一種nk細(xì)胞培養(yǎng)基及nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基及NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫 瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā) 生。
[0003] NK細(xì)胞是機(jī)體抗感染、抗腫瘤的第一道天然防線，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞?；罨?的NK細(xì)胞可合成和分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細(xì)胞的 作用。目前，NK細(xì)胞已經(jīng)廣泛運用于臨床進(jìn)行腫瘤患者的治療，同時，NK細(xì)胞治療對病毒或 細(xì)菌感染、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)疾病以及抗衰老也有一定的療效。
[0004] 目前，體外促進(jìn)NK細(xì)胞的方法有很多，有在培養(yǎng)體系中加入動物血清進(jìn)行培養(yǎng)， 也有研宄者將K562細(xì)胞通過基因修飾后經(jīng)過輻照，然后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞在體外刺激NK細(xì) 胞的生長。上述方法雖然能夠刺激NK細(xì)胞高效擴(kuò)增，但是動物血清成分復(fù)雜，取材過程中 有可能帶入支原體、病毒，對NK細(xì)胞培養(yǎng)造成不確定性以及不安全性；K562本身作為一個 腫瘤細(xì)胞，在臨床安全性方面存在很大的質(zhì)疑，不適用于臨床NK細(xì)胞治療。
[0005] 因此，進(jìn)一步開發(fā)安全且能保證NK細(xì)胞增殖速度和腫瘤細(xì)胞的殺傷效果的培養(yǎng) 基十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基及NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā) 明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基安全，采用其培養(yǎng)的NK細(xì)胞快速穩(wěn)定增殖，且對腫瘤細(xì)胞具有較好 的殺傷活力。
[0007] 本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基，以重量份數(shù)計，包括以下組分：
[0008] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 83~93重量份； 血漿 4~6重量份； 白細(xì)胞介素-2 0.5~1.5重量份；
[0009] 抗CD3單克隆抗體 0.5~L5重量份； 類胰島素一號增長因子 1~5重量份； 和柏杞多糖 1~3重量份。
[0010] 優(yōu)選地，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。
[0011] 優(yōu)選地，所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分：
[0012] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 84~88重量份； 血漿 4.5~5重量份； 白細(xì)胞介素-2 0.8~1重量份； 抗CD3單克隆抗體 0.8~1重量份； 類胰島素一號增長因子 2~3重量份； 和構(gòu)杞多糖 1.5~2重量份。
[0013] 優(yōu)選地，所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分：
[0014] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 88重量份； 血漿 5重量份； 白細(xì)胞介素-2 1重量份； 抗CD3單克隆抗體 1重量份； 類胰島素一號增長因子 3重量份； 和枸杞多糖 2重量份。
[0015] 本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0016] 將NK細(xì)胞接種于上述技術(shù)方案所述的NK細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選地，所述NK細(xì)胞按照以下方法分離得到：
[0018] 將外周血進(jìn)行分離，得到PBMC細(xì)胞；
[0019] 將所述PBMC細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，得到NK細(xì)胞。
[0020] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的條件為37°C和體積濃度為5%的C02。
[0021] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的時間為13~15天。
[0022] 優(yōu)選地，所述接種的細(xì)胞密度為4. 5 X IO5個/mL~5. 5 X 10 5個/mL。
[0023] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的過程中每3天補(bǔ)加上述技術(shù)方案所述的NK細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0024] 本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基，以重量份數(shù)計，包括以下組分：無血清基礎(chǔ)培 養(yǎng)基83~93重量份；血漿4~6重量份；白細(xì)胞介素-2 0. 5~1. 5重量份；抗⑶3單克隆 抗體〇. 5~1. 5重量份；類胰島素一號增長因子1~5重量份；和枸杞多糖1~3重量份。 本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基安全性較好，在上述組分的培養(yǎng)基下培養(yǎng)的NK細(xì)胞快速穩(wěn)定 增殖，且對腫瘤細(xì)胞具有較好的殺傷活力。實驗結(jié)果表明：本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基培 養(yǎng)NK細(xì)胞兩周后，增殖倍數(shù)將近翻了 50倍；對K562的殺傷活性在40:1的效靶比時達(dá)到了 91%〇
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明實施例1制備的NK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞的增殖曲線圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明實施例1培養(yǎng)的NK細(xì)胞對K562的殺傷活性曲線圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明實施例2制備的NK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞的增殖曲線圖；
[0028] 圖4為本發(fā)明實施例2培養(yǎng)的NK細(xì)胞對K562的殺傷活性曲線圖；
[0029] 圖5為本發(fā)明實施例3制備的NK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞的增殖曲線圖；
[0030] 圖6為本發(fā)明實施例3培養(yǎng)的NK細(xì)胞對K562的殺傷活性曲線圖。
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基，以重量份數(shù)計，包括以下組分：
[0032] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 83~93重量份； 血漿 4~6重量份； 白細(xì)胞介素-2 0.5-1.5重量份； 抗CD3單克隆抗體 0.5~1.5重量份； 類胰島素一號增長因子 1~5重量份； 枸杞多糖 1~3重量份。
[0033] 本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基，以重量份數(shù)計，包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基83~93 重量份，優(yōu)選為88~88重量份。在本發(fā)明中，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無任何動物血清， 不會帶入任何支原體和病毒。在本發(fā)明中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清的RPMI 1640培 養(yǎng)基、高糖DMEM和DMEM/F12中的一種或多種，更優(yōu)選為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。本發(fā) 明對無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的無血清基礎(chǔ)培 養(yǎng)基即可，如可以采用其市售商品。
[0034] 本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括血漿4~6重量份，優(yōu)選為4. 5~5. 5重量份。 本發(fā)明對所述血漿的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的血漿即可，如可以 采用其市售商品。在本發(fā)明的某些實施例中，所述血漿優(yōu)選按照以下方法制得：
[0035] 將外周血進(jìn)行離心，過濾，得到血漿。
[0036] 本發(fā)明優(yōu)選將外周血在800g下離心10min，得到上層液體。本發(fā)明優(yōu)選將上層液 體再次在3000g下離心10min，然后過濾，得到血漿。
[0037] 本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括白細(xì)胞介素-2 0.5~1.5重量份，優(yōu)選為0.8~ 1重量份。白細(xì)胞介素-2 (IL-2)是由多細(xì)胞來源，主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，又具有多向性作 用的細(xì)胞因子，主要促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、增殖、分化；白細(xì)胞介素-2對機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗 病毒感染等有重要作用，能刺激已被特異性抗原或致絲裂因數(shù)啟動的T細(xì)胞增殖；白細(xì)胞 介素-2能活化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生；刺激NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK殺傷活性及產(chǎn)生細(xì)胞 因子，誘導(dǎo)LAK細(xì)胞產(chǎn)生；促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體；激活巨噬細(xì)胞。本發(fā)明對所述白細(xì) 胞介素-2的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的白細(xì)胞介素_2即可，如可以 采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實施例中，所述白細(xì)胞介素-2購買于上海麥約爾生物技 術(shù)有限公司。
[0038] 本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括抗⑶3單克隆抗體0. 5~1. 5重量份，優(yōu)選為 〇. 8~1重量份。本發(fā)明對所述抗CD3單克隆抗體（0KT-3)的來源沒有特殊的限制，采用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的抗CD3單克隆抗體即可，如可以采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實 施例中，所述抗CD3單克隆抗體購買于上海麥約爾生物技術(shù)有限公司。
[0039] 本發(fā)明提供的NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括類胰島素一號增長因子1~5重量份，優(yōu)選為 2~3重量份。在本發(fā)明中，所述類胰島素一號增長因子（IGF-I)是人體內(nèi)肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、 脾細(xì)胞等十幾種細(xì)胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物，是人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑， 同時對維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平具有重要作用，與一些生長因子何用能夠促進(jìn)細(xì)胞 分化成熟。本發(fā)明對所述類胰島素一號增長因子的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的類胰島素一號增長因子即可，如可以采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實施例