膠部位12被基板11上的細(xì)胞非粘接部分15包圍，且培養(yǎng)部位13形成為面狀，所以培養(yǎng)部位13覆蓋著水凝膠部位12和細(xì)胞非粘接部分15ο
[0061]培養(yǎng)部位13的上表面為第一細(xì)胞種接種面14。細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件I中，成為培養(yǎng)對(duì)象的第一細(xì)胞種被置于第一細(xì)胞種接種面14。培養(yǎng)部位13的上表面為形成為層狀的培養(yǎng)部位13的2個(gè)面中、遠(yuǎn)離基板11的面。
[0062]培養(yǎng)部位13為第一細(xì)胞種增殖的部位。另外，培養(yǎng)部位13為細(xì)胞生長因子由水凝膠部位12緩釋的部位。進(jìn)而，培養(yǎng)部位13還是第二細(xì)胞種增殖的部位。
[0063]培養(yǎng)部位13的層厚度，即由水凝膠部位12的表面至第一細(xì)胞種接種面14為止的距離(用箭頭26表示)為10 μπι?30mm，優(yōu)選為100 μπι?5mm。因?yàn)槿绻麑雍穸仍谠摲秶?，則能夠得到第一細(xì)胞種的增殖細(xì)胞被賦予細(xì)胞生長因子釋放方向的效果，并且向三維方向(層厚度方向)的結(jié)構(gòu)能被確認(rèn)。
[0064]培養(yǎng)部位13的材料為基底膜、膠原蛋白等。膠原蛋白可以為膠原蛋白凝膠，也可以為膠原蛋白海綿體。
[0065]〈細(xì)胞培養(yǎng)方法〉
[0066]接著，對(duì)于第一細(xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行說明。先于細(xì)胞的培養(yǎng)，準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件。
[0067]細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件通過如下工序完成:首先，(I)在基板11上形成圖案狀且層狀的水凝膠部位12的工序，然后(2)在水凝膠部位12浸潤細(xì)胞生長因子的工序，接著(3)覆蓋水凝膠部位12而形成層狀的培養(yǎng)部位13的工序。
[0068]圖3為第一細(xì)胞種的細(xì)胞培養(yǎng)方法的概念說明圖，圖3的(a)表示第一細(xì)胞種剛接種之后的狀態(tài)，圖3的(b)表示第一細(xì)胞種培養(yǎng)初期的狀態(tài)，圖3的(c)表示第一細(xì)胞種培養(yǎng)后期的狀態(tài)。
[0069]參見圖3的(a)，在作為培養(yǎng)部位的表面的第一細(xì)胞種接種面14接種培養(yǎng)細(xì)胞。將接種的第一細(xì)胞種的細(xì)胞的圖像用符號(hào)31表示。作為優(yōu)選能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的第一細(xì)胞種的例子，可列舉出:正常人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(以下，稱為HUVEC)、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等。
[0070]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法和細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件所使用的細(xì)胞生長因子，只要是具有促進(jìn)第一細(xì)胞種的細(xì)胞增殖和移動(dòng)的屬性的細(xì)胞生長因子，則沒有特別地限定。例如，培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞時(shí)選擇細(xì)胞生長因子VEGF ;培養(yǎng)淋巴管上皮細(xì)胞時(shí)選擇細(xì)胞生長因子VEGF ;培養(yǎng)表皮細(xì)胞時(shí)選擇角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞因子(KGF)而使用。
[0071]第一細(xì)胞種的接種細(xì)胞31優(yōu)選在接種前進(jìn)行饑餓處理(Starvat1n處理)。因?yàn)橄蚣?xì)胞生長因子方向移動(dòng)和向該方向的增殖能夠進(jìn)一步進(jìn)行。
[0072]參見圖3的(b)，由水凝膠部位12向培養(yǎng)部位13緩釋細(xì)胞生長因子。將釋放的細(xì)胞生長因子的圖像用箭頭34表示。接種的細(xì)胞31沿細(xì)胞生長因子34的方向移動(dòng)，在該方向上增殖。圖3的(b)中，將培養(yǎng)初期的培養(yǎng)細(xì)胞集合體的圖像用符號(hào)32表示。
[0073]重復(fù)培養(yǎng)期間中第一細(xì)胞種向釋放的細(xì)胞生長因子方向移動(dòng)和向該方向的增殖。到達(dá)培養(yǎng)終期時(shí)，第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞集合體成為將細(xì)胞接種面14與水凝膠部位12連接的狀態(tài)。圖3的(c)中，將培養(yǎng)終期的培養(yǎng)細(xì)胞集合體的圖像用符號(hào)33表示。這樣，能夠進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞集合體的三維(培養(yǎng)部分13的層厚度方向)結(jié)構(gòu)的控制。
[0074]在基板11上包圍水凝膠部位12的部分為細(xì)胞非粘接部分15，培養(yǎng)細(xì)胞不會(huì)到達(dá)細(xì)胞非粘接部分15。這樣，能夠進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞集合體的二維(培養(yǎng)部位13的面方向)結(jié)構(gòu)的控制。
[0075]培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞集合體33變?yōu)楣軤罱Y(jié)構(gòu)。
[0076]接著，對(duì)于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行說明。對(duì)于包含如上述得到的培養(yǎng)細(xì)胞集合體的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件接種第二細(xì)胞種。第二細(xì)胞種在培養(yǎng)部位進(jìn)行接種。之后，將細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件在培養(yǎng)條件下使第二細(xì)胞種增殖。對(duì)于培養(yǎng)條件，根據(jù)使用的細(xì)胞而不同，使用公知的培養(yǎng)方法。
[0077]這樣，能夠在與活體內(nèi)的環(huán)境類似的環(huán)境下進(jìn)行2種細(xì)胞的共培養(yǎng)。
[0078]第二細(xì)胞種的例子為:肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、伊東細(xì)胞(Ito cell)、胰實(shí)質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、間(充)質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。對(duì)于第一細(xì)胞種與第二細(xì)胞種的組合，沒有特別地限制。
[0079]實(shí)施例1
[0080]<細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件(培養(yǎng)部位形成前)的制作>
[0081]在熱板(50°C )上，在進(jìn)行了易粘接處理的PET薄膜(TEIJIN Tetron Film G274)上，棒涂瓊脂糖水溶液(80°C、5% )。烘箱中，進(jìn)行400C、30分鐘加熱干燥。
[0082]將玻璃板在熱板(50°C )上邊加溫邊涂布30%明膠水溶液。冷卻后切出明膠，載置于上述瓊脂糖涂布后的薄膜上。之后，切分該薄膜，得到明膠圖案基材。
[0083]對(duì)制作的明膠圖案基材進(jìn)行140°C、48小時(shí)真空加熱干燥，由此進(jìn)行明膠的交聯(lián)和滅菌。作為水凝膠部位的明膠的層厚度為50 μm，明膠的圖案為I根直線，線寬為70 μπι。對(duì)于制作的明膠圖案基材進(jìn)行140°C、48小時(shí)、真空加熱干燥，由此進(jìn)行明膠的交聯(lián)和基材的滅菌。
[0084]細(xì)胞生長因子使用HumanVEGF165。在HumanVEGF165的40ng/ml水溶液中浸漬交聯(lián)后明膠基材，使VEGF水溶液浸入基材上的明膠。另外，作為對(duì)照，在純水中浸漬交聯(lián)后明膠基材，使基材上的明膠浸入純水。
[0085]<第一細(xì)胞種的準(zhǔn)備>
[0086]接種(培養(yǎng))細(xì)胞使用HUVEC。用規(guī)定的培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC之后，在I天前將培養(yǎng)基(medium)更換成mediuml99+0.5% FCS (仔牛血清)+1 % P/S (青霉素鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)為饑餓處理(starvat1n處理)。剛進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，通過膠原酶処處理將HUVEC剝下。將得到的HUVEC用PKH26進(jìn)行熒光標(biāo)記。
[0087]〈接種與培養(yǎng)〉
[0088]在24孔板(24 well plate)下部將含浸VEGF的明膠圖案化基材靜置，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)插入物(24 well cell culture insert)上部制作作為培養(yǎng)部位的基底膜層。基底膜的濃度為10mg/ml。使用了應(yīng)用了該基底膜溶液20 μ I和50 μ I的2種細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件。基底膜溶液20 μ I的情況下，基底膜層的厚度為約0.7mm，基底膜溶液50 μ I的情況下，基底膜層的厚度為約1.7mm。對(duì)照在24孔板下部靜置純水含浸明膠圖案化基材，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)插入物上部，同樣地制作作為培養(yǎng)部位的基底膜層。
[0089]在作為細(xì)胞接種面的基底膜層表面接種饑餓處理后的PKH26熒光標(biāo)記HUVEC。在CO2孵化器內(nèi)進(jìn)行21小時(shí)培養(yǎng)。
[0090]<培養(yǎng)細(xì)胞的評(píng)價(jià)>
[0091]培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞培養(yǎng)插入物下部的熒光強(qiáng)度，由此對(duì)向培養(yǎng)部位(基底膜層)下部移動(dòng)的HUVEC細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0092]將評(píng)價(jià)結(jié)果示于圖4。與未添加VEGF組(對(duì)照組)進(jìn)行比較，含浸VEGF的明膠基材組中，細(xì)胞培養(yǎng)插入物下部的熒光強(qiáng)度增加。由此，利用含浸VEGF的明膠圖案化基材釋放的VEGF，HUVEC在培養(yǎng)部位(基底膜層)中向VEGF方向(下部)移動(dòng)。
[0093]附圖標(biāo)記說曰月
[0094]I細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件
[0095]11基板
[0096]11-1基材
[0097]11-2細(xì)胞非粘接層
[0098]12水凝膠部位
[0099]13培養(yǎng)部位
[0100]14第一細(xì)胞種接種面
[0101]15細(xì)胞非粘接部分
[0102]31第一細(xì)胞種的接種的細(xì)胞(圖像)
[0103]32第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞集合體培養(yǎng)初期(圖像)
[0104]33第一細(xì)胞種的培養(yǎng)細(xì)胞集合體培養(yǎng)后期(圖像)
[0105]34釋放的細(xì)胞生長因子(圖像)
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，其在基板上形成有圖案狀且層狀的水凝膠部位，覆蓋所述水凝膠部位形成有層狀的培養(yǎng)部位，其特征在于， 所述培養(yǎng)部位的表面為第一細(xì)胞種接種面， 所述水凝膠部位浸潤有細(xì)胞生長因子， 由所述水凝膠部位向所述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，其特征在于，所述水凝膠部位的厚度為由所述水凝膠部位向所述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長因子2天以上且21天以下的厚度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，其特征在于，所述水凝膠部位的厚度為Iμπι以上且30mm以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，其中，所述水凝膠部位由熱交聯(lián)明膠形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件，其特征在于，形成所述水凝膠部位的水凝膠的含水率為70%以上且99%以下。
6.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括以下的工序: 工序a.在基板上形成圖案狀且層狀的水凝膠部位； 工序b.在所述水凝膠部位浸潤細(xì)胞生長因子； 工序c.覆蓋所述水凝膠部位而形成層狀的培養(yǎng)部位，從而完成細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件； 工序d.在所述培養(yǎng)部位的表面接種第一細(xì)胞種的第一細(xì)胞種接種工序；和 工序e.將結(jié)束了第一細(xì)胞種接種工序的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件置于培養(yǎng)條件下的第一細(xì)胞種培養(yǎng)工序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法中，d工序的第一細(xì)胞種接種工序所使用的第一細(xì)胞種為在接種前進(jìn)行了饑餓處理的細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，將形成所述水凝膠部位的水凝膠的含水率設(shè)在70%以上且99%以下的范圍，通過將水凝膠的含水率在所述范圍內(nèi)變更，調(diào)節(jié)由所述水凝膠部位向所述培養(yǎng)部位緩釋細(xì)胞生長因子的時(shí)間。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，接著作為e工序的第一細(xì)胞種培養(yǎng)工序，進(jìn)行以下的工序: 工序f.在所述培養(yǎng)部位接種第二細(xì)胞種的第二細(xì)胞種接種工序；和工序g.將結(jié)束了第二細(xì)胞種接種工序的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件置于培養(yǎng)條件下的第二細(xì)胞種培養(yǎng)工序。
【專利摘要】課題在于得到能夠在三維方向控制培養(yǎng)細(xì)胞集合體的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件。一種細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)件(1)，其在基板(11)上形成有圖案狀且層狀的水凝膠部位(12)，覆蓋水凝膠部位(12)而形成有層狀的培養(yǎng)部位(12)。培養(yǎng)部位的表面為第一細(xì)胞種接種面(14)。水凝膠部位(12)浸潤細(xì)胞生長因子，水凝膠部位的厚度為能夠在培養(yǎng)期間將細(xì)胞生長因子由水凝膠部位(12)向培養(yǎng)部位(13)緩釋的厚度。
【IPC分類】C12N5-071, C12N1-00, C12M3-04
【公開號(hào)】CN104704108
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380052207
【發(fā)明人】田畑泰彥, 小尾奈緒子, 住吉千夏子, 村上英樹
【申請(qǐng)人】日本寫真印刷株式會(huì)社
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年9月27日
【公告號(hào)】EP2905330A1, US20150275172, WO2014054538A1