羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的原始未分化細(xì)胞，處于未定向 分化狀態(tài)并具有增殖能力。在特定條件下，干細(xì)胞可分化成不同類型的具有特征性形態(tài)、特 異分子標(biāo)志和特殊功能的成熟細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞來源的不同可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC)和來源于出生后器官或成年個(gè)體組織的組織干細(xì)胞或成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC)。從來源看，要獲取大量干細(xì)胞較困難。因此，尋找新的干細(xì)胞源成為熱 點(diǎn)。
[0003] 近年研宄表明：羊水（amniotic fluid，AF)中存在干細(xì)胞，可以分化為多種成體 細(xì)胞，有望成為一種新的干細(xì)胞來源，且可避免ESC的倫理問題以及ASC的局限性。羊水干 細(xì)胞（amniotic fluid-derived stem cell，AFS)可通過AF穿刺獲取，較ESC易獲取。羊 水細(xì)胞比其它普通類型的細(xì)胞有著很多優(yōu)點(diǎn)：首先，正常情況下羊水細(xì)胞在孕婦臨產(chǎn)前就 能夠被提取。其次，羊水混合物中所包含細(xì)胞的"年齡"都比較小，因此這些細(xì)胞遭受周圍 環(huán)境引起的誘發(fā)突變的可能性就很小，從遺傳學(xué)角度來說它們會(huì)更穩(wěn)定。
[0004] 羊水中含有較多類型的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞等，在分離和培養(yǎng)的過程中需要去除。目 前，對(duì)羊水干細(xì)胞的分選多采用免疫磁珠分選法，但該方法對(duì)細(xì)胞活性存在一定影響，且費(fèi) 用較高。還有些方法采用機(jī)械分離，但人為刮除內(nèi)皮細(xì)胞的方法操作十分繁瑣且極易引起 污染，并且，極易造成細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性的降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng) 方法；本發(fā)明提供的方法利用差速貼壁原理，簡化了操作，獲得的干細(xì)胞純度較高，活性良 好，經(jīng)傳代后仍保持良好的干性。
[0006] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法包括：
[0007] 步驟1 :明膠鋪板后接種羊水組織細(xì)胞，培養(yǎng)llh~13h后轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液；
[0008] 步驟2 :將所述培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞融合率不低于85 %，獲得初步純化的細(xì)胞；
[0009] 步驟3 :將所述初步純化的細(xì)胞重懸，培養(yǎng)3h~5h后，更新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì) 胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，獲得羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明提供的方法，利用差速貼壁原理，在適宜條件下，使內(nèi)皮細(xì)胞先貼壁生長。 本發(fā)明準(zhǔn)確控制培養(yǎng)時(shí)間，待內(nèi)皮細(xì)胞貼壁完成后，轉(zhuǎn)移包含羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。 對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)后獲得羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法操作簡單，無需更多 的儀器，且無需人為刮除的操作，避免了細(xì)胞的損傷和污染。檢測結(jié)果表明，步驟1中獲得 的培養(yǎng)液中所包含的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的活力不低于89. 28%，經(jīng)傳代3代，流式細(xì)胞檢測 結(jié)果表明，其表面抗體仍符合干細(xì)胞特性，未見分化趨勢。
[0011] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1中接種的羊水組織細(xì)胞密度為5X105個(gè)/mL。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1中接種羊水組織細(xì)胞的量為2mL。
[0013] 步驟1中接種密度和細(xì)胞量直接影響細(xì)胞增殖速率和貼壁效果，密度過高則內(nèi)皮 細(xì)胞不能完全貼壁，而密度過低則細(xì)胞貼壁速度過緩，影響細(xì)胞活力。
[0014] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1中培養(yǎng)的培養(yǎng)基為Lonza完全培養(yǎng)基；步驟1中培養(yǎng) 的溫度為37°C，5%C02、濕度為95%。
[0015]Lonza完全培養(yǎng)基包括：無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra⑶LTURETM)、血清替代物 (PALLUltroserG)、谷氨酰胺和NEAA。
[0016] 其中，血清代替物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。
[0017] 谷氨酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。
[0018] NEAA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %。
[0019] 明膠可促進(jìn)細(xì)胞貼壁，明膠鋪板的方法為：向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 〇. 1 %的明膠溶液，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0020] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1中所述培養(yǎng)的時(shí)間為12h。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟2中培養(yǎng)的時(shí)間為72h。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟3中重懸至細(xì)胞密度為IX105個(gè)/mL。
[0023] 在本發(fā)明的是實(shí)施例中，步驟3重懸采用Lonza完全培養(yǎng)基；步驟3中所述培養(yǎng)的 溫度為37°C，5%C02、濕度為95%。
[0024] 在一些實(shí)施例中，重懸具體為：將初步純化的細(xì)胞經(jīng)胰酶酶解后，以Lonza完全培 養(yǎng)基重懸。
[0025] 作為優(yōu)選，胰酶酶解的酶解液中，胰酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%，EDTA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0? 02%〇
[0026] 在一些實(shí)施例中，步驟3中培養(yǎng)在平皿中進(jìn)行，培養(yǎng)量為8mL。
[0027] 在一些實(shí)施例中，步驟3所述培養(yǎng)的時(shí)間為4h，繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為120h。
[0028] 在一些實(shí)施例中，步驟3中更新培養(yǎng)基具體為，棄除平皿中的上清液，加入新的 Lonza完全培養(yǎng)基。
[0029] 加入新的Lonza完全培養(yǎng)基的量為8mL。
[0030] 在一些實(shí)施例中，羊水組織細(xì)胞的獲取方法為：將羊水離心后取沉淀，以PBS緩沖 液洗滌，獲得羊水組織細(xì)胞。
[0031] 優(yōu)選的，羊水為剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水。
[0032] 優(yōu)選的，離心的速度為2000rpm，時(shí)間為5min。
[0033] PBS緩沖液洗滌的體積為40mL。
[0034] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明分離培養(yǎng)的羊水組織細(xì)胞為人羊水組織細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明提供的方法，利用差速貼壁原理，在適宜條件下，使內(nèi)皮細(xì)胞先貼壁生長， 而此時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞尚未貼壁。本發(fā)明準(zhǔn)確控制培養(yǎng)時(shí)間，待內(nèi)皮細(xì)胞貼壁完成后，轉(zhuǎn)移 包含羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)后獲得羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。本 發(fā)明提供的方法操作簡單，無需更多的儀器，且無需人為刮除的操作，避免了細(xì)胞的損傷和 污染。檢測結(jié)果表明，步驟1中獲得的培養(yǎng)液中所包含的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的活力不低于 89. 28%，經(jīng)傳代3代，流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，其表面抗體仍符合干細(xì)胞特性，未見分化趨 勢。
【附圖說明】
[0036] 圖l_a示實(shí)施例1經(jīng)原代培養(yǎng)（24h)后的貼壁細(xì)胞形態(tài)，放大4倍；
[0037] 圖l_b示實(shí)施例1經(jīng)原代培養(yǎng)（72h)后的貼壁細(xì)胞形態(tài)，放大4倍；
[0038] 圖2示實(shí)施例1和對(duì)比例1~2細(xì)胞增殖曲線；其中，線1示實(shí)施例1的細(xì)胞增殖 曲線；線2示對(duì)比例1的細(xì)胞增殖曲線，線3示對(duì)比例2的細(xì)胞增長曲線；
[0039] 圖3-a示同型對(duì)照抗體檢測實(shí)施例1制得的第3代羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)果；分 別表示了所檢測的細(xì)胞數(shù)量；以及根據(jù)對(duì)照組細(xì)胞所設(shè)定抗體⑶73、⑶90、⑶105、HLA-DR、 CD45、CD34 的門；
[0040]圖3-b示實(shí)施例1制得的第3代示羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測結(jié)果；分別表達(dá)CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD34 的細(xì)胞含量。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 本發(fā)明提供了羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較 佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法 和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0042] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的純化過程具體為：
[0046] -、原代培養(yǎng)：
[0047] 1、取剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺(tái)中。
[0048] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0049] 3、每個(gè)50mL離心管中加入40mLPBS進(jìn)行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0050] 4、往六孔板中加入0. 1 %明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0051] 5、用lonza完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為5X105cell/mL，接種至孵育過 明膠的六孔板中，2mL/孔；轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0052] 6、培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內(nèi)皮細(xì)胞）， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0053] 7、24h后觀察到貼壁的細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞（倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，圖 l_a)，共培養(yǎng)72h(倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，圖1-b)。
[0054] 二、傳代培養(yǎng)：
[0055] 待原代細(xì)胞融合率達(dá)85 %時(shí)，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA進(jìn)行酶解傳代。
[0056] 調(diào)整細(xì)胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 培養(yǎng)4h。
[0057] 4h后，取出平皿，吸棄上清，加入新lonza完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0058] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細(xì)胞為進(jìn)一步純化的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0059] 經(jīng)檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞純度為99. 3%。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的純化過程具體為：
[0062] -、原代培養(yǎng)：
[0063] 1、取剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺(tái)中。
[0064] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0065] 3、每個(gè)50mL離心管中加入