細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件和細(xì)胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于在活體外進(jìn)行人、動(dòng)物等的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件。另外，本發(fā)明涉及在活體外進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在活體內(nèi)，細(xì)胞具有某規(guī)則、三維地排列和配置。然而，現(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)中，涉及該細(xì)胞的排列.配置的技術(shù)是極有限的。
[0003]到目前為止，涉及二維的細(xì)胞排列已經(jīng)有報(bào)告。例如，形成細(xì)胞粘接性表面和非粘接性表面的圖案，由此進(jìn)行細(xì)胞的二維粘接，接著控制增殖圖案，由此進(jìn)行。如果列舉一例，現(xiàn)有的已知有:在基材上將溫度靈敏性高分子用微細(xì)的線寬圖案化的細(xì)胞培養(yǎng)支持體，和用該細(xì)胞培養(yǎng)支持體培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法(例如，參見專利文獻(xiàn)I)。上述的細(xì)胞培養(yǎng)支持體能夠用毛細(xì)血管的線寬將細(xì)胞培養(yǎng)部位圖案化，所以能夠二維地(膜面方向)控制培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。
[0004]與此相對(duì)，幾乎不能存在三維的細(xì)胞排列的技術(shù)方法論。報(bào)告了將細(xì)胞片重疊而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維排列的技術(shù)(例如，參見專利文獻(xiàn)2)。但是，不能說(shuō)細(xì)胞重層化而成的內(nèi)部的結(jié)構(gòu)一定是被人為控制的。另外，提出了使現(xiàn)有的細(xì)胞三維地.立體地增殖從而制作塊狀的細(xì)胞塊的細(xì)胞培養(yǎng)法。然而，該方法論中，三維的細(xì)胞排列不能人為地控制。
[0005]細(xì)胞的三維?立體培養(yǎng)(塊狀培養(yǎng))中屢次產(chǎn)生向位于立體形狀內(nèi)部的細(xì)胞的供氧、供營(yíng)養(yǎng)變差，內(nèi)部細(xì)胞的功能降低，或者細(xì)胞死亡。與此相對(duì)，活體盡管是由細(xì)胞的三維的集合體構(gòu)成，但是沒有產(chǎn)生這樣的問題。其理由是由于，三維細(xì)胞集合體中存在有血管，良好地向立體形狀內(nèi)部的細(xì)胞供給氧、營(yíng)養(yǎng)。
[0006]這樣，為了三維地使細(xì)胞生存、起作用，血管網(wǎng)的形成是關(guān)鍵(必須事項(xiàng))。該血管網(wǎng)的形成還是三維的血管細(xì)胞的排列。與這樣的體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)相近的細(xì)胞排列的控制技術(shù)的開發(fā)成為今后的細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展必不可缺的課題。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開2010-98973號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)2:日本特開2005-342112號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明要解決的問題
[0012]因此，本發(fā)明的課題在于得到能夠在三維方向控制培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件。
[0013]本發(fā)明的其他的課題在于提供能夠在三維方向控制培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。另外，本發(fā)明的課題在于，能夠在三維方向上控制第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提供共培養(yǎng)第二細(xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)方法。_4] 用于解決問題的方案
[0015]本發(fā)明中，利用細(xì)胞與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度梯度對(duì)應(yīng)的性質(zhì)，來(lái)控制細(xì)胞的三維排列。首先，在基材上，將緩釋(緩緩地釋放)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的水凝膠層形成為二維圖案。接著，在該形成了圖案的基材上放置能夠移動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)部位(例如，基底膜(matrigel))層，在該培養(yǎng)部位上接種細(xì)胞。
[0016]隨著細(xì)胞生長(zhǎng)因子的釋放，在培養(yǎng)部位內(nèi)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子的三維濃度梯度圖案。沿著該三維圖案細(xì)胞移動(dòng)。結(jié)果，培養(yǎng)部位內(nèi)形成有按照細(xì)胞生長(zhǎng)因子的三維濃度梯度圖案的、細(xì)胞排列。
[0017]本發(fā)明將由水凝膠的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋性和水凝膠的二維圖案組合，能夠在培養(yǎng)部位內(nèi)形成三維的細(xì)胞排列。
[0018]本發(fā)明的一方式的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件為在基板上形成有圖案狀且層狀的水凝膠部位，覆蓋前述水凝膠部位而形成有層狀的培養(yǎng)部位，其特征在于，
[0019]前述培養(yǎng)部位的表面為第一細(xì)胞種接種面，
[0020]前述水凝膠部位浸潤(rùn)有細(xì)胞生長(zhǎng)因子，
[0021]由前述水凝膠部位向前述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0022]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件優(yōu)選的實(shí)施方式中，前述水凝膠部位的厚度可以為由前述水凝膠部位向前述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子2天以上且21天以下的厚度，另外，前述水凝膠部位的厚度也可以為Iym以上且30mm以下。
[0023]對(duì)于本發(fā)明的進(jìn)而其他優(yōu)選的實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，
[0024]前述水凝膠部位可以由熱交聯(lián)明膠形成，另外，形成前述水凝膠部位的水凝膠的含水率可以為70%以上且99%以下。
[0025]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法包括以下的工序。
[0026]工序a.在基板上形成圖案狀且層狀的水凝膠部位
[0027]工序b.在前述水凝膠部位浸潤(rùn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子
[0028]工序c.覆蓋前述水凝膠部位而形成層狀的培養(yǎng)部位，從而完成細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件
[0029]工序d.在前述培養(yǎng)部位的表面接種第一細(xì)胞種的第一細(xì)胞種接種工序
[0030]工序e.將結(jié)束了第一細(xì)胞種接種工序的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件置于培養(yǎng)條件下的第一細(xì)胞種培養(yǎng)工序
[0031 ] 本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)選的實(shí)施方式中，
[0032]d工序的第一細(xì)胞種接種工序所使用的第一細(xì)胞種可以為接種前進(jìn)行了饑餓處理的細(xì)胞，另外，將形成前述水凝膠部位的水凝膠的含水率設(shè)在70%以上且99%以下的范圍，通過在前述范圍內(nèi)變更水凝膠的含水率，可以調(diào)節(jié)由前述水凝膠部位向前述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子的時(shí)間。
[0033]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，
[0034]也可以接著作為e工序的第一細(xì)胞種培養(yǎng)工序，進(jìn)行以下的工序:
[0035]工序f.在前述培養(yǎng)部位接種第二細(xì)胞種的第二細(xì)胞種接種工序；和
[0036]工序g.將結(jié)束了第二細(xì)胞種接種工序的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件置于培養(yǎng)條件下的第二細(xì)胞種培養(yǎng)工序。
[0037]以上說(shuō)明的本發(fā)明可以將本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式、它們中包含的構(gòu)成要素盡可能地組合而實(shí)施。
[0038]發(fā)明的效果
[0039]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件具備具有浸潤(rùn)有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的一定厚度的水凝膠部位，細(xì)胞生長(zhǎng)因子由水凝膠部位被緩釋，所以與其他的發(fā)明技術(shù)特征相結(jié)合，培養(yǎng)中的第一細(xì)胞種由培養(yǎng)部位的表面向水凝膠部位移動(dòng)時(shí)進(jìn)行增殖。結(jié)果，不僅能夠控制起因于水凝膠部位的圖案形成的第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的二維結(jié)構(gòu)(基材的表面方向)，還能夠控制培養(yǎng)部位向?qū)雍穸确较虻慕Y(jié)構(gòu)。即，能夠控制培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的三維結(jié)構(gòu)。
[0040]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法中，與上述細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件同樣地，能夠控制培養(yǎng)細(xì)胞(集合體)的三維結(jié)構(gòu)。
【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1為細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件的截面說(shuō)明圖。
[0042]圖2為去除了培養(yǎng)部位的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件的說(shuō)明圖，圖2的(a)為截面說(shuō)明圖，圖2的(b)為平面說(shuō)明圖。
[0043]圖3為第一細(xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)方法的概念說(shuō)明圖，分別地，圖3的(a)為第一細(xì)胞種剛接種之后的概念說(shuō)明圖、圖3的(b)為第一細(xì)胞種培養(yǎng)初期的概念說(shuō)明圖、圖3的(c)為第一細(xì)胞種培養(yǎng)后期的概念說(shuō)明圖。
[0044]圖4為表示實(shí)施例的評(píng)價(jià)結(jié)果的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下，參見附圖對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件和細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)一步進(jìn)行說(shuō)明。本說(shuō)明書中，參見的各圖為了使本發(fā)明容易理解，將一部分構(gòu)成要素夸張地表達(dá)等示意地表示。因此，存在構(gòu)成要素間的尺寸、比率等與實(shí)物不同的情況。另外，本發(fā)明的實(shí)施例所述的構(gòu)件、部分的尺寸、材質(zhì)、形狀、其相對(duì)位置等，只要沒有特別的記載，本發(fā)明的范圍就不只限定于此，這些只不過是簡(jiǎn)單的說(shuō)明例。
[0046]<細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件>
[0047]圖1為細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件I的截面說(shuō)明圖，圖2為去除了培養(yǎng)部位13的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件I的說(shuō)明圖，圖2的(a)為截面說(shuō)明圖、圖2的(b)為平面說(shuō)明圖。
[0048]細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件I在基板11上形成有水凝膠部位12，覆蓋水凝膠部位12而形成有培養(yǎng)部位13。水凝膠部位12為細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋用載體。另外，水凝膠部位12也是第一細(xì)胞種的增殖細(xì)胞的粘接部位。
[0049]基板11的形狀通常為平板、薄平板或者薄膜狀。在基板11上，水凝膠部位12形成為圖案狀，在沒有水凝膠部位12的部分，細(xì)胞非粘接部分15露出。如果構(gòu)成基板11的基材11-1由細(xì)胞非粘接材料(例如聚二甲基硅氧烷(以下，稱為PDMS))形成，則基板11只由基材11_1構(gòu)成。
[0050]如果基材11-1由細(xì)胞粘接材料(例如聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(以下，稱為PET))形成，則通過在基材11-1的上表面的整面層狀地涂布細(xì)胞非粘接材料，從而形成細(xì)胞非粘接層11-2。本發(fā)明中，細(xì)胞非粘接層11-2可以根據(jù)基材11-1的材料、表面性質(zhì)等有必要存在或不必要存在。
[0051]基材11-1的材料為:PDMS、PET、玻璃、硅、金屬(氧化鋁、SUS304等不銹鋼、金、銀等)、金屬氧化物(氧化鋁、氧化鈦、氧化銦錫(ITO)、氧化錫)等。細(xì)胞非粘接層11-2的材料為瓊脂糖、聚乙二醇、PDMS等。
[0052]水凝膠部位12形成為圖案狀且層狀。形成為圖案狀的理由為用于控制第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞集合體的二維(基板11的平面方向)形狀。參見圖2的(b)，本實(shí)施例中，水凝膠部位12為直線狀，成為5根直線平行排列的圖案。對(duì)于形成為圖案狀的水凝膠部位的線寬(箭頭22)，沒有特別的限制，優(yōu)選為ΙΟμπι?500 μπι。對(duì)于形成為圖案狀的水凝膠部位相互間的間隔(箭頭23)，沒有特別地限制，優(yōu)選為50 μπι?100ymo
[0053]水凝膠部位12形成為層狀而賦予高度。通過賦予高度，對(duì)水凝膠部位12賦予體積，所以在水凝膠部位12浸潤(rùn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液，由此用于細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋的貯存變得可能。
[0054]為了貯存且緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子，水凝膠部位12由水凝膠形成。
[0055]另外，對(duì)于形成為層狀的水凝膠部位12的厚度(箭頭21)，沒有特別地限定。只要是對(duì)于接種的細(xì)胞在面向水凝膠部位12的方向移動(dòng)、能夠緩釋增殖充分的時(shí)間和量的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的貯存量即可。
[0056]如果調(diào)節(jié)水凝膠的交聯(lián)度，則能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋時(shí)間。作為對(duì)應(yīng)于水凝膠的交聯(lián)度的指標(biāo)，有含水率。水凝膠的交聯(lián)度通常為70%以上且99%以下，優(yōu)選為90%以上且99%以下。因?yàn)槿绻麑⒑试O(shè)在該范圍，則在第一細(xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)期間中的全部期間，對(duì)于賦予第一細(xì)胞種的增殖細(xì)胞的增殖方向的充分的細(xì)胞生長(zhǎng)因子被持續(xù)地緩釋。
[0057]水凝膠部位12所要求的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋期間優(yōu)選為2天以上且21天以下。另外，水凝膠部位12優(yōu)選的厚度為I μ m以上且3000 μ m以下，更優(yōu)選為20 μ m以上且70 μ m以下。因?yàn)樵诘谝患?xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)期間中的全部期間，對(duì)于賦予第一細(xì)胞種的增殖細(xì)胞的增殖方向的充分的細(xì)胞生長(zhǎng)因子被持續(xù)地緩釋。
[0058]水凝膠部位12的材料為明膠、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、纖維蛋白等，特別優(yōu)選為明膠。因?yàn)槊髂z能夠在比較低溫下通過加熱進(jìn)行熱交聯(lián)。
[0059]水凝膠部位12的形成方法能夠通過如下的任意方法進(jìn)行:(I)在玻璃板等上制作成規(guī)定厚度的薄層物，將其切出而載置于基板11上的方法；(2)使用分配器(dispenser)載置凝膠狀材料的方法；(3)用絲網(wǎng)印刷進(jìn)行套印的方法；等。
[0060]培養(yǎng)部位13覆蓋水凝膠部位12而形成為層狀。如果考慮基板的平面方向，則培養(yǎng)部位13在該平面方向形成為面狀。水凝