一種規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其包括發(fā)酵、提取和精制步驟，其中發(fā)酵工藝中使用由冬瓜皮水提取液和西瓜皮水提取液組成的植物提取液，有效提高微生物對底物康百汀的耐藥性和轉(zhuǎn)化能力以及普伐他汀發(fā)酵水平，從而增加普伐他汀產(chǎn)量，在提取和精制步驟中，嚴(yán)格控制溶液的pH值、有機溶劑的種類與用量、萃取時間和溫度以及降溫操作和結(jié)晶時間，保證普伐他汀的收率與純度。本發(fā)明工藝穩(wěn)定，成本低廉，實現(xiàn)了普伐他汀的規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
一種規(guī)?；a(chǎn)普伐他訂的工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 普伐他汀是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，最初用于治療高血脂癥和 家族性高膽固醇，后來適應(yīng)癥不斷擴大，可以減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展，減少冠狀動脈粥樣 硬化病變和臨床心血管事件的發(fā)生。
[0003] 普伐他汀的生產(chǎn)通常由兩步發(fā)酵過程獲得，雖然也有報道或?qū)＠?W0 99/10499、 TO2007/147827、US 6，274，360和EP 1，266，967)描述可用一步發(fā)酵的方法生產(chǎn)獲得普伐他 汀，但由于技術(shù)復(fù)雜及生產(chǎn)效率等原因，普伐他汀的工業(yè)化生產(chǎn)仍以兩步發(fā)酵為主。
[0004] 普伐他汀的兩步發(fā)酵過程為:首先，通過桔青霉(Penicillium citrinum)等微生 物發(fā)酵生產(chǎn)獲得其次級代謝產(chǎn)物康百汀Compactin(又名美伐他汀Mevastatin)，然后，通過 微生物酶的轉(zhuǎn)化作用，將康百汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
[0005] 現(xiàn)有的專利或文獻資料公開的將康百汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀的微生物主要包括以下 幾類：絲狀霉菌（Mortierella maculata，W000/46175)、根毛霉菌（Mucor Rhizopus， US4448979)、諾卡氏菌（Norcardia，US5830695)、馬杜拉放線菌（Actinomadura，W096/ 40863)、鏈霉菌（Streptomyces Carbopilus EP215665)、脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliates，W〇98/45410)和粉白小多抱菌（Micropolyspora roseoalba，CN〇3141475A)等。
[0006] 按照公開的專利，上述的霉菌、絲狀細菌、放線菌和鏈霉菌均可以將康百汀轉(zhuǎn)化成 普伐他汀，然而，由于康百汀對微生物轉(zhuǎn)化菌的毒害作用，使得微生物不能耐受添加到培養(yǎng) 物中的甚至是低濃度的康百汀，現(xiàn)有技術(shù)下微生物轉(zhuǎn)化菌對底物康百汀的耐受濃度為 0.01-0.05%。李周靈等(1098/45410)獲得的脫葉鏈霉菌￥1-118表現(xiàn)了較高(0.1-0.5%)的 底物抗性，Metkinen(Metkinen News March 2000，Metkinen Oy，F(xiàn)inland;reviewed by Manzoni and Rollini，2002，Appl Microbiol Biotechnol 58:555-564)也獲得了對3g/L 康百汀具有抗性的Streptomyces突變菌株，但其普伐他汀產(chǎn)率不高。W096/40863公開了馬 杜拉放線菌(Actinomadura)ATCC 55678轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的方法，中國專利CN 102757986B公開了以馬杜拉放線菌為轉(zhuǎn)化菌，在發(fā)酵過程中使用微量元素溶液以提高普伐 他汀的產(chǎn)量的方法，同時其也研究了發(fā)酵培養(yǎng)過程分別控制菌體增殖培養(yǎng)溫度和康百汀轉(zhuǎn) 化溫度對普伐他汀產(chǎn)量提高的有益作用，通過該工藝，康百汀的轉(zhuǎn)化率達70%以上，普伐他 汀發(fā)酵生產(chǎn)水平達18g/L以上，然而，該微量元素溶液的配方復(fù)雜，配制過程繁瑣，容易引起 操作失誤，并且原料成本較高，限制了普伐他汀的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
[0007] 同時，利用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝結(jié)束后需要對發(fā)酵 液進行提取和精制才能得到最終產(chǎn)物，然而從發(fā)酵液中提取、精制普伐他汀過程中所用的 有機溶劑、操作溫度和時間等均會對產(chǎn)物的收率和品質(zhì)產(chǎn)生影響，而現(xiàn)有技術(shù)中又沒有一 套完整的普伐他汀生產(chǎn)工藝。綜上，有必要研發(fā)一種有效提高微生物對底物康百汀的耐藥 性和轉(zhuǎn)化能力以及普伐他汀發(fā)酵水平，降低普伐他汀生產(chǎn)成本、增加普伐他汀產(chǎn)量的可規(guī) ?；a(chǎn)普伐他汀的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工 藝，其有效提高微生物對底物康百汀的耐藥性和轉(zhuǎn)化能力以及普伐他汀發(fā)酵水平，降低了 普伐他汀生產(chǎn)成本，增加了普伐他汀產(chǎn)量，且工藝穩(wěn)定，可大規(guī)?；a(chǎn)。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] -種規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，包括以下步驟： _] S1、發(fā)酵：
[0012] A1.種子培養(yǎng):按照如下配方配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖24~26g/L、酵母提取物20~ 22g/L、大豆蛋白胨6~8g/L、K2HP〇4 ? 3H20 1 ~2g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.5~lg/L和消沫劑l.Og/ L，調(diào)節(jié)pH7.0~7.2;向種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在33~35°C下培養(yǎng)48~72 小時，得到種子液；
[0013] A2.發(fā)酵培養(yǎng):按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖56~60g/L、酵母提取物20~ 24g/L、大豆蛋白胨6~8g/L、K2HP〇4 ? 3H20 1 ~2g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.5~lg/L、（NH4)2S0U~ 2g/L、植物提取液4~8ml/L和消沫劑1.Og/L，調(diào)節(jié)pH7.0~7.2;向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種A1得到 的種子液，接種后先在33~35°C下增殖培養(yǎng)30~40小時，然后加入康百汀溶液，在33~35°C 下培養(yǎng)72~156小時，培養(yǎng)過程控制康百汀在發(fā)酵液中的濃度為0.7~0.9g/L，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié) 束后得到發(fā)酵液；
[0014] S2、提?。?br>[0015] B1.調(diào)節(jié)S1所得發(fā)酵液的pH至2~5,加入硅藻土后過濾，收集濾餅，往濾餅中加入 濾餅重量6~10倍量的有機溶劑一，在90~120 °C下萃取3~5h，萃取結(jié)束過濾，得到濾液，濾 液在40~80 °C下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1 /6~1 /3，得到濃縮液；
[0016] B2.往B1得到的濃縮液中加入活性炭，攪拌1~2h，過濾并洗滌，濾液在40~80 °C下 真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/6~1/3,得到濃縮液；
[0017] B3.將B2得到的濃縮液降溫至5~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶 體在60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到粗品；
[0018] B4.往B3得到的粗品加入粗品重量6~8倍量的有機溶劑二，升溫溶解，溶解液降溫 至5~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到中間體；
[0019] S3、精制：
[0020] 往S2得到的中間體加入中間體重量4~8倍量的有機溶劑三，升溫溶解，然后調(diào)節(jié) 溶解液pH至9~11，溶解液降溫至5~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在 60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到普伐他汀。
[0021] 進一步的，所述植物提取液為冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的組合物，所述冬瓜 皮提取液和西瓜皮提取液的體積比為(3~5): 1。
[0022] 再進一步的，所述冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的體積比為4:1。
[0023] 再進一步的，所述冬瓜皮提取液的制備方法如下:取冬瓜皮，加入其重量4~6倍量 的水，浸泡lh，然后加熱，回流提取0.5~lh，提取液使用8層紗布過濾，得到冬瓜皮提取液。
[0024]再進一步的，所述西瓜皮提取液的制備方法如下:取西瓜皮，加入其重量4~6倍量 的水，浸泡lh，然后加熱，回流提取0.5~lh，提取液使用8層紗布過濾，得到西瓜皮提取液。 [0025]進一步的，所述有機溶劑一為甲苯、乙酸乙酯或乙酸丁酯。
[0026]進一步的，所述有機溶劑二為甲醇、乙醇或丁醇。
[0027]進一步的，所述有機溶劑三為甲醇、乙醇或丁醇和水的混合液，其中水占混合液重 量的3~10%。
[0028] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述冬瓜皮為萌蘆科植物冬瓜的干燥外層果皮，所述西 瓜皮是萌蘆科植物西瓜的干燥外層果皮。由于冬瓜皮和西瓜皮不能直接食用，所以一般會 被人們?nèi)訔?，然而冬瓜皮和西瓜皮中含有豐富的糖類，還有鈉、鉀、鈣、鐵、錳、鋅等無機元 素，能為菌類的生長提供養(yǎng)分，但是冬瓜皮和西瓜皮的提取物中也含有一些抑制菌類生長 的物質(zhì)，而發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)冬瓜皮水提取液和西瓜皮水提取液組成的植物提取液對馬杜 拉放線菌有很好的促生長作用，既能夠提高馬杜拉放線菌對康百汀的耐藥性，使康百汀在 發(fā)酵液中的濃度可達到〇. 7~0.9g/L，比現(xiàn)有技術(shù)提高約0.2g/L;同時提高馬杜拉放線菌對 康百汀的轉(zhuǎn)化能力和普伐他汀的發(fā)酵水平，從而提高普伐他汀的產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，檢 測普伐他汀含量和康百汀的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)康百汀的轉(zhuǎn)化率達70%以上，普伐他汀發(fā)酵生 產(chǎn)水平達17g/L以上。在提取和精制步驟中，本發(fā)明嚴(yán)格控制溶液的pH值、有機溶劑的種類 與用量、萃取時間和溫度以及降溫操作和結(jié)晶時間，保證普伐他汀的收率與純度。
[0029] 因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0030] (1)本發(fā)明提供了一套完整的規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，從普伐他汀的發(fā)酵到 提取，再到精制，詳細公開了每一步驟的具體操作和參數(shù)，工藝穩(wěn)定，成本低廉，顯著提高康 百汀的轉(zhuǎn)化率和普伐他汀的發(fā)酵水平，從而大幅度提高普伐他汀生產(chǎn)效率及其產(chǎn)量，實現(xiàn) 了普伐他汀的規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)。
[0031] (2)本發(fā)明規(guī)模化生產(chǎn)普伐他汀的工藝中采用由冬瓜皮水提取液和西瓜皮水提取 液組成的植物提取液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，有效提高了馬杜拉放線菌對康百汀的耐藥性 和轉(zhuǎn)化能力以及普伐他汀的發(fā)酵水平，提高生產(chǎn)效率;所述植物提取液以廢棄的冬瓜皮和 西瓜皮為原料，實現(xiàn)了資源再利用。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任 何限定。
[0033] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或生產(chǎn)廠商推薦的 條件進行。
[0034]本發(fā)明的馬杜拉放線菌(Actinomadura)采用任何一種現(xiàn)有公開文獻中，可將康百 汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀的馬杜拉放線菌屬的菌種，均可實現(xiàn)本發(fā)明。
[0035]下述實施例中的馬杜拉放線菌(Actinomadura)采用美國典型微生物菌種保藏中 心保藏號為ATCC55678(W096/40863)的菌種。
[0036]本發(fā)明的下述實施例中，普伐他汀和康百汀含量按照韓明活等.《HPLC法測定普伐 他汀生產(chǎn)樣品中相關(guān)組分的含量》.今日藥學(xué).2010，20( 7)的方法進行檢測。
[0037]本發(fā)明的實施例中，康百汀的轉(zhuǎn)化率以下述公式進行計算：
[0038] 轉(zhuǎn)化率=普伐他汀獲得量+康百汀使用量X 100% (普伐他汀獲得量是指發(fā)酵結(jié) 束后獲得的普伐他汀的量）。
[0039] 本發(fā)明的實施例中，普伐他汀的收率以下述公式進行計算：
[0040] 收率=普伐他汀產(chǎn)量+普伐他汀獲得量X100% (普伐他汀產(chǎn)量是指精制結(jié)束后 得到的普伐他汀的量）。
[0041 ]實施例1、本發(fā)明規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝 [0042] 具體步驟如下：
[0043] S1、發(fā)酵：
[0044] A1.種子培養(yǎng)：使用5L搖瓶配制3L種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的配方如下：葡萄糖 24g/L、酵母提取物22g/L、大豆蛋白胨6g/L、K2HP〇4 ? 3H20 2g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.5g/L和消沫 劑1.0g/L，調(diào)節(jié)pH7.0;向種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在33~35°C下?lián)u床培養(yǎng) 48小時，得到種子液；
[0045] A2.發(fā)酵培養(yǎng)：以50L全自動發(fā)酵罐配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下： 葡萄糖56g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨6g/L、K 2HP〇4 ? 3H20 lg/L、MgS〇4 ? 7H201g/L、 (NH4)2S〇4lg/L、植物提取液4ml/L和消沫劑1.Og/L，調(diào)節(jié)pH7.0;向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種A1得到 的種子液2.5L，接種后先在33~35 °C下增殖培養(yǎng)40小時，然后加入康百汀溶液，以HPLC法檢 測康百汀濃度使其維持在0.7~0.9g/L，在33~35°C下培養(yǎng)145小時后停止補加康百汀溶 液，培養(yǎng)至153h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到發(fā)酵液;檢測普伐他汀和康百汀的含量分 別為17752mg/L和llmg/L，共加入康百汀738.4g，轉(zhuǎn)化率為72.1%。
[0046] S2、提?。?br>[0047] B1.調(diào)節(jié)S1所得發(fā)酵液的pH至2,加入6% (kg/L)硅藻土后過濾，收集濾餅，往濾餅 中加入濾餅重量10倍量的有機溶劑一，在90 °C下萃取5h，萃取結(jié)束過濾，得到濾液，濾液在 80°C下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/3,得到濃縮液；
[0048] B2.往B1得到的濃縮液中加入2 % (kg/L)活性炭，攪拌lh，過濾并洗滌，濾液在80 °C 下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/3,得到濃縮液；
[0049] B3.將B2得到的濃縮液降溫至5°C，并保溫結(jié)晶6h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~ 70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到粗品；
[0050] B4.往B3得到的粗品加入粗品重量8倍量的有機溶劑二，升溫溶解，溶解液降溫至5 °C，并保溫結(jié)晶6h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到中間 體；
[0051] S3、精制：
[0052]往S2得到的中間體加入中間體重量4倍量的有機溶劑三，升溫溶解，然后調(diào)節(jié)溶解 液pH至9,溶解液降溫至5°C，并保溫結(jié)晶6h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至 干燥失重< 1 %，得到普伐他汀421.8g。
[0053]其中，所述植物提取液為冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的組合物，所述冬瓜皮提 取液和西瓜皮提取液的體積比為3:1。
[0054]所述冬瓜皮提取液的制備方法如下：取冬瓜皮，加入其重量4倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取0.5h，提取液使用8層紗布過濾，得到冬瓜皮提取液。
[0055]所述西瓜皮提取液的制備方法如下:取西瓜皮，加入其重量4倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取0.5h，提取液使用8層紗布過濾，得到西瓜皮提取液。
[0056]所述有機溶劑一為乙酸乙酯。
[0057]所述有機溶劑二為乙醇。
[0058]所述有機溶劑三為乙醇和水的混合液，其中水占混合液重量的5%。
[0059] 實施例2、本發(fā)明規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝
[0060] 具體步驟如下： _] S1、發(fā)酵：
[0062] A1.種子培養(yǎng)：使用5L搖瓶配制3L種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的配方如下：葡萄糖 26g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨8g/L、K2HP〇4 ? 3H20 lg/L、MgS〇4 ? 7H20 lg/L和消沫劑 1.0g/L，調(diào)節(jié)pH7.2;向種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在33~35°C下?lián)u床培養(yǎng)72 小時，得到種子液；
[0063] A2.發(fā)酵培養(yǎng)：以50L全自動發(fā)酵罐配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下： 葡萄糖60g/L、酵母提取物24g/L、大豆蛋白胨8g/L、K2HP〇4 ? 3H20 2g/L、MgS〇4 ? 7H200.5g/L、 (NH4)2S〇42g/L、植物提取液8ml/L和消沫劑1.Og/L，調(diào)節(jié)pH7.2;向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種A1得到 的種子液2.5L，接種后先在33~35 °C下增殖培養(yǎng)30小時，然后加入康百汀溶液，以HPLC法檢 測康百汀濃度使其維持在0.7~0.9g/L，在33~35°C下培養(yǎng)156小時后停止補加康百汀溶 液，培養(yǎng)至161h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到發(fā)酵液;檢測普伐他汀和康百汀的含量分 別為17483mg/L和13mg/L，共加入康百汀715 ? 5g，轉(zhuǎn)化率為73 ? 3%。
[0064] S2、提?。?br>[0065] B1.調(diào)節(jié)S1所得發(fā)酵液的pH至5,加入6% (kg/L)硅藻土后過濾，收集濾餅，往濾餅 中加入濾餅重量6倍量的有機溶劑一，在120°C下萃取3h，萃取結(jié)束過濾，得到濾液，濾液在 40 °C下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/6,得到濃縮液；
[0066] B2.往B1得到的濃縮液中加入2 % (kg/L)活性炭，攪拌2h，過濾并洗滌，濾液在40 °C 下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/6,得到濃縮液；
[0067] B3.將B2得到的濃縮液降溫至10°C，并保溫結(jié)晶10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60 ~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到粗品；
[0068] B4.往B3得到的粗品加入粗品重量6倍量的有機溶劑二，升溫溶解，溶解液降溫至 10°C，并保溫結(jié)晶10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至干燥失重<1%，得到 中間體；
[0069] S3、精制：
[0070] 往S2得到的中間體加入中間體重量8倍量的有機溶劑三，升溫溶解，然后調(diào)節(jié)溶解 液pH至11，溶解液降溫至10°C，并保溫結(jié)晶10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥 至干燥失重< 1 %，得到普伐他汀409. lg。
[0071] 其中，所述植物提取液為冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的組合物，所述冬瓜皮提 取液和西瓜皮提取液的體積比為5:1。
[0072] 所述冬瓜皮提取液的制備方法如下:取冬瓜皮，加入其重量6倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取〇. 5h，提取液使用8層紗布過濾，得到冬瓜皮提取液。
[0073] 所述西瓜皮提取液的制備方法如下:取西瓜皮，加入其重量6倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取〇. 5h，提取液使用8層紗布過濾，得到西瓜皮提取液。
[0074]所述有機溶劑一為乙酸丁酯。
[0075]所述有機溶劑二為丁醇。
[0076]所述有機溶劑三為丁醇和水的混合液，其中水占混合液重量的6%。
[0077]實施例3、本發(fā)明規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝 [0078] 具體步驟如下：
[0079] S1、發(fā)酵：
[0080] A1.種子培養(yǎng)：使用5L搖瓶配制3L種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的配方如下：葡萄糖 25g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨7g/L、K2HP〇4 ? 3H20 lg/L、MgS〇4 ? 7H20 0.5g/L和消沫 劑1.0g/L，調(diào)節(jié)pH7.0;向種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在33~35°C下?lián)u床培養(yǎng) 72小時，得到種子液；
[0081 ] A2.發(fā)酵培養(yǎng)：以50L全自動發(fā)酵罐配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下： 葡萄糖58g/L、酵母提取物22g/L、大豆蛋白胨7g/L、K2HP〇4 ? 3H20 lg/L、MgS〇4 ? 7H200.5g/L、 (NH4)2S〇4lg/L、植物提取液6ml/L和消沫劑1.Og/L，調(diào)節(jié)pH7.0;向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種A1得到 的種子液2.5L，接種后先在33~35 °C下增殖培養(yǎng)40小時，然后加入康百汀溶液，以HPLC法檢 測康百汀濃度使其維持在0.7~0.9g/L，在33~35°C下培養(yǎng)124小時后停止補加康百汀溶 液，培養(yǎng)至130h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到發(fā)酵液;檢測普伐他汀和康百汀的含量分 別為18659mg/L和10mg/L，共加入康百汀730.5g，轉(zhuǎn)化率為76.6%。
[0082] S2、提取：
[0083] B1.調(diào)節(jié)S1所得發(fā)酵液的pH至3,加入6% (kg/L)硅藻土后過濾，收集濾餅，往濾餅 中加入濾餅重量8倍量的有機溶劑一，在100 °C下萃取4h，萃取結(jié)束過濾，得到濾液，濾液在 60°C下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/3,得到濃縮液；
[0084] B2.往B1得到的濃縮液中加入2 % (kg/L)活性炭，攪拌2h，過濾并洗滌，濾液在60 °C 下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1/3,得到濃縮液；
[0085] B3.將B2得到的濃縮液降溫至5°C，并保溫結(jié)晶8h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~ 70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到粗品；
[0086] B4.往B3得到的粗品加入粗品重量7倍量的有機溶劑二，升溫溶解，溶解液降溫至5 °C，并保溫結(jié)晶8h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到中間 體；
[0087] S3、精制：
[0088] 往S2得到的中間體加入中間體重量6倍量的有機溶劑三，升溫溶解，然后調(diào)節(jié)溶解 液pH至10,溶解液降溫至5°C，并保溫結(jié)晶8h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至 干燥失重< 1 %，得到普伐他汀468.2g。
[0089] 其中，所述植物提取液為冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的組合物，所述冬瓜皮提 取液和西瓜皮提取液的體積比為4:1。
[0090] 所述冬瓜皮提取液的制備方法如下:取冬瓜皮，加入其重量5倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取lh，提取液使用8層紗布過濾，得到冬瓜皮提取液。
[0091] 所述西瓜皮提取液的制備方法如下:取西瓜皮，加入其重量5倍量的水，浸泡lh，然 后加熱，回流提取lh，提取液使用8層紗布過濾，得到西瓜皮提取液。
[0092]所述有機溶劑一為乙酸乙酯。
[0093]所述有機溶劑二為乙醇。
[0094]所述有機溶劑三為乙醇和水的混合液，其中水占混合液重量的6%。
[0095] 對比例一
[0096] 在步驟S1發(fā)酵中，與實施例3相比，本對比例的不同在于:使用冬瓜皮提取液替代 植物提取液，用量不變;冬瓜皮提取液的制備以及其他操作和參數(shù)同實施例3步驟S1。結(jié)束 發(fā)酵后檢測普伐他汀和康百汀的含量分別為12273mg/L和18mg/L，共加入康百汀566.4g，轉(zhuǎn) 化率為65.0%。
[0097] 對比例二
[0098] 在步驟S1發(fā)酵中，與實施例3相比，本對比例的不同在于:使用西瓜皮提取液替代 植物提取液，用量不變;西瓜皮提取液的制備以及其他操作和參數(shù)同實施例3步驟S1。結(jié)束 發(fā)酵后檢測普伐他汀和康百汀的含量分別為l〇638mg/L和25mg/L，共加入康百汀520.2g，轉(zhuǎn) 化率為61.3%。
[0099] 對比例三
[0100] 在步驟S1發(fā)酵中，與實施例3相比，本對比例的不同在于:冬瓜皮提取液和西瓜皮 提取液的體積比為1:1，其他操作和參數(shù)同實施例3步驟S1。結(jié)束發(fā)酵后檢測普伐他汀和康 百汀的含量分別為13576mg/L和22mg/L，共加入康百汀609.9g，轉(zhuǎn)化率為66.8%。
[0101] 對比例四
[0102] 在步驟S1發(fā)酵中，與實施例3相比，本對比例不添加植物提取液，其他操作和參數(shù) 同實施例3步驟S1。結(jié)束發(fā)酵后檢測普伐他汀和康百汀的含量分別為10175mg/L和26g/L，共 加入康百汀504.8g，轉(zhuǎn)化率為60.5%。
[0103]將實施例1~3、對比例一~三的數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果如表1所示。
[0104]表1各實施-對比例的數(shù)據(jù)對比
[0107] 由表1可知：
[0108] (1)與現(xiàn)有技術(shù)(對比例四）相比，本發(fā)明實施例1~3規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加植物提取液，其發(fā)酵水平提高了約8g/L，轉(zhuǎn)化率提高了至少12%，由此 說明本發(fā)明的植物提取液可提高馬杜拉放線菌對康百汀的轉(zhuǎn)化能力和普伐他汀的發(fā)酵水 平，從而大幅度提高普伐他汀生產(chǎn)效率及其產(chǎn)量。
[0109] (2)與現(xiàn)有技術(shù)(對比例四）相比，對比例一僅使用冬瓜皮提取液，其發(fā)酵水平提高 約2g/L，轉(zhuǎn)化率提高5%，說明冬瓜皮提取液對提高康百汀的轉(zhuǎn)化率和普伐他汀的發(fā)酵水平 有一定促進作用;對比例二僅使用西瓜皮提取液，其發(fā)酵水平和轉(zhuǎn)化率與現(xiàn)有技術(shù)相接近， 說明西瓜皮提取液對康百汀的轉(zhuǎn)化和普伐他汀的發(fā)酵沒有影響。
[0110] (3)與實施例3相比，對比例一僅使用冬瓜皮提取液，對比例二僅使用西瓜皮提取 液，對比例三冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的體積比為1:1，其發(fā)酵水平和轉(zhuǎn)化率均有較明 顯的下降，說明本發(fā)明所述冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液之間存在相互作用。
[0111] (4)本發(fā)明實施例1~3普伐他汀的收率較高，約80%，說明本發(fā)明工藝中的提取和 精制操作可有效提取發(fā)酵液中的產(chǎn)物，同時減少制備過程的損失，并且保證產(chǎn)物的品質(zhì)。
[0112] 本發(fā)明實施例中以實施例3的發(fā)酵水平和轉(zhuǎn)化率最高，收率最大，因此實施例3為 本發(fā)明規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝的最佳實施例。
[0113]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 一種規(guī)模化生產(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，包括以下步驟： 51、 發(fā)酵： A1.種子培養(yǎng):按照如下配方配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖24~26g/L、酵母提取物20~22g/ L、大豆蛋白胨6~8g/L、K2HP〇4 · 3H20 1 ~2g/L、MgS〇4 · 7H20 0.5~lg/L和消沫劑 1.0g/L，調(diào) 節(jié)pH7.0~7.2;向種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在33~35°C下培養(yǎng)48~72小時， 得到種子液； A2.發(fā)酵培養(yǎng):按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖56~60g/L、酵母提取物20~24g/ L、大豆蛋白胨6~8g/L、K2HP〇4.3H2〇 1 ~2g/L、MgS〇4.7H20 0.5~lg/L、（NH4)2S〇4 1 ~2g/ L、植物提取液4~8ml/L和消沫劑1. Og/L，調(diào)節(jié)pH7.0~7.2;向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種A1得到的 種子液，接種后先在33~35 °C下增殖培養(yǎng)30~40小時，然后加入康百汀溶液，在33~35 °C下 培養(yǎng)72~156小時，培養(yǎng)過程控制康百汀在發(fā)酵液中的濃度為0.7~0.9g/L，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束 后得到發(fā)酵液； 52、 提?。? B1.調(diào)節(jié)S1所得發(fā)酵液的pH至2~5,加入硅藻土后過濾，收集濾餅，往濾餅中加入濾餅 重量6~10倍量的有機溶劑一，在90~120 °C下萃取3~5h，萃取結(jié)束過濾，得到濾液，濾液在 40~80 °C下真空濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1 /6~1 /3，得到濃縮液； B2.往B1得到的濃縮液中加入活性炭，攪拌1~2h，過濾并洗滌，濾液在40~80 °C下真空 濃縮至濃縮液的體積為濾液體積的1 /6~1 /3，得到濃縮液； B3.將B2得到的濃縮液降溫至5~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在 60~70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到粗品； B4.往B3得到的粗品加入粗品重量6~8倍量的有機溶劑二，升溫溶解，溶解液降溫至5 ~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~70°C下干燥至干燥失重<1%， 得到中間體； 53、 精制： 往S2得到的中間體加入中間體重量4~8倍量的有機溶劑三，升溫溶解，然后調(diào)節(jié)溶解 液pH至9~11，溶解液降溫至5~10°C，并保溫結(jié)晶6~10h，過濾得到濕晶體，濕晶體在60~ 70°C下干燥至干燥失重< 1 %，得到普伐他汀。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述植物提取液為冬 瓜皮提取液和西瓜皮提取液的組合物，所述冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的體積比為(3~ 5)：1〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述冬瓜皮提取液和 西瓜皮提取液的體積比為4:1。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述冬瓜皮提取液的 制備方法如下:取冬瓜皮，加入其重量4~6倍量的水，浸泡lh，然后加熱，回流提取0.5~lh， 提取液使用8層紗布過濾，得到冬瓜皮提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述西瓜皮提取液的 制備方法如下:取西瓜皮，加入其重量4~6倍量的水，浸泡lh，然后加熱，回流提取0.5~lh， 提取液使用8層紗布過濾，得到西瓜皮提取液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述有機溶劑一為甲 苯、乙酸乙酯或乙酸丁酯。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述有機溶劑二為甲 醇、乙醇或丁醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)?；a(chǎn)普伐他汀的工藝，其特征在于，所述有機溶劑三為甲 醇、乙醇或丁醇和水的混合液，其中水占混合液重量的3~10%。
【文檔編號】C07C67/48GK105821086SQ201610293539
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】徐會根, 羅定軍, 黃智勇, 陳繼敏, 李耀榮, 熊志, 葉家雄
【申請人】廣東藍寶制藥有限公司