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間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

文檔序號(hào):9411466閱讀:743來源:國知局
間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)軟骨組織缺損在當(dāng)代是一種常見的疾病,由腫瘤引起的損傷、由年齡引起的 病變,各種各樣的遺傳疾病和軟骨組織異常生長以及外傷都能造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷和缺 失。關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力較低,主要有兩個(gè)方面的原因:一是軟骨細(xì)胞屬于終末分化細(xì) 胞,代謝活性低,自我增殖能力差;二是軟骨組織沒有血管和神經(jīng)。臨床上最常應(yīng)用的是一 種所謂的微骨折的手術(shù)治療方法,該方法是將一根細(xì)針穿透受損軟骨組織直達(dá)骨髓,誘使 骨髓細(xì)胞(含間充質(zhì)干細(xì)胞)隨著血液流到破損之處,而后經(jīng)過原位誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞形 成軟骨細(xì)胞。但此修復(fù)方法最終形成的是一種纖維軟骨,與正常的透明軟骨組織比較,纖維 軟骨含有的II型膠原與軟骨聚集蛋白聚糖的含量較低,不能完全替代正常的軟骨功能,長 期的治療效果不理想。
[0003]當(dāng)傳統(tǒng)方法不能有效解決關(guān)節(jié)軟骨缺損疾病時(shí),并且隨著生物技術(shù)的發(fā)展,軟骨 組織工程有希望能夠解決軟骨組織再生的難題。在軟骨組織工程中,軟骨細(xì)胞有兩大缺陷, 首先是細(xì)胞來源受到限制,其次是軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)生去分化的顯像,喪失軟骨 細(xì)胞表型以及分泌特定的胞外基質(zhì)的能力。三維支架材料可以有效地維持軟骨細(xì)胞形態(tài), 但軟骨細(xì)胞在支架材料上的增殖速率相對(duì)于平面培養(yǎng)仍然較低,難以獲得足夠量的細(xì)胞。
[0004] 而間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞,它能夠定向誘導(dǎo)為胰島樣細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。且間充質(zhì)細(xì)胞存在于人體多種組織中,尤其是臍帶、胎盤、骨髓、 脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有來源廣泛、易于采集、無倫理問題等優(yōu)勢,可規(guī)模化誘 導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞,為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷提供新的技術(shù)方案。但目前多采用間充質(zhì)干 細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞,這種共培養(yǎng)方式不僅誘 導(dǎo)轉(zhuǎn)化率低,而且細(xì)胞活性較低,軟骨細(xì)胞分離較困難,免疫性低等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是,針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中共培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞 獲得軟骨細(xì)胞的方式存在誘導(dǎo)率低,細(xì)胞活性差,兩種細(xì)胞分離困難等缺陷,提供一種能夠 提高間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率,增強(qiáng)細(xì)胞活性且易分離的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng) 方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo) 培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
[0007] 獲取間充質(zhì)干細(xì)胞;
[0008] 將間充質(zhì)干細(xì)胞與可溶性的海藻酸鹽混合后,再與除鎂離子以外的二價(jià)金屬離子 鹽溶液混合,至形成凝膠球;
[0009] 用誘導(dǎo)劑對(duì)凝膠球內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0010] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述凝膠球的形成過程 為:將所述間充質(zhì)干細(xì)胞與可溶性的海藻酸鹽混合后勻速滴入除鎂離子以外的二價(jià)金屬離 子鹽溶液中。
[0011] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述海藻酸鹽為海藻酸 鈉,且與所述間充質(zhì)干細(xì)胞混合之前,海藻酸鈉的濃度為2% -10% W/V。
[0012] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述二價(jià)金屬離子鹽溶液 為氯化鈣溶液,且氯化鈣的濃度為1% -5 % W/V。
[0013] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,對(duì)所述凝膠球內(nèi)的間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)之前,還包括清洗凝膠球的步驟。
[0014] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗凝膠 球。
[0015] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述誘導(dǎo)劑包括5-15ng/ ml的TGF-0、7_10mmol/l地塞米松、50-100ug/ml抗壞血酸、5_15mmol/l甘油磷酸鈉和 50_150ng/ml 的 ITS+Premix〇
[0016] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述誘導(dǎo)劑還包括胰島素 和轉(zhuǎn)鐵蛋白,所述胰島素的濃度為5-10mg/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為5-10mg/ml。
[0017] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,所述誘導(dǎo)劑還包括谷氨酰 胺,所述谷氨酰胺的濃度為l-10mm〇L/L。
[0018] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中,對(duì)所述凝膠球中的間充質(zhì) 干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的。
[0019] 實(shí)施本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,可以達(dá)到以下有益效果: 通過利用海藻酸膠體的多孔三維空間結(jié)構(gòu),為間充質(zhì)干細(xì)胞提供一個(gè)模擬體內(nèi)骨髓三維微 環(huán)境,擴(kuò)大了間充質(zhì)干細(xì)胞的生長空間,以及與培養(yǎng)液及細(xì)胞間的物質(zhì)信號(hào)交流,促進(jìn)間充 質(zhì)干細(xì)胞的生長分化,提高轉(zhuǎn)化率,增強(qiáng)細(xì)胞活性;同時(shí),相較于現(xiàn)有技術(shù)中的共培養(yǎng)方式, 本發(fā)明也可省去分離兩種細(xì)胞的過程。
【附圖說明】
[0020] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明,附圖中:
[0021] 圖1為本發(fā)明提供的檢測實(shí)驗(yàn)三中,根據(jù)Chs標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液的濃度及其0D值所 制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中利用間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)獲得軟骨細(xì)胞的方式存 在誘導(dǎo)周期長,轉(zhuǎn)化率低,細(xì)胞分離困難,免疫安全性低,需要軟骨細(xì)胞源等缺陷,本發(fā)明的 創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種單獨(dú)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞的方法,通過利用海藻酸凝膠 的三維結(jié)構(gòu),模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境,為間充質(zhì)干細(xì)胞提供充足的生長空間,增加間充 質(zhì)干細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積,從而實(shí)現(xiàn)了提高間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率,增強(qiáng)細(xì)胞活性并 可免去分離細(xì)胞步驟的目的。
[0023] 本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
[0024] -、獲取間充質(zhì)干細(xì)胞;
[0025] 二、將間充質(zhì)干細(xì)胞與可溶性的海藻酸鹽混合后,加入除鎂離子以外的二價(jià)金屬 離子鹽溶液中,至形成凝膠球;
[0026] 三、清洗凝膠球后,用誘導(dǎo)劑對(duì)凝膠球內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)7-28天。
[0027] 步驟一中,間充質(zhì)干細(xì)胞可來源于臍帶、胎盤、骨髓等,優(yōu)選地,從骨髓中獲取間充 質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地,間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為5-15 X 106個(gè)/ml。
[0028] 步驟二中,海藻酸鹽高分子在除鎂以外的二價(jià)金屬離子的作用下交聯(lián)而失去了流 變性后,水分子的流動(dòng)受到了抑制,進(jìn)而產(chǎn)生了含水量極高且具有通孔的凝膠體,并且海藻 酸鹽的凝膠體不是熱可逆的,具有很好的穩(wěn)定性及生物相容性,因此,能夠?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞 提供穩(wěn)定的三維生長空間,模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境,擴(kuò)大了間充質(zhì)干細(xì)胞的生長空間, 并且增大了間充質(zhì)干細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積,有利于細(xì)胞的貼附、生長和分化;而本發(fā)明 在形成海藻酸凝膠球之前即將間充質(zhì)干細(xì)胞與海藻酸鹽混合,使得凝膠球形成之后,間充 質(zhì)干細(xì)胞能夠均勻分布在凝膠球中,更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0029] 需要注意的是,由于金屬離子和海藻酸鹽的反應(yīng)迅速,可通過提高凝膠化溫度,鈣 離子總量或降低海藻酸鹽溶液濃度來加快膠化過程;而減慢固化速度、提高海藻酸鹽溶液 濃度、鈣離子總量以及使用分子質(zhì)量較高的海藻酸鹽,可以增強(qiáng)其力學(xué)性能,更有利于間充 質(zhì)干細(xì)胞的分化。另外,海藻酸鹽與金屬離子鹽溶液的滴加順序及滴加速度會(huì)影響膠體的 性質(zhì),滴加速度過快,產(chǎn)生的膠體是小片狀凝膠和間斷的凝膠結(jié)構(gòu),間充質(zhì)干細(xì)胞分布不均 勻;優(yōu)選地,本發(fā)明采用將間充質(zhì)干細(xì)胞與海藻酸鹽混合后勻速滴入金屬離子鹽溶液中,以 此形成的凝膠球大小較均勻,也不會(huì)影響間充質(zhì)干細(xì)胞在膠體內(nèi)的均勻分布。
[0030] 其中,單價(jià)陽離子和Mg2+不能形成凝膠,而Ba2+和Sr2+所形成的凝膠比Ca 2+形成 的凝膠性能更強(qiáng)。其他多價(jià)陽離子,如Pb2+、Cu2+、Cd 2+、Co2+、Ni2+、Zn2+和Mn 2+等也可以形成 海藻酸鈉交聯(lián)凝膠,但因具有毒性其應(yīng)用受限;因此,優(yōu)選地,二價(jià)金屬離子為鈣離子,且二 價(jià)金屬離子鹽溶液為氯化鈣溶液,〇 &(:12的濃度為1 % -5 % W/V,鈣離子濃度越大,凝膠球直 徑越大,形成的孔隙結(jié)構(gòu)越多,凝膠球的滲透能力也越強(qiáng),越有利于細(xì)胞附著生長、分化;海 藻酸鹽為海藻酸鈉或海藻酸鈣等,優(yōu)選為海藻酸鈉溶液,海藻酸鈉的濃度為3% -10% W/V。 本發(fā)明中單位W/V如無特別指出均為mg/ml。
[0031] 步驟三中,待凝膠球形成之后,去除多余的金屬離子鹽溶液,并用NaCl溶液反復(fù) 清洗,再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗,去除凝膠球表面的二價(jià)金屬離子,避免二價(jià)金屬離子在細(xì)胞培 養(yǎng)過程中產(chǎn)生毒性作用;然后,再將含有間充質(zhì)干細(xì)胞的凝膠球置于添加有誘導(dǎo)培養(yǎng)液的 培養(yǎng)容器中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0032] 其中,培養(yǎng)容器可以是靜態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)板,也可以是生物反應(yīng)器,既能實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)培 養(yǎng),也可在不通電的情況下進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng),生物反應(yīng)器可以是轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng),包括轉(zhuǎn)瓶和轉(zhuǎn)瓶 機(jī);也可以是搖瓶、灌注系統(tǒng)等,可根據(jù)不同的誘導(dǎo)需求進(jìn)行選擇。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)不僅可以實(shí)現(xiàn) 大規(guī)模地培養(yǎng)細(xì)胞,獲得足夠量的細(xì)胞,而且還可以更加精確地控制反應(yīng)條件,便于未來規(guī) 模化生產(chǎn),其次,動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可以提高培養(yǎng)過程中傳質(zhì)和傳氧的效率,可以有效克服靜態(tài)培養(yǎng)
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