專利名稱：重組微生物和使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過將規(guī)定的基因導入宿主微生物而被賦予了期望的功能的重組微生物及使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。
背景技術：
脂肪族聚酯作為在自然界中容易分解的生物可降解性塑料，以及作為可由糖、植物油等可再生的碳資源合成的“綠色”塑料受到關注?，F(xiàn)在，作為脂肪族聚酷，實際利用聚乳酸等具有乳酸骨架的物質。作為利用重組微生物來制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，已知例如專利文獻I (W0 2006/126796)所公開的技木。專利文獻I中公開了ー種重組大腸桿菌，其是在成為宿主的大腸桿菌中，導入編碼將乳酸轉換為乳酰輔酶A的酶的基因和編碼以乳酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的酶的基因而成的。在專利文獻I所公開的技術中，作為編碼將乳酸轉換為乳酰輔酶A的酶的基因，使用源自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的pet基因。另外，在相同技術中，作為編碼以乳酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的酶的基因，使用源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)61-3株的phaC2基因。但是，在專利文獻I中，不能說聚乳酸等脂肪族聚酯的生產率充分，另外用于提高該生產率的各種研究尚不充分。例如，在專利文獻2(W02008/062999)中公開以下的嘗試，通過在源自假單胞菌(Pseudomonassp. )6-19株的phaCl基因中導入特定的變異,提高以乳酰輔酶A作為底物的乳酸均聚物或聚乳酸共聚物的合成能力。如上述那樣的利用重組微生物來制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，是在該微生物內蓄積脂肪族聚酯，將微生物破碎并回收作為目標的脂肪族聚酯的技木?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻I :W0 2006/126796專利文獻2 W0 2008/062999

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題但是，以往利用重組微生物來制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，由于在微生物的內部蓄積脂肪族聚酯，因而存在生產率低這樣的問題，另外，存在需要用于破碎微生物并回收脂肪族聚酯的復雜エ序這樣的問題。因此，本發(fā)明的目的在于，提供脂肪族聚酯的生產率優(yōu)異的重組微生物的同時，提供利用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。用于解決課題的方法為了達成上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，導入了丙酰輔酶A轉移酶基因和源自規(guī)定的微生物的聚羥基烷酸合酶基因的重組微生物在菌體外生產聚乳酸等脂肪族聚酯，從而完成了本發(fā)明。
SP，本發(fā)明包含以下(I) (11)。(I) ー種脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對宿主微生物導入編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因而成的，由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酷。(2)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是以2 5聚物為主的低聚物。(3)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酷。(4)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯為聚乳 酸。(5)根據(jù)⑴所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為基主培養(yǎng)基。(6)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，將所述重組微生物培養(yǎng)48小時以上，然后回收所述脂肪族聚酷。(7)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是選自源自泊庫島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因、源自類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜 根瘤菌(Rhizobiumetli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因以及源自死海鹽盒菌(Haloarculamarismortui)的基因的至少一種以上的基因。(8)根據(jù)⑴所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是以下的(a) (C)所示的基因(a)編碼包含序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質的基因，(b)編碼包含在序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質的基因，(c)對具有序列號5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質的基因。(9) 一種重組微生物，其是對宿主微生物導入編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因而成的，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是選自源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因、源自類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因的至少ー種以上的基因。(10)根據(jù)(9)所述的重組微生物，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是以下的(a) (C)所示的基因(a)編碼包含序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質的基因，(b)編碼包含在序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質的基因，(c)對具有序列號5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質的基因。(11)根據(jù)(9)所述的重組微生物，其特征在于，所述宿主微生物是大腸桿菌。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權基礎的日本專利申請2010-069688號的說明書和/或附圖記載的內容。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在外部生產脂肪族聚酯的重組微生物。即，本發(fā)明的重組微生物，與現(xiàn)有的重組微生物比較，脂肪族聚酯的生產率優(yōu)異。另外，通過利用本發(fā)明的重組微生物，可提供生產率優(yōu)異的脂肪族聚酯的制造方法。


圖I是顯示通過GC-MS測定各重組大腸桿菌的乳酸聚合物的生產量的結果的特性圖。圖2是顯示對于導入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的的PHA合酶基因(編號8)、源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號10)的任一基因的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸2聚物的結果的特性圖。圖3是顯示對于導入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號8)、源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號10)的任一基因的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸3聚物的結果的特性圖。圖4是顯示對于導入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號8)、源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號10)的任一基因的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸4聚物的結果的特性圖。圖5是顯示對于導入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號8)、源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號10)的任一基因的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸5聚物的結果的特性圖。圖6是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸2聚物的結果的特性圖。圖7是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸3聚物的結果的特性圖。圖8是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸4聚物的結果的特性圖。圖9是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸5聚物的結果的特性圖。圖10是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸6聚物的結果的特性圖。圖11是顯示對于導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，測定培養(yǎng)基中的乳酸7聚物的結果的特性圖。圖12是顯示使用導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，研究培養(yǎng)基的種類不同造成的乳酸低聚物的生產率的不同的結果的特性圖。 圖13是顯示使用導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號12)的重組大腸桿菌，研究培養(yǎng)時間與乳酸低聚物的生產率的關系的結果的特性圖。
具體實施例方式以下，詳細說明本發(fā)明的重組微生物和使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。本發(fā)明的重組微生物，是將丙酰輔酶A轉移酶基因(pet基因)和規(guī)定的聚羥基烷酸合酶基因導入宿主微生物而成的，并在宿主微生物的外部生產脂肪族聚酷。另外，在本說明書中所謂“脂肪族聚酷”，不僅表示分子量為數(shù)千 數(shù)萬這樣的高分子化合物，還包含単體單元為2 5這樣的(即，ニ聚物 五聚物)低聚物。丙酰輔酶A轉移酶基因在本發(fā)明中，作為丙酰輔酶A轉移酶基因(以下，稱為pet基因)，沒有特別限定，只要是編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因則可使用任何基因。SP，pet基因可以使用編碼具有丙酰輔酶A轉移酶活性的蛋白質的任何基因。所謂丙酰輔酶A轉移酶活性，是指催化將輔酶A轉移至丙酸的反應的活性。即，將催化由適當?shù)妮o酶A底物將輔酶A轉移至丙酸的反應的活性，稱為丙酰輔酶A轉移酶活性。該丙酰輔酶A轉移酶，不僅對丙酸，對于乳酸也可由輔酶A底物轉移輔酶A。表I顯示到目前為止所報告的pet基因的來源(微生物名)的代表例、和公開了編碼它們的堿基序列信息的文獻信息。[表 I]
微生物名文獻信息
丙酸梭菌Eur. J. Biochem., 2002, Vol. 269，pp.372-380埃氏巨型球菌 United States Patent 7186541
金黃色葡萄成菌 Eur. J. Biochem., 2002，Vol. 269, pp.372-380 大腸桿菌Eur. J. Biochem., 2002, Vol. 269, pp.372-380在本發(fā)明中，除了上述表I以外，可利用目前為止報告的pet基因的任ー種。另外，在具有丙酰輔酶A轉移酶活性的范圍內，即使是包含在已知的PCT的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質也可利用。另外，在關于Pct的氨基酸序列使用的用語所謂“數(shù)個”是指I 50個，優(yōu)選I 25個，更優(yōu)選10個以下。丙酰輔酶A轉移酶的催化劑活性可按照例如A. E. Hofmeister等(Eur. J. Biochem.,第206卷，第547-552頁)記載的方法來測定。作為一例，作為pet基因，可舉出源自埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的基因和源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因。序列號I顯示源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號2顯示由該pet基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。另外，序列號3顯示源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的pet基因中的編 碼區(qū)的堿基序列,序列號4顯示由該pet基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。包含這些序列號2或4所示的氨基酸序列的蛋白質，具有丙酰輔酶A轉移酶活性，尤其具有以乳酸作為底物來合成乳酰輔酶A的活性。另外，在本發(fā)明中，作為pet基因，并不限定于具有編碼序列號2或4所示的氨基酸序列的堿基序列的基因，還可以是包含在該氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I或多個氨基酸序列的氨基酸序列、并且具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質。在這里，作為多個氨基酸，表示例如為I 20個、優(yōu)選I 10個、更優(yōu)選I 7個、進ー步優(yōu)選I個 5個、特別優(yōu)選I個 3個。進而，在本發(fā)明中，作為pet基因，還可以是編碼下述蛋白質的基因所述蛋白質具有相對于序列號2或4所示的氨基酸序列具有例如70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列類似性的氨基酸序列，并且具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性。在這里，序列類似性的值，是指使用安裝了 blast算法的計算機程序及存儲了基因序列信息的數(shù)據(jù)庫，通過默認的設定所求得的值。進而，在本發(fā)明中，作為pet基因，還可以是包含對具有序列號I或3所示堿基序列的基因的至少一部分在嚴格的條件下雜交的多核苷酸，并且編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因。在這里，所謂嚴格的條件，是指形成所謂特異性雜種，而不形成非特異性雜種的條件。可舉出例如，在45°C、6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)下雜交，然后在50 65°C、0. 2 1XSSC、0. 1%SDS下洗滌，或者作為這樣的條件，可舉出在65 70°C、1XSSC下雜交，然后在65 70°C、0. 3XSSC下洗滌。雜交可通過J. Sambrooket al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory(1989)所記載的方法等現(xiàn)有公知的方法進行。另外，氨基酸的缺失、置換或添加，是通過以本技術領域中公知的方法來改變編碼上述轉錄因子的堿基序列來進行。為了在堿基序列中導入突變，可通過Kunkel法或Gappedduplex (缺ロ雙鏈體)法等的公知方法或依據(jù)這些公知方法的方法來進行，例如，使用利用了定點誘變法的突變導入用試劑盒(例如Mutant-K或Mutant-G(都是商品名，TAKARABio社制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(商品名，TAKARABio社制)導入突變。另外，作為突變導入方法，可以是使用以EMS(甲磺酸こ酷)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、其他的致癌性化合物為代表的化學誘變劑的方法，也可以是利用以X射線、α射線、β射線、Y射線、離子束所代表的放射線處理和/或紫外線處理的方法。聚羥基烷酸合酶基因在本發(fā)明中，作為聚羥基烷酸合酶基因(也稱為PHA合酶基因)，使用選自源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonasneptunium)的基因、源自類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因的至少ー種以上的基因。特別是作為PHA合酶基因，優(yōu)選使用源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因和/或源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因。另外，所謂PHA合酶基因，是編碼具有以輕酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因。在這里，作為源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因，優(yōu)選使用源自在ATCC以保藏號700651保藏的SK2株的PHA合酶基因。另外，作為源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因,優(yōu)選使用源自在NBRC以保藏號14232保藏的株的PHA合酶基因。作為源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的基因，優(yōu)選使用源自在ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type Culture Collection)以保藏號 BAA-808D保藏的株的PHA合酶基因。作為源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因，優(yōu)選使用源自在NBRC(日本技術評價研究所生物資源中心，NITE Biological ResourceCenter)以保藏號15573保藏的CFN株的PHA合酶基因。作為源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的基因，優(yōu)選使用源自在JCM(日本微生物菌種保藏中心，Japan CollectionofMicroorganisms)以保藏號10015保藏的61_3株的PHA合酶基因。作為源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因，優(yōu)選使用源自在JCM以保藏號8966保藏的株的PHA合酶基因。具體地說，序列號5顯示源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis) (ATCC700651)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號6顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。序列號7顯示源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium) (NBRC 14232)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號8顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。另外，作為源自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) (BAA-808D)的基因，可舉出由保藏號YP354337所特定的PHA合酶基因及由保藏號ΑΒΑ79557所特定的PHA合酶基因。序列號9顯示由保藏號ΥΡ354337所特定的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號10顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。序列號11顯示由保藏號ΑΒΑ79557所特定的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號12顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。序列號13顯示源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli) CFN株的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號14顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。序列號15顯示源自假單胞菌(Pseudomonas sp. )61_3株的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列,序列號16顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。序列號17顯示源自死海鹽盒菌(Haloarculamarismortui) (JCM8966)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號18顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。另外，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，不限定于具有編碼由上述具體的序列號所特定的氨基酸序列的堿基序列的基因，也可以是編碼下述蛋白質的基因，所述蛋白質包含在該氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I或多個氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性。在這里，作為多個氨基酸，是指例如I 20個、優(yōu)選I 10個、更優(yōu)選I 7個、進ー步優(yōu)選I個 5個、特別優(yōu)選I個 3個。進而，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，還可以是編碼下述蛋白質的基因，所述蛋白質具有相對于由上述具體的序列號所特定的氨基酸序列例如具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列類似性的氨基酸序列，并且具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性。在這里，序列類似性的值是指使用安裝了 blast算法的計算機程序及存儲了基因序列信息的數(shù)據(jù)庫，通過默認的設定所求得的值。進而，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，還可以是包含對具有由上述具體的序列號所特定的堿基序列的基因的至少一部分在嚴格的條件下雜交的多核苷酸，并且編碼具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性的蛋白質的基因。另外，所謂嚴格的條件，與“丙酰輔酶A轉移酶基因”欄中所示的條件含義相同。
另外，對于氨基酸的缺失、置換或添加，可應用“丙酰輔酶A轉移酶基因”欄中所示的方法。特別是本發(fā)明的重組微生物是導入了上述的PHA合酶基因的重組微生物，因此可在微生物的體外生產脂肪族聚酯的低聚物、特別是乳酸低聚物。在這里，可制造根據(jù)使用的PHA合酶基因的種類不同而不同的聚合度的低聚物。通過導入了源自泊庫島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因的重組微生物，可制造4聚物及5聚物的脂肪族聚酯的低聚物(例如乳酸低聚物)。另外，通過導入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonasneptunium)的PHA合酶基因的重組微生物,可制造4聚物的脂肪族聚酯的低聚物(例如乳酸低聚物)。宿主微生物在本發(fā)明中，作為宿主微生物，可舉出例如假單胞菌(Pseudomonassp. )61-3株等假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌、真氧產堿桿菌(Ralstoniaeutropha)等青枯雷爾氏屬(Ralstonia)細菌、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)等芽胞桿菌屬(Bacillus)細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬(Escherichia)細菌、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細菌、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母屬(Saccharomyces)酵母、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)等假絲酵母屬(Candida)酵母等。作為宿主微生物，特別優(yōu)選使用大腸桿菌。用于在宿主細胞中導入上述的基因的載體，只要在宿主中可自主復制即可，優(yōu)選質粒DNA、噬菌體DNA的形式。作為用于導入大腸桿菌的載體的例子，可分別舉出PBR322、pUC18、pBLuescriptll等質粒DNA、EMBL3、M13、λ gtll等卩遼菌體DNA等。另外作為用于導入酵母的載體的例子，可舉出YEpl3、YCp50等?？墒褂帽绢I域技術人員已知的基因重組技術將上述基因的兩方或一方插入載體。另外在重組時，優(yōu)選在能調節(jié)轉錄的啟動子的下游連接上述基因。作為啟動子，只要是能在宿主中調節(jié)基因的轉錄的啟動子則可使用任ー種。例如，在使用大腸桿菌作為宿主的情況下，可使用trp啟動子、Lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、T7啟動子等，使用酵母作為宿主的情況下，可使用gaLl啟動子、gaLlO啟動子等。另外，載體中可以根據(jù)需要連接可以在將要導入基因的微生物中利用的終止子序列、增強子序列、剪接信號序列、多聚A添加信號序列、核糖體結合序列(SD序列)、選擇標志物基因等。作為選擇標志物基因的例子，除了氨芐青霉素耐性基因、四環(huán)素耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、氯霉素耐性基因等耐藥性基因以外，可舉出與氨基酸或核酸等營養(yǎng)素的細胞內生物合成相關的基因，或者編碼螢光素酶等的熒光蛋白質的基因等。上述載體可通過本領域技術人員已知的方法導入微生物。作為將載體導入微生物的方法，可舉出例如磷酸鈣法、電穿孔法、原生質體法、醋酸鋰法、接合傳達法、使用鈣離子的方法等。脂肪族聚酯的制造將上述的pet基因及PHA合酶基因導入宿主微生物所得到的重組微生物，用含有碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成蓄積脂肪族聚酯的低聚物，然后，回收脂肪族聚酯的低聚物，由此可制造作為目標的脂肪族聚酯的低聚物。該重組微生物通過糖代謝途徑由糖合成乳酸，通過由pet基因編碼的丙酰輔酶A轉移酶將乳酸轉換為乳酰輔酶A。另外，該重組微生物通過由PHA合酶基因編碼的PHA合酶以乳酰輔酶A作為底物來合成作為構成単元含有乳酸的脂肪族聚酯的低聚物。作為該低聚物，可以是構成單元僅包含乳酸的聚乳酸(均 聚物)，也可以是作為構成単元包含乳酸和除乳酸以外的羥基烷酸的乳酸系共聚物。另外，作為在培養(yǎng)基中生產的低聚物，主要為ニ聚物 五聚物。在這里所謂“主要”，是指培養(yǎng)基所含的脂肪族聚酯成分中的50%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選90%以上為上述低聚物。合成聚乳酸(均聚物)時，在培養(yǎng)基中不添加除乳酸以外的羥基烷酸，或者使宿主微生物中的乳酸以外的羥基烷酸生物合成途徑缺失。另ー方面，在合成作為構成單元包含乳酸和除乳酸以外的羥基烷酸的乳酸系共聚物時，在培養(yǎng)基中可添加除乳酸以外的羥基烷酸即可，另外，也可以對宿主微生物賦予除乳酸以外的羥基烷酸生物合成途徑。特別是本發(fā)明的重組微生物是菌體內不蓄積脂肪族聚酷，而在菌體外部制造脂肪族聚酯的低聚物的重組微生物。因為本發(fā)明的重組微生物在菌體外蓄積脂肪族聚酯，所以不需要為了提高脂肪族聚酯的生產率而提高菌體的增殖效率。因此，本發(fā)明的重組微生物即使使用含有可生長的程度的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，也可以高生產脂肪族聚酯的低聚物。因此，通過利用本發(fā)明的重組微生物，可以低成本實現(xiàn)脂肪族聚酯的低聚物的生產率。與此相對，在菌體內蓄積脂肪族聚酯的重組微生物的情況下，為了提高脂肪族聚酷的生產率，采取通過提高重組微生物的增殖效率來提高菌體量的方針。這種情況下，為了提高重組微生物的增殖效率，必須使用營養(yǎng)價高的培養(yǎng)基，因而成本非常高。另外，在菌體內蓄積脂肪族聚酯的重組微生物的情況下，必須在菌體內蓄積脂肪族聚酯的階段的比較早的時期終止培養(yǎng)。與此相對，本發(fā)明的重組微生物由于在菌體外制造脂肪族聚酯的低聚物，因此可長時間繼續(xù)培養(yǎng)，并可生產脂肪族聚酯的低聚物。特別是本發(fā)明的重組微生物優(yōu)選ー邊繼續(xù)培養(yǎng)，一邊在取出一部分培養(yǎng)基的同時補加補加培養(yǎng)基或培養(yǎng)基成分的一部分的補料分
批培養(yǎng)。另ー方面，培養(yǎng)本發(fā)明的重組微生物而生產脂肪族聚酯的低聚物時，雖沒有特別限定，但優(yōu)選使用含有通常的碳源等的低成本的培養(yǎng)基，例如基主培養(yǎng)基。作為碳源，可舉出例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等碳水化合物。另外，還可以將碳數(shù)4以上的油脂相關物質作為碳源。作為碳數(shù)4以上的油脂相關物質，可舉出玉米油、大豆油、紅花油、向日葵油、橄欖油、椰子油、棕櫚油、菜籽油、魚油、鯨油、豬油或牛油等天然油脂、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸或肉豆蘧酸等脂肪酸或這些脂肪酸的酷、辛醇、月桂醇、油醇或鯨蠟醇等或這些醇的酯等。作為氮源，可舉出例如氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿等。作為無機物，可舉出例如磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化納等。關于培養(yǎng)，通常在振蕩培養(yǎng)等的好氧條件下，在25 37°C的范圍，優(yōu)選在上述pet基因及PHA合酶基因表達之后進行48小時以上。培養(yǎng)中可在培養(yǎng)基中添加卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。在誘導型啟動子的控制下導入上述pet基因及PHA合酶基因任一方或兩方的情況下，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添加誘導由 該啟動子的轉錄的因子，然后進行72小時以上。特別優(yōu)選培養(yǎng)導入了上述的pet基因及PHA合酶基因的重組大腸桿菌，制造乳酸低聚物。通過該方法，即使不在培養(yǎng)基添加乳酸等構成目標聚合物的単體成分，也可制造乳酸低聚物，在制造成本的方面有利。另外，乳酸低聚物等脂肪族聚酯的低聚物的回收可通過本領域技術人員公知的方法進行。例如，可由培養(yǎng)液通過離心分離進行集菌來除去菌體成分，并由除去菌體后的培養(yǎng)基按照規(guī)定方法回收乳酸低聚物等脂肪族聚酯的低聚物?；厥盏娜樗岬途畚锏戎咀寰埘サ牡途畚锏拇_認，可通過通常的方法、例如氣相色譜法和/或核磁共振法等進行。實施例以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術范圍并不限定于以下的實施例。[實施例I]各種的PHA合酶基因的評價在本實施例中，對于各種的PHA合酶基因，評價與源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因同時表達時的乳酸低聚物的生產率。首先制作用于導入源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因的載體PTV118N-M.E PCT0通過常法取得埃氏巨型球菌(M. elsdenii) (ATCC17753)的基因組，通過PCR法取得pet基因。作為用于擴增含有源自埃氏巨型球菌(Melsdenii)的pet基因的DNA 片段的引物，使用 MePCTN :5’ -atgagaaaagtagaaatcattac-3’ (序列號 19)及 MePCTC 5’ -ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’(序列號20)。另外，引物的堿基序列參考專利W002/42418所記載的序列。由基因組的pet基因的擴增在以下的條件下進行。PCR(酶KOD plus) (94°C I分鐘)X 1，(940C O. 5分鐘、50°C O. 5分鐘、72°C 2分鐘)X 30、(94°C 2分鐘)。將擴增片段導入TOPO BluntII載體，進行測序，結果在所報告的序列和堿基序列中有97. 8%的同源，在氨基酸序列中僅I處不同。通過將由上述的PCR得到的源自埃氏巨型球菌(M. elsdenii)的pet基因插入PTV118N載體(タカラバイォ社制)的EcoRl-PstI之間來制作表達質粒pTV118N-M. E PCT0接著，將本例研究的PHA合酶基因一覽不于表2。在表2中，對于編號I的類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)及編號 4 的深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum),發(fā)現(xiàn)了以不同的注冊號登記的多個基因，因而對于這樣的多個基因進行研究。表 權利要求
1.一種脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對宿主微生物導入編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因而成的， 由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酯。
2.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是以2 5聚物為主的低聚物。
3.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酯。
4.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯為聚乳酸。
5.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，將所述重組微生物培養(yǎng)48小時以上，然后回收所述脂肪族聚酯。
7.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是選自源自泊庫島食烷菌的基因、源自海王生絲單胞菌的基因、源自類球紅細菌的基因、源自菜豆根瘤菌的基因、源自假單胞菌的基因以及源自死海鹽盒菌的基因的至少一種以上的基因。
8.根據(jù)權利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是以下的(a) (C)所示的基因 (a)編碼包含序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質的基因， (b)編碼包含在序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質的基因， (c)對具有序列號5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質的基因。
9.一種重組微生物，其是對宿主微生物導入編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因而成的，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是選自源自泊庫島食烷菌的基因、源自海王生絲單胞菌的基因、源自類球紅細菌的基因、源自菜豆根瘤菌的基因、源自假單胞菌的基因及源自死海鹽盒菌的基因的至少一種以上的基因。
10.根據(jù)權利要求9所述的重組微生物，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因，是以下的(a) (C)所示的基因 (a)編碼包含序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質的基因， (b)編碼包含在序列號6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質的基因， (c)對具有序列號5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質的基因。
11.根據(jù)權利要求9所述的重組微生物，其特征在于，所述宿主微生物是大腸桿菌。
全文摘要
在使用重組微生物的脂肪族聚酯的制造中，提高脂肪族聚酯生產率。培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對宿主微生物導入編碼具有將乳酸轉換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質的基因而成的；由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酯。
文檔編號C12P7/62GK102844439SQ20118001580
公開日2012年12月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權日2010年3月25日
發(fā)明者村松正善, 神戶浩美, 伊藤正和, 島村隆, 幸田勝典 申請人:豐田自動車株式會社