一種應(yīng)用角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應(yīng)用角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯的方法，屬于酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以畢赤酵母為宿主菌構(gòu)建一種過量表達角質(zhì)酶的基因工程菌，誘導(dǎo)該菌發(fā)酵產(chǎn)角質(zhì)酶，發(fā)酵液上清中角質(zhì)酶酶活達到420U/mL。本發(fā)明進一步利用該重組酶在有機相、黃酒催陳和白酒固態(tài)發(fā)酵中生產(chǎn)短鏈芳香酯。本方法有酶源制備方法簡單、成本低，酶量大，短鏈芳香酯生產(chǎn)方法簡單、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高、時間短等優(yōu)點，利于工業(yè)化放大生產(chǎn)。
【專利說明】
一種應(yīng)用角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種應(yīng)用角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯的方法，屬于酶工程和發(fā)酵工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 短鏈芳香酯是由短鏈脂肪酸(c2-c1Q)和醇(c2-c6)合成的酯，在自然界香料組成中 占有很大比例，普遍被用于在食品、化妝品、飲料等行業(yè)。如乙酸乙酯被廣泛用于水果香精 和各種香料的生產(chǎn)，其2014年世界總消費水平達到2800kt/a。而丁酸乙酯具有類似鳳梨香 氣，普遍被用于配制各種食用、酒用和煙草香精等。而作為濃香型白酒主要呈香物質(zhì)的己酸 乙酯，其全國產(chǎn)量已超過3000t。又如具有酒香味的乳酸乙酯，其特殊香味能夠改善酒的品 質(zhì)。這些短鏈芳香酯類物質(zhì)不僅在世界食品添加劑中占有重要地位，同時也是國內(nèi)外許多 食品、飲料、化妝品企業(yè)首選的添加劑，其市場需求量必然會隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展呈現(xiàn)穩(wěn)步 的增長趨勢。
[0003] 通常短鏈芳香酯可以通過從植物中提取或者利用化學(xué)催化劑合成。前者得到的是 混合酯類物質(zhì)、濃度低、提取量少，從而使其生產(chǎn)成本比較高，且其含量遠不能滿足人們的 需求;而化學(xué)合成方法則是用強酸或者強堿作為催化劑在高溫高壓下反應(yīng)生成，不僅會有 副產(chǎn)物形成，影響產(chǎn)品純度和質(zhì)量，而且需要后處理工序，由此產(chǎn)生的廢液會對環(huán)境造成污 染，強酸強堿等催化劑的腐蝕性也會加速對生產(chǎn)設(shè)備的損壞。與化學(xué)合成相比，酶催化合成 反應(yīng)具有區(qū)域選擇性和位置專一性、條件溫和、不會造成環(huán)境污染，且產(chǎn)品更易被大眾接 受。這對于提升人們的生活質(zhì)量和環(huán)境保護具有重要意義。因此，利用生物轉(zhuǎn)化法制備芳香 酯將成為必然趨勢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，生物酶法催化合成芳香酯類物質(zhì)的 報道愈來愈多。
[0004] 近年來，越來越多的研究者在酒的加曲配料、發(fā)酵、蒸糧蒸酒/煎酒/壓榨、勾兌、丟 糟再利用和陳化等環(huán)節(jié)中加入不同的酶制劑，以期改善白酒中的風(fēng)味物質(zhì)，尤其是酯類物 質(zhì)的含量，來提高酒的品質(zhì)，得到更多的優(yōu)質(zhì)酒。而大部分脂肪酶一般對長鏈底物的特異選 擇性比較好，且相對較低的穩(wěn)定性阻礙了其在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，白酒酒醅/ 黃酒發(fā)酵過程中，乙醇和酸的濃度會不斷上升，外源添加的酶難以在復(fù)雜的白酒發(fā)酵環(huán)境 中發(fā)揮預(yù)期的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯的方法，是以 核苷酸序列如NCBI Gene ID:KF193402所示的基因編碼的角質(zhì)酶為催化劑，以C2-C1Q短鏈脂 肪酸和C2-C 6醇為底物合成短鏈芳香酯。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述角質(zhì)酶是以發(fā)酵所得粗酶液或者凍干酶粉的形 式添加到反應(yīng)體系中。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，反應(yīng)體系中，以無水異辛烷或正庚烷為溶劑，酸和醇 的摩爾比為1:1.5,加入10-120U/mL的角質(zhì)酶，控制反應(yīng)體系中的初始含水量的質(zhì)量百分比 為0.01-0.1%，于30-70°(：反應(yīng)20-2411。
[0008]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述短鏈芳香酯包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙 酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、丁酸癸酯。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以無水異辛烷或正己烷為溶劑，己酸濃度O.lmol/L， 己酸/乙醇摩爾比1:1.5,凍干角質(zhì)酶粉的用量為40U/mL，控制反應(yīng)體系中的初始含水量的 質(zhì)量百分比為0.04%，于50°C反應(yīng)16h，得到己酸乙酯。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，為了得到所述角質(zhì)酶，構(gòu)建了一株高產(chǎn)所述角質(zhì)酶 的基因工程菌，是將NCBI Gene ID:KF193402所示的基因序列，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(Pichia pastor is )KM71中得到的重組菌。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，為了得到所述角質(zhì)酶，以構(gòu)建的高產(chǎn)所述角質(zhì)酶的 基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶;所述發(fā)酵過程維持溶氧在20-30%，溫度控制在30°C左右，控 制pH 5.0左右，包括分批發(fā)酵階段、補料培養(yǎng)階段、誘導(dǎo)階段;所述分批發(fā)酵階段，是將種子 培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18_19h;所述補料培養(yǎng)階段是當發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加的 甘油耗盡溶氧回升，以指數(shù)流加的方式補加甘油，直到達到OD600為50~150時，停止流加甘 油;所述誘導(dǎo)階段，是待培養(yǎng)基中的甘油被消耗完，流加甲醇誘導(dǎo)角質(zhì)酶表達，將甲醇濃度 維持在體積分數(shù)〇. 5%-2%，誘導(dǎo)120-140h。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基（BSM)組成：CaS〇4.2H20 0.939g/L， MgS〇4 ? 7H20 14.9g/L，K0H 4.138/1，1(23〇418.28/1，甘油30.(^/1，85%113?〇426.7111171，微量 元素液PTMd.SmL/L;微量元素液PTMi的組成：FeS〇4. 7H20 65g/L，KI 0.08g/L，H2S〇45.0g/ L，MnS〇4 ? H20 3g/L，CuS〇4 ? 5H20 6g/L，H3B030.02g/L，Na2Mo〇3 ? 2H20 0.2g/L，CoCl20.5g/ L，ZnCl220g/L。補料階段流加的甘油是含有5mL/L微量元素液PTMi的甘油。誘導(dǎo)階段流加的 甲醇是含有12mL/L微量元素液PTM^甲醇。
[0013] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用角質(zhì)酶黃酒原酒催陳的方法，是 向沙洲優(yōu)黃原酒中添加40U/mL的以核苷酸序列如NCBI Gene ID:KF193402所示的基因編碼 的角質(zhì)酶，于37 °C反應(yīng)24h，加速黃酒原酒中短鏈芳香酯含量的變化。
[0014] 本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述角質(zhì)酶固態(tài)發(fā)酵清香型白 酒的方法，是向發(fā)酵糟醅中添加角質(zhì)酶，然后與發(fā)酵糟醅一同入池發(fā)酵，利用所述角質(zhì)酶合 成短鏈芳香酯。
[0015] 本發(fā)明通過選擇高耐酸性的角質(zhì)酶進行重組表達和發(fā)酵生產(chǎn)，獲得單位酶活 420U/mL的發(fā)酵酶液，彌補了野生菌酶活單位低的缺點，為低成本大量制酶奠定基礎(chǔ)。同時， 本發(fā)明獲得的角質(zhì)酶在酸性pH反應(yīng)條件下具有良好的活性和穩(wěn)定性，在pH 3.5~pH 6.5條 件下保溫168h后殘余酶活大于50%;在30°C下半衰期高達101d，在50%的各種有機溶劑中 (甲醇、異辛烷、乙醇、丁醇、異丙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜)穩(wěn)定性較好，殘留酶活在60%以 上。用該酶進行酯化反應(yīng)生產(chǎn)短鏈芳香酯，具有反應(yīng)方法簡便、不需要提供額外生物能量等 優(yōu)點。在黃酒黃酒原酒催陳中，能夠顯著提高芳香酯的含量。在白酒固態(tài)發(fā)酵中，顯著提高 酒中的總酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量使白酒顯著增香。
【附圖說明】
[0016] 圖1重組酶的SDS-PAGE分析:M:Marker; 1:重組角質(zhì)酶純酶;2:硫酸銨沉淀;3:發(fā)酵 上清液
[0017] 圖2重組酶的最適pH
[0018] 圖3重組酶的pH穩(wěn)定性
[0019] 圖4重組酶的最適溫度
[0020] 圖5重組酶的溫度穩(wěn)定性
[0021 ]圖6重組酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性 [0022]圖7溫度對己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響 [0023]圖8初始含水量對己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響 [0024]圖9凍干角質(zhì)酶用量對己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響 [0025]圖10底物酸濃度對己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響 [0026]圖11酸/醇摩爾比對己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響 [0027]圖12重組酶在有機相中合成短鏈芳香酯
[0028] 圖13黃酒原酒樣品中四大芳香酯的變化規(guī)律
[0029] 圖14角質(zhì)酶對酒中主要酯類物質(zhì)生成的影響
【具體實施方式】
[0030] 以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本 發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上按照常規(guī)的方法、條件進行操 作。
[0031] 實施例l:P.pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA的構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵
[0032] (1)根據(jù)NCBI登錄號：KF193402公布的角質(zhì)酶基因，通過化學(xué)合成得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-ScCuA;經(jīng)SacI內(nèi)切酶線性化后電轉(zhuǎn)入P. pastoris KM71，將轉(zhuǎn)化混合物涂布于MD平 板上，30°C培養(yǎng)2-3d，挑取單菌落點種于YPD/G418平板上，G418濃度篩選梯度依次為Omg/ mL、lmg/mL、1 ? 5mg/mL、2mg/mL，30 °C培養(yǎng)1 -2d;挑取YPD/G418濃度梯度平板上的單克隆于裝 有10mL YH)培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，30°C、200r/min培養(yǎng)20~24h，吸取500yL菌液至甘油 管，保存于_80°C冰箱。
[0033] (2)挑取YPD/G418濃度梯度平板上的單克隆于10mL YPD培養(yǎng)基中，于200r/min恒 溫搖床中30 °C培養(yǎng)20~24h后轉(zhuǎn)接2.5mL上述種子液至50mL BMGY培養(yǎng)基，于200r/min恒溫 搖床中30°C培養(yǎng)20-24h，將全部菌體用25mL BMMY培養(yǎng)基重懸，加入誘導(dǎo)劑甲醇至終濃度為 llg/L，30°C培養(yǎng)進行重組角質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達至角質(zhì)酶酶活達到最高值，定期（24h)向培養(yǎng) 基補加甲醇。在誘導(dǎo)120h后角質(zhì)酶的酶活為28.6U/mL，是以P.pastoris X33為宿主表達該 酶活的7倍。
[0034] (3)酶活測定方法:將30yL適當稀釋的發(fā)酵上清加入到1470yL含50mmol/L pNPB的 1 XMcilvation緩沖液(pH 4.5)中，在340nm處記錄對硝基苯酸的生成速率。酶活單位定義 為在酶活測量體系下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化生成1微摩爾對硝基苯酚的酶量。
[0035] 實施例2:P.pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA的發(fā)酵工藝
[0036] 1、菌株卩.卩881:〇1'18 1(]\171/卩？1〇91(-3(^11八〇
[0037] 2、種子培養(yǎng):取出保藏于-80°C冰箱的甘油管，接種200此菌液于100mL種子培養(yǎng)基 中，于30°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)約24h;種子培養(yǎng)基的組成為:酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、 YNB 13 ? 4g/L，甘油 30g/L，生物素4 X 10-4g/L。
[0038] 3、發(fā)酵接種量10%。
[0039] 4、發(fā)酵培養(yǎng)基（BSM)組成：CaS〇4.2H20 0.939g/L，MgS〇4 ? 7H20 14.9g/L，K0H 4 ? 13g/L，K2S〇4l 8 ? 2g/L，甘油30 ? Og/L，85 % H3P〇426 ? 7mL/L，微量元素液 PTMd ? 3mL/L;微量元 素液PTMi的組成：FeS〇4 *71120 65g/L，KI 0.08g/L，H2S〇45.0g/L，MnS〇4 *1120 3g/L，CuS〇4* 5H20 6g/L，H3B030.02g/L，Na2Mo〇3 ? 2H20 0.2g/L，CoCl2〇.5g/L，ZnCl220g/L;補料生長培養(yǎng) 基(g/L):甘油500(5mL/L PTM〇 ;補料誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甲醇（12mL/L PTMi)。具體發(fā)酵工藝如下：
[0040] 1)分批發(fā)酵階段:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過調(diào)節(jié)攪 拌轉(zhuǎn)速或者通入富氧空氣將溶氧維持在20-30%，溫度控制在30°C，流加質(zhì)量濃度為25 %的 氨水控制pH 5.0左右，培養(yǎng)18-19h;
[0041] 2)補料培養(yǎng)階段：當培養(yǎng)基中初始添加的甘油耗盡待溶氧上升至80-100%。以指 數(shù)流加的方式補加甘油，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速或者通入富氧空氣維持溶氧在20-30%，溫度控 制在30°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH 5.0左右，直到達到預(yù)期的0D6QQ為50~150 時，此時停止流加甘油；
[0042] 3)誘導(dǎo)階段:待饑餓處理l_2h使培養(yǎng)基中的甘油被消耗完，然后添加一定濃度的 甲醇，開始進入角質(zhì)酶誘導(dǎo)表達階段;通過提高攪拌轉(zhuǎn)速或者通入富氧空氣維持溶氧在so-so % ， 溫度控制在 26-30 °C ， 流加質(zhì)量濃度為25 % 的氨水控制pH 5.0左右 ，誘導(dǎo)階段 甲醇濃 度通過FC2002型甲醇監(jiān)測流加控制器自動流加甲醇，將甲醇濃度維持在設(shè)定濃度(體積分 數(shù)0.5%-2%)直到誘導(dǎo)結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后測上清液中的角質(zhì)酶酶活，重組菌的角質(zhì)酶酶活 達到 420U/mL。
[0043]實施例3:重組角質(zhì)酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)
[0044] 將發(fā)酵上清液中加入35 %固體硫酸銨鹽鹽析過夜，4°C，8000rpm離心20min，取沉 淀物用適量pH 7.0的1 X Mci 1 vat ion緩沖液溶解，采用透析膜透析除去殘余硫酸銨，透析樣 品通過〇.4um膜過濾后制成上樣樣品。經(jīng)過DEAE-Sepharose陰離子交換樹脂。純化過程中蛋 白SDS-PAGE電泳圖見圖1。
[0045] 1、重組角質(zhì)酶的純化：
[0046] 純化后重組角質(zhì)酶比活由90.6U/mg提高到149 . lU/mg，純化倍數(shù)1.6倍，回收率 31.1%
[0047] 2、酶學(xué)性質(zhì)包括了重組角質(zhì)酶的最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和在有 機溶劑中的穩(wěn)定性。
[0048] 最適pH及pH穩(wěn)定性：將酶液分別置于50mM pH 2.5-8 ?0(梯度為0.5)的1 X Mcilvation緩沖液中，在相應(yīng)pH條件下于37°C測定酶活，考察酶的最適pH，由圖2可知，該酶 最適pH為4.5;將酶液分別置于3.0-7.0 (梯度為0.5)的1 X Mci 1 vat ion緩沖液中于40 °C保 溫，定時取樣，測量殘留角質(zhì)酶酶活，考察酶的pH穩(wěn)定性，由圖3可知，該酶在pH 3.5~pH 6.5條件下保溫168h后殘余酶活大于50%，在pH 7.0條件下殘余酶活僅剩20%左右，說明該 酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較好。
[0049]最適溫度及熱穩(wěn)定性:分別將酶液置于25°C-80°C(梯度為5.0°C)測定相應(yīng)溫度下 的酶活，以酶活最高為1 〇〇 %，計算相對酶活，以確定酶的最適溫度，由圖4可知，該酶最適溫 度為65°C;雖然角質(zhì)酶的最適溫度為65°C，但是該酶在65°C下非常不穩(wěn)定，保溫5min后酶活 僅剩20 %左右，為研究重組酶的熱穩(wěn)定性，將酶液置于不同的溫度下（45 °C、50 °C、55 °C、60 °C)保溫并定期測定殘余酶活(40°C下的保溫見pH穩(wěn)定性），由圖5可知，重組角質(zhì)酶在40°C 下比較穩(wěn)定，保溫168h后殘留酶活仍可達50 %以上，在45 °C下的半衰期為12h，而50 °C、55°C 和60°C下的半衰期分別僅為156min，15min和11.5min，此外，在30°C下進行溫度穩(wěn)定性研 究，半衰期為l〇ld。
[0050]在有機溶劑中的穩(wěn)定性分析：將純化的角質(zhì)酶（3 0 y g / m L)分別加入由1 X Me i 1 vat ion緩沖液(pH 4.5)配制的終濃度為50 %和80 % (v/v)的各種不同的有機溶劑（甲 醇、異辛烷、乙醇、丁醇、異丙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜）中，于37°C中保溫16h并定期測定殘 余酶活，考察酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性，由圖6可知，重組角質(zhì)酶在50%的各種有機溶劑中 的穩(wěn)定性較好，殘留酶活在60%以上，而在高濃度(80%)的甲醇、乙醇、丁醇和乙腈中穩(wěn)定 性較差，保溫后殘留酶活僅剩15.3%、32.1%、28.7%和10.2%。
[0051 ]實施例4:以凍干角質(zhì)酶粉在有機相制備短鏈芳香酯
[0052]有機試劑和底物酸、醇采用3A型分子篩除水之后用于酯合成。反應(yīng)條件:稱取0.1M 的酸和0.15M的醇于20mL帶塞燒瓶中，量取無水異辛烷或正己烷溶劑10mL，加入10-120U/mL 的凍干角質(zhì)酶，控制反應(yīng)體系中的初始含水量的質(zhì)量百分比在0-1 %，溫度30~70°C反應(yīng) 16h，結(jié)果如圖7-12和表1、2所示。
[0053] 結(jié)果表明：當初始水含量0 ? 04%，己酸濃度0 ? lmol/L，己酸/乙醇摩爾比1:1 ? 5，凍 干角質(zhì)酶用量為401]/1^，50°(：反應(yīng)1611時，己酸乙酯的酯化率達到98.3%;角質(zhì)酶對脂肪酸 鏈長度在C2-Cs和醇鏈長度在C 2-C6的選擇性比較好；角質(zhì)酶對酒中主要芳香酯的最高酯化 率分別為己酸乙酯98.3%、丁酸乙酯95.5%、乙酸乙酯92.8%和乳酸乙酯88.1%。
[0054]表1角質(zhì)酶對脂肪酸鏈長度的選擇性
[0056]表2角質(zhì)酶對醇鏈長度的選擇性
[0058]實施例5:重組角質(zhì)酶在黃酒原酒催陳中的應(yīng)用
[0059]在酒精度為13 %的沙洲優(yōu)黃原酒樣品中加入40U/mL的角質(zhì)酶，置于3 7 °C水浴鍋中 反應(yīng)24h，以未添加角質(zhì)酶的原酒作為對照組。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品煮沸滅酶、離心，保存上 清液，用頂空GC/MS檢測，結(jié)果如圖13。
[0060]添加角質(zhì)酶后，黃酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量變化較明顯， 分別比對照組提高了 20.5%和152%，而丁酸乙酯和己酸乙酯的含量變化相對不明顯，分別 提高 6.7% 和 10.4%。
[0061 ]實施例6:重組角質(zhì)酶在清香型白酒固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用
[0062] 取5只5L PET桶，割去上部錐形開口部分，并編號1#，2#，3#，4#，5#;準確稱取發(fā)酵 成熟糟醅4kg共計20kg，一份直接裝入1#PET桶;其余四份分別加入2%、5%、8%、10%的角 質(zhì)酶（即角質(zhì)酶的酶活分別為81]/11^、201]/11^、321]/11^、401]/11^)攪拌均勻，裝入2#，3#，4#，5# PET桶。將上述裝有發(fā)酵糟醅的5只PET桶用保鮮膜隔封后放入發(fā)酵池（中上部）與發(fā)酵糟醅 一同入池發(fā)酵9天，控制酒醅發(fā)酵過程中的溫度在32-38°C。發(fā)酵結(jié)束后，取出糟醅送化驗 室，對糟醅中的水分、酒精度、淀粉、還原糖、酸度及糟醅蒸餾所得的蒸餾基酒的總酯和芳香 酯進行測定。結(jié)果如表3和圖14所示。
[0063] 結(jié)果:添加不同的角質(zhì)酶對酒醅中的水分和酒精度影響不大，但是隨著角質(zhì)酶用 量的增加，酒醅中的酸度、還原糖和淀粉的含量呈降低趨勢，使用角質(zhì)酶添加量為5%時結(jié) 果最好，還原糖和淀粉的含量分別為對照組的43%和90%，原料利用更充分;添加2%的角 質(zhì)酶進行酒醅發(fā)酵時，酒中的總酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量的變化較明顯，比對照組分 別提高 29.6%、25.3% 和 17.1%。
[0064] 表3不同角質(zhì)酶用量對酒糟中化學(xué)成分變化的影響
[0066]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種合成短鏈芳香酯的方法，其特征在于，是以核苷酸序列如NCBI Gene ID: KF193402所示的基因編碼的角質(zhì)酶為催化劑，以C2-C1Q短鏈脂肪酸和C2-C 6醇為底物合成短 鏈芳香酯。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述角質(zhì)酶是以發(fā)酵所得粗酶液或者凍干 酶粉的形式添加到反應(yīng)體系中。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以無水異辛烷或正庚烷為溶劑，酸和醇的 摩爾比為1:1.5,加入10-120U/mL的角質(zhì)酶，控制反應(yīng)體系中的初始含水量的質(zhì)量百分比為 0.01-0.1%，于30-70°C反應(yīng)20-24h。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述短鏈芳香酯包括乙酸乙酯、丁 酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、丁酸癸酯。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，以無水異辛烷或正己烷為溶劑，己 酸濃度0. lmol/L，己酸/乙醇摩爾比1:1.5，凍干角質(zhì)酶粉的用量為40U/mL，控制反應(yīng)體系中 的初始含水量的質(zhì)量百分比為0.04%，于50°C反應(yīng)16h，得到己酸乙酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，為了得到所述角質(zhì)酶，構(gòu)建了一株 高產(chǎn)所述角質(zhì)酶的基因工程菌，是將NCBI Gene ID:KF193402所示的基因序列，轉(zhuǎn)化到畢赤 酵母(P i ch iapas tor i s) KM71中得到的重組菌，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)角質(zhì)酶。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，以構(gòu)建的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶;所述發(fā) 酵過程維持溶氧在20-30 %，溫度控制在30°C左右，控制pH 5.0左右，包括分批發(fā)酵階段、補 料培養(yǎng)階段、誘導(dǎo)階段;所述分批發(fā)酵階段，是將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-19h;所述補料培養(yǎng)階段是當發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加的甘油耗盡溶氧回升，以指數(shù)流加的方 式補加甘油，直到達到0D6QQ為50~150時，停止流加甘油;所述誘導(dǎo)階段，是待培養(yǎng)基中的甘 油被消耗完，流加甲醇誘導(dǎo)角質(zhì)酶表達，將甲醇濃度維持在體積分數(shù)〇.5%-2%，誘導(dǎo)120-140h〇8. -種應(yīng)用角質(zhì)酶催陳黃酒原酒的方法，其特征在于，是向沙洲優(yōu)黃原酒中添加40U/ mL的以核苷酸序列如NCBI Gene ID:KF193402所示的基因編碼的角質(zhì)酶，于37°C反應(yīng)24h， 加速黃酒原酒中短鏈芳香酯含量的變化。9. 一種應(yīng)用角質(zhì)酶固態(tài)發(fā)酵清香型白酒的方法，其特征在于，是向發(fā)酵糟醅中添加以 核苷酸序列如NCBI Gene ID:KF193402所示的基因編碼的角質(zhì)酶，然后與發(fā)酵糟醅一同入 池發(fā)酵，利用所述角質(zhì)酶合成短鏈芳香酯。10. -種發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的方法，其特征在于，構(gòu)建了一株高產(chǎn)所述角質(zhì)酶的基因工程 菌，是將NCBI Gene ID:KF193402所示的基因序列，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(Pichiapastoris)KM71 中得到的重組菌，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)角質(zhì)酶；以構(gòu)建的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶;所述發(fā)酵過程 維持溶氧在20-30%，溫度控制在30°C左右，控制pH 5.0左右，包括分批發(fā)酵階段、補料培養(yǎng) 階段、誘導(dǎo)階段;所述分批發(fā)酵階段，是將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18_19h;所述 補料培養(yǎng)階段是當發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加的甘油耗盡溶氧回升，以指數(shù)流加的方式補加甘 油，直到達到OD600為50~150時，停止流加甘油;所述誘導(dǎo)階段，是待培養(yǎng)基中的甘油被消耗 完，流加甲醇誘導(dǎo)角質(zhì)酶表達，將甲醇濃度維持在體積分數(shù)0.5%-2%，誘導(dǎo)120-140h。
【文檔編號】C12G3/02GK105821087SQ201610281015
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】吳敬, 宿玲恰, 郭小杰
【申請人】江南大學(xué), 江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所