致，3DASC的免疫抑制更強。44應(yīng)該了解，為清楚起見，在各別實施方案的上下文中所闡述的本發(fā)明某些特征也可在單個實施方案中組合提供。反之，為簡短起見，在單個實施方案上下文中所闡述的本發(fā)明的各種特征，也可分開或以任何合適的亞組合提供。盡管本發(fā)明聯(lián)合其具體實施方案已得到闡述，但顯然很多備選、修改和變更對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將顯而易見。因此，意欲包括落在附加權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這樣的備選、修改和變化。本說明書所提到的所有出版物、專利和專利申請和GenBank登記號以其整體在此51作本說明書的參考，其程度如同明確并單獨地指出將每一單獨出版物、專利或?qū)＠暾埢虻怯浱栐诖艘鲄⒖家粯印Ａ硗?，本申請中的任何參考的附加、引用或認(rèn)同不應(yīng)該被理解為承認(rèn)這樣的參考可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。權(quán)利要求1.細(xì)胞擴增方法，所述方法包括在支持細(xì)胞擴增的三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞。2.產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括(a)在允許細(xì)胞擴增的三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞；和(b)收集所述擴增的粘附細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，藉此產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。3，權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群。4.分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞分泌比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自SCF、IL-6和Flt-3的至少一種因子。5.分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)的更高水平的選自H2A組蛋白家族(H2AF)、醛脫氬酶X(ALDHX)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(EEEF2)、網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白3、EF-手形鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RCN2)和鈣調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(CNN1)的至少一種蛋白質(zhì)。6.分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞表達(dá)的更低表達(dá)水平的選自核內(nèi)不均一核糖核蛋白Hl(Hnrphl)、CD44抗原同種型2前體、3磷酸腺苷5磷酰石克酸合成酶2同種型a(Papss2)和核糖體蛋白L7a(rpL7a)的至少一種蛋白質(zhì)。7.分離的細(xì)胞群，其包含胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞，其中所述粘附細(xì)胞特征為比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞更高的免疫抑制活性。8.權(quán)利要求7的分離的細(xì)胞群，其中所述免疫抑制活性包含降寸氐T細(xì)胞增殖。9.藥物組合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求1產(chǎn)生的細(xì)胞群。10.藥物組合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求2產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。11.藥物組合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求4、5、6或7的分離的細(xì)胞群。12.治療需要治療的對象中可受益于基質(zhì)細(xì)胞移植的病癥的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞，藉此治療所述對象的所述可受益于干細(xì)胞移植的病癥。13.治療需要治療的對象中可受益于基質(zhì)細(xì)胞移植的病癥的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的源自選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，藉此治療所述對象的所述可受益于千細(xì)胞移植的病癥。14.降低有此需要的對象中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的權(quán)利要求3、4、5、6或7的分離的細(xì)胞群，以便降低所述對象的免疫應(yīng)答。15.權(quán)利要求14的方法，其中用細(xì)胞療法治療所述對象。16.權(quán)利要求12或13的方法，其進(jìn)一步包括給予干細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述干細(xì)胞包含造血干細(xì)胞。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述干細(xì)胞與所述條件培養(yǎng)基或粘附細(xì)胞同時給予。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述干細(xì)胞在給予所述條件培養(yǎng)基或粘附細(xì)胞之后給予。20.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述粘附細(xì)胞得自三維培養(yǎng)。21.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述粘附細(xì)胞得自二維培養(yǎng)。22.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述病癥選自干細(xì)胞缺乏癥、心臟病、帕金森氏病、癌癥、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、燒傷、組織損傷、失血、貧血癥、自身免疫病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、移植物抗宿主病(GvHD)、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、Sjorgen綜合征、多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無力(MG)、格-巴綜合征(GBS)、橋本曱狀腺炎(HT)、格雷夫斯病、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和炎癥性腸病。23.權(quán)利要求1、2、3或20的方法或細(xì)胞群，其中所述三維培養(yǎng)包含3D生物反應(yīng)器。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物反應(yīng)器選自推流式生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌槽生物反應(yīng)器和固定床生物反應(yīng)器。25.權(quán)利要求1、2、3或20的方法或細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞的所述培養(yǎng)在連續(xù)流動培養(yǎng)基下實現(xiàn)。26.權(quán)利要求1、2、3或20的方法或細(xì)胞群，其中所述三維培養(yǎng)包含選自聚酯、聚鏈烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚石風(fēng)、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶瓷顆粒、matrigel、細(xì)胞外基質(zhì)組分、膠原、聚L乳酸和惰性金屬纖維的粘附材料。27.權(quán)利要求1、2、3或20的方法或細(xì)胞群，其中所述培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。28.權(quán)利要求21的方法或細(xì)胞群，其中所述培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。29.權(quán)利要求1、2、3或20的方法或細(xì)胞群，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直到所述粘附細(xì)胞達(dá)到至少60%匯合。30.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述病癥可受益于對造血干細(xì)胞移入的促進(jìn)。31.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞包含選自CD73、CD90、CD29和CD105的陽性標(biāo)記表達(dá)系列。32.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞包含選自CD45、CD80、HLA-DR、Cdllb、CD14、CD19、CD34和CD79的陰性標(biāo)記表達(dá)系列。33.權(quán)利要求1、2、3或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞分泌比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自SCF、Flt-3和IL-6的至少一種因子。34.權(quán)利要求1、2、3或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更高水平的選自H2A組蛋白家族(H2AF)、醛脫氫酶X(ALDHX)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(EEEF2)、網(wǎng)釣結(jié)合蛋白3、EF-手形4丐結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RCN2)和鈣調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(CNN1)的至少一種蛋白質(zhì)。35.權(quán)利要求1、2、3或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞表達(dá)比在2D培養(yǎng)中生長的來自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞分泌的更低表達(dá)水平的選自核內(nèi)不均一核糖核蛋白Hl(Hnrphl)、CD44抗原同種型2前體、3磷酸腺苷5磷酰疏酸合成酶2同種型a(Papss2)和核糖體蛋白L7a(rpL7a)的至少一種蛋白質(zhì)。36.權(quán)利要求1、2、3或20的方法、細(xì)胞群或培養(yǎng)基，其中所述粘附細(xì)胞或培養(yǎng)基特征為比在2D培養(yǎng)中生長的胎盤或脂肪組織粘附細(xì)胞更高的免疫抑制活性。37.權(quán)利要求36的分離的細(xì)胞群，其中所述免疫抑制活性包含降低T細(xì)胞增殖。38.權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、12或13的方法或細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞包含具基質(zhì)干細(xì)胞表型的細(xì)胞。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述基質(zhì)干細(xì)胞表型包含T細(xì)胞抑制活性。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述基質(zhì)干細(xì)胞表型包含造血干細(xì)胞支持活性。41.權(quán)利要求3、4、5、6或7中的細(xì)胞群在制備用于鑒定移植的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供細(xì)胞擴增方法。所述方法包括在支持細(xì)胞擴增的三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤和脂肪組織的粘附細(xì)胞。文檔編號C12N5/00GK101558151SQ200780018851公開日2009年10月14日申請日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日發(fā)明者O·伯格,S·梅雷茨基,Z·阿伯曼申請人:普拉里斯坦有限公司