專利名稱：供植物中基因靶向用的工程化降落場(chǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及用于生成轉(zhuǎn)基因生物體，例如植物的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法容許將工程化降落場(chǎng)(engineered landing pad，ELP)摻入基因組位點(diǎn)中，由此便于將其它感興趣的核酸分子導(dǎo)入含有ー個(gè)或多個(gè)ELP的限定基因組位點(diǎn)中。在一些實(shí)施方案中，ELP可以包含含有在鋅指核酸酶(ZFN)結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼的基本上隨機(jī)的序列的核苷酸序列區(qū)。發(fā)明背景 許多植物用來自其它物種的基因遺傳轉(zhuǎn)化以導(dǎo)入期望的性狀，諸如以經(jīng)由例如改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值質(zhì)量、提高產(chǎn)量、賦予有害物或疾病抗性、提高干旱和應(yīng)激耐受性、改善園藝質(zhì)量諸如色素沉著和生長(zhǎng)、和/或賦予除草劑抗性；實(shí)現(xiàn)自植物生成エ業(yè)上有用的化合物和/或材料；和/或?qū)崿F(xiàn)藥物的生成來改善農(nóng)業(yè)價(jià)值?？寺』?qū)χ参锛?xì)胞的導(dǎo)入和穩(wěn)定的能育轉(zhuǎn)基因植物的回收可以用于進(jìn)行植物的此類修飾，并且已經(jīng)容許植物的遺傳工程(例如用于作物改良)。在這些方法中，通常將外來DNA隨機(jī)導(dǎo)入真核植物細(xì)胞的核或質(zhì)體DNA中，接著分離含有整合入細(xì)胞的DNA中的外來DNA的細(xì)胞，以生成經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。第一代轉(zhuǎn)基因植物通常通過土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)生成。用這些技術(shù)獲得的成功激勵(lì)開發(fā)將感興趣的核酸分子導(dǎo)入植物基因組中的其它方法，諸如原生質(zhì)體中PEG介導(dǎo)的DNA攝取、微粒轟擊、和娃須晶(whisker)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。然而，在所有這些植物轉(zhuǎn)化方法中，摻入植物基因組中的轉(zhuǎn)基因以隨機(jī)方式且以不可預(yù)測(cè)的拷貝數(shù)整合。通常，轉(zhuǎn)基因可以以整個(gè)轉(zhuǎn)基因或其部分的重復(fù)形式整合。此類復(fù)雜的整合樣式可以影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平(例如，通過經(jīng)由轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制破壞轉(zhuǎn)錄的RNA，或者通過誘導(dǎo)對(duì)導(dǎo)入DNA的甲基化實(shí)現(xiàn))，由此下調(diào)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。還有，整合位點(diǎn)本身可以影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。這些因素的組合導(dǎo)致感興趣的轉(zhuǎn)基因或外來DNA在不同轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物系間的表達(dá)水平的廣泛變化。此外，感興趣的外來DNA的整合可以對(duì)基因組中發(fā)生整合的區(qū)域具有破壞性影響，而且可以影響或擾亂所述靶區(qū)域的正常功能，由此經(jīng)常導(dǎo)致不想要的副作用。以上需要無論何時(shí)調(diào)查將特定外來DNA導(dǎo)入植物中的影響，生成并分析大量轉(zhuǎn)基因植物系以獲得顯著的結(jié)果。同樣地，在轉(zhuǎn)基因作物植物的世代中，在植物中導(dǎo)入感興趣的特定DNA以提供具有期望表型的轉(zhuǎn)基因植物的情況中，創(chuàng)建獨(dú)立創(chuàng)建的轉(zhuǎn)基因植物系的大群體以容許選擇具有最佳轉(zhuǎn)基因表達(dá)，且對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的總體表型具有最小或無副作用的那些植物系。特別在此領(lǐng)域中，例如鑒于繁瑣的管理要求和與消除不想要的轉(zhuǎn)基因事件需要的重復(fù)田間試驗(yàn)有關(guān)的高成本，更定向的轉(zhuǎn)基因方法是期望的。此外，會(huì)清楚的是，靶向性DNA插入的可能性在轉(zhuǎn)基因疊加過程中也會(huì)是有益的。
已經(jīng)開發(fā)出幾種方法以控制植物中的轉(zhuǎn)基因插入。見例如Kumar和Fladung(2001)Trends Plant Sci.6:155_9。這些方法依賴于基于同源重組的轉(zhuǎn)基因整合。此策略已經(jīng)在原核生物和低等真核生物中成功應(yīng)用。Paszkowski等(1988)EMBOJ. 7:4021-6。然而，對(duì)于植物，直到最近，轉(zhuǎn)基因整合的主要機(jī)制基于非常規(guī)重組，其牽涉重組DNA鏈間很少的同源性。因此，此領(lǐng)域中的主要挑戰(zhàn)是檢測(cè)罕見的同源重組事件，其被經(jīng)由非常規(guī)重組有效得多地整合導(dǎo)入的外來DNA掩蓋。定制設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶(ZFN)是為了提供DNA中靶定位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂，隨后重組切割末端設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。ZFN組合限制性內(nèi)切核酸酶，諸如例如FokI的非特異性切割域與鋒指DNA結(jié)合蛋白。見例如Huang等(1996) J. Protein Chem. 15:481-9;Kim等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20 ; Kim ^ (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93:1156-60;Kim 等(1994)Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7;Kim 等(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12875-9;Kim 等(1997c)Gene 203:43-9;Kim 等(1998)Biol.Chem. 379:489-95;Nahon and Raveh(1998)Nucleic Acids Res. 26:1233-9;Smith 等(1999)Nucleic Acids Res. 27:674-81。各個(gè)鋅指基序可以設(shè)計(jì)為靶向并結(jié)合大范圍的DNA 結(jié)合DNA。鋅指對(duì)DNA的識(shí)別是模塊的每個(gè)指主要接觸靶物中的三個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)，并且蛋白質(zhì)中的幾個(gè)關(guān)鍵殘基介導(dǎo)識(shí)別。已經(jīng)顯示了 FokI限制性內(nèi)切核酸酶必須經(jīng)由核酸酶域ニ聚化以切割DNA，誘導(dǎo)雙鏈斷裂。類似地，ZFN也需要核酸酶域的ニ聚化以切割DNA。Mani 等(2005)Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7;Smith 等(2000)Nucleic AcidsRes. 28:3361-9。ZFN的ニ聚化由兩個(gè)相鄰的、相反取向的結(jié)合位點(diǎn)促進(jìn)。同上文。發(fā)明概述本文中公開了將核酸分子導(dǎo)入展現(xiàn)出低同源重組率的宿主生物體，例如，植物或動(dòng)物物種的基因組中的方法。在具體的例子中，使用“工程化降落場(chǎng)”(ELP)，其中ELP可以包含如下的核苷酸序列區(qū)，其包含在DNA結(jié)合域(例如，鋅指蛋白(ZFP)、大范圍核酸酶、或亮氨酸拉鏈)的結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼的與宿主生物體的基因組基本上缺乏同源性的核苷酸序列(例如，隨機(jī)生成的序列)。靶向ELP的結(jié)合位點(diǎn)的DNA結(jié)合域可以天然地包含DNA切割功能域或者可以是融合蛋白中進(jìn)ー步包含功能域，例如內(nèi)切核酸酶切割域或切割半域(例如，ZFN、重組酶、轉(zhuǎn)座酶、或歸巢內(nèi)切核酸酶，包括具有經(jīng)修飾的DNA結(jié)合域的歸巢內(nèi)切核酸酶)的部分。此類DNA結(jié)合和切割蛋白在本文中統(tǒng)稱為“靶向性內(nèi)切核酸酶”。在具體的例子中，也可以使用來自與宿主生物體不同的生物來源的非隨機(jī)化核苷酸序列；與靶生物體的基因組的非同源性是合適的。如此，在一些例子中，核苷酸序列可以設(shè)計(jì)為確保與任何測(cè)序的靶植物基因組的區(qū)域基本上沒有同源性。在一些例子中，ELP可以提供同源性區(qū)和靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)的高活性的結(jié)合位點(diǎn)以進(jìn)行同源性指導(dǎo)的基因靶向。因此，ELP可以降低或消除對(duì)在核酸插入物中使用外部或內(nèi)部的其它核苷酸序列的需要。ELP可以設(shè)計(jì)為缺乏任何假的可讀框，而且如優(yōu)選的，含有或缺乏限制酶位點(diǎn)以構(gòu)建載體或分析用感興趣的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物。在ー些例子中，ELP側(cè)翼可以有不同限制性位點(diǎn)，其在限制酶消化后生成相容的末端，但是雜合的連接位點(diǎn)是任ー種限制酶不可切割的。在這些和其它例子中，這容許將ELP串聯(lián)成更大的排列(array)，它們各具有獨(dú)特的同源性區(qū)和靶向性內(nèi)切核酸酶結(jié)合位點(diǎn)(例如，ZFN結(jié)合位點(diǎn))。在一些例子中，ELP可以隨機(jī)摻入靶基因組中，或者靶向至已經(jīng)顯示容納轉(zhuǎn)基因插入物的基因組位點(diǎn)，而對(duì)所得的轉(zhuǎn)基因植物沒有任何，或者具有可接受的有害影響。基因組靶位點(diǎn)中的同源性區(qū)可以與靶定的供體核酸分子中的同源性區(qū)相同，由此便于靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)的雙鏈切割后同源性指導(dǎo)的重組。因而，公開了設(shè)計(jì)并生成ELP的方法以及使用ELP用感興趣的核酸分子轉(zhuǎn)化植物的方法。還公開了可用于本發(fā)明的核酸分子，和通過依照本發(fā)明的方法生成的經(jīng)遺傳修飾的植物。從參照附圖進(jìn)行的幾個(gè)實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述看，上述和其它特征會(huì)變得更加顯而易見。附圖簡(jiǎn)述 圖I包括包含ELP的代表性載體pDAB100610的描繪。圖2包括包含ELP的代表性載體pDAB100611的描繪。圖3包括包含ELP的代表性載體pDAB100640的描繪。圖4包括包含ELP的代表性載體pDAB100641的描繪。圖5包括包含要整合入ELP中的供體片段的代表性載體PDAB105955的描繪。圖6包括包含要整合入ELP中的供體片段的代表性載體PDAB105956的描繪。圖7包括包含要整合入ELP中的供體片段的代表性載體PDAB105979的描繪。圖8包括包含要整合入ELP中的供體片段的代表性載體PDAB105980的描繪。圖9是a)玉米中的ELPl ；b)用于ELPl再靶向的供體構(gòu)建體；c)再靶定的ELPl基因座的不意圖。

圖10包括代表性載體PDAB104132的描繪。圖11包括側(cè)翼有工程化鋅指結(jié)合位點(diǎn)和緩沖序列(buffer sequence)的多克隆位點(diǎn)的代表性DNA片段的描繪。圖12包括代表性載體PDAB104126的描繪。圖13包括代表性載體PDAB104136的描繪。圖14包括代表性載體PDAB104138的描繪。圖15包括代表性載體PDAB104140的描繪。圖16包括代表性載體PDAB104142的描繪。圖17包括代表性載體PDAB104133的描繪。圖18包括代表性載體PDAB104134的描繪。圖19包括代表性載體PDAB104135的描繪。圖20包括代表性載體PDAB104137的描繪。圖21包括代表性載體PDAB104139的描繪。圖22包括代表性載體PDAB104141的描繪。圖23包括代表性載體PDAB104143的描繪。發(fā)明詳述I.幾個(gè)實(shí)施方案的概述在一些實(shí)施方案中，提供了用于將包含“工程化降落場(chǎng)”(ELP)的核酸分子導(dǎo)入宿主生物體中，從而便于其它感興趣的核酸分子整合入宿主生物體中的方法。在實(shí)施方案中，ELP可以包含在靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)(例如，ZFN識(shí)別位點(diǎn))側(cè)翼的與宿主生物體的天然序列不同源的核酸序列區(qū)(例如，基本上隨機(jī)生成的核酸序列，然后，其可以基于某些期望的標(biāo)準(zhǔn)為了插入而選擇，如本文中公開的)。供整合ELP用的位點(diǎn)可以是隨機(jī)的，可以通過例如鑒定宿主基因組內(nèi)具有要在ELP的位點(diǎn)處導(dǎo)入的感興趣核酸分子期望的水平表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因確定，或者可以通過鑒定宿主基因組內(nèi)在所述位點(diǎn)處引入ELP時(shí)不對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主生物體賦予代謝、功能、農(nóng)藝學(xué)(若植物的話)或其它罰分(penalty)的位置確定?？梢詫LP串聯(lián)導(dǎo)入基因組中，使得例如ELP在依照本發(fā)明的方法生成的生物體中以多聯(lián)體存在。在一些實(shí)施方案中，在ELP位點(diǎn)處實(shí)施感興趣的核酸分子的整合。在實(shí)施方案中，要在ELP位點(diǎn)處引入的感興趣的核酸分子與以多肽提供的或自導(dǎo)入的RNA或DNA表達(dá)的ー種或多種靶向性內(nèi)切核酸酶聯(lián)合。另外，導(dǎo)入的核酸分子可以包含與已經(jīng)摻入宿主基因組中的ELP不同的ELP。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)在野生型生物體中表達(dá)天然核酸序列的位點(diǎn)處導(dǎo)入宿主基因組中的核酸序列預(yù)期會(huì)以與天然核酸序列相似的方式表達(dá)。例如，若在調(diào)節(jié)元件控制下在野生型生物體中表達(dá)天然核酸序列(例如，使得例如，核酸序列以組織特 異性或發(fā)育特異性方式表達(dá))，則預(yù)期導(dǎo)入的核酸序列會(huì)經(jīng)歷相同或相似的調(diào)節(jié)控制。如此，ELP可以便于在ELP位點(diǎn)處導(dǎo)入的感興趣的核酸分子期望的時(shí)間和/或空間表達(dá)。II.縮寫ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法ELP工程化降落場(chǎng)ZFN 鋅指核酸酶III.術(shù)語基因表達(dá)將核酸轉(zhuǎn)錄單元(包括例如，基因組DNA)的編碼信息轉(zhuǎn)化成細(xì)胞的操作的、非操作的、或結(jié)構(gòu)的部分的過程，經(jīng)常包括蛋白質(zhì)的合成?；虮磉_(dá)可以受到外部信號(hào)影響；例如，將細(xì)胞、組織、或生物體暴露于提高或降低基因表達(dá)的媒介物?；虮磉_(dá)也可以在從DNA至RNA至蛋白質(zhì)的途徑中的任何地方受到調(diào)節(jié)。例如經(jīng)由對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和加工、對(duì)中間分子諸如mRNA的降解起作用的控制，或者經(jīng)由特定蛋白質(zhì)分子在它們生成后的活化、滅活、區(qū)室化(compartmentalization)、或降解,或者通過其組合發(fā)生基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。基因表達(dá)可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白質(zhì)水平測(cè)量基因表達(dá)，包括但不限于Northern印跡、RT-PCR> Western印跡、或體外、原位、或體內(nèi)蛋白質(zhì)活性測(cè)定法。雜交寡核苷酸及其類似物通過互補(bǔ)堿基間的氫鍵合(其包括沃森-克里克(Watson Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵合)雜交。一般地，核酸分子由作為卩密唳(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))的含氮堿基組成。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤間形成氫鍵，并且嘧啶與嘌呤的鍵合稱為“堿基配対”。更具體地，A或與T或U氫鍵合，而G會(huì)與C鍵合?！盎パa(bǔ)的”指兩種獨(dú)特的核酸序列或相同核酸序列的兩個(gè)獨(dú)特區(qū)間發(fā)生的堿基配對(duì)。“可特異性雜交的”和“特異性互補(bǔ)的”是指足夠的互補(bǔ)性程度，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶物間發(fā)生穩(wěn)定的且特異性的結(jié)合的術(shù)語。寡核苷酸與要可特異性雜交的其靶序列不需要是100%互補(bǔ)的。在寡核苷酸對(duì)靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能，并且有足夠的互補(bǔ)性程度以避免寡核苷酸在期望特異性結(jié)合的條件下，例如，在體內(nèi)測(cè)定法或系統(tǒng)的情況中在生理學(xué)條件下與非靶序列的非特異性結(jié)合時(shí)，寡核苷酸是可特異性雜交的。此類結(jié)合稱為特異性雜交。導(dǎo)致特定嚴(yán)格性程度的雜交條件會(huì)隨選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸序列的組成和程度而有所變化。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是Na+和/或Mg2+濃度)會(huì)促成雜交的嚴(yán)格性，盡管清洗次數(shù)也影響嚴(yán)格性。關(guān)于獲得特定的嚴(yán)格性程度需要的雜交條件的計(jì)算在 Sambrook 等(編)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,桌 2 te，弟 1-3 卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, 1989，第9章和第11章中討論。出于本公開內(nèi)容的目的，“嚴(yán)格條件”涵蓋若雜交分子與靶序列間存在有小于25%錯(cuò)配會(huì)發(fā)生雜交的條件?！皣?yán)格條件”可以進(jìn)一歩限定成特定的嚴(yán)格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等嚴(yán)格性”條件是具有超過25%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件。“中間嚴(yán)格性”條件是具有超過15%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件，而“高嚴(yán)格性”條件是具有超過10% 錯(cuò)配的序列不會(huì)雜交的條件?！皹O高嚴(yán)格性”條件是具有超過6%錯(cuò)配的序列不會(huì)雜交的條件。在具體的實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件可以包括于65 °C雜交，接著于65 °C用O. lxSSC/0. 1%SDS連續(xù)清洗40分鐘。分離的“分離的”生物組分(諸如核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)與該組分天然存在的生物體細(xì)胞中的其它生物組分，即，其它染色體和染色體外DNA和RNA及蛋白質(zhì)基本上分開、離開其生成、遠(yuǎn)離其純化。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。核酸分子核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈兩者，和上述物質(zhì)的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一類核苷酸的修飾形式。如本文中使用的，“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義的。該術(shù)語包括單和雙鏈形式的DNA。核酸分子可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯(lián)接連接在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸中的任ー種或兩種。核酸分子可以是經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易領(lǐng)會(huì)的。此類修飾包括例如，標(biāo)記、甲基化、和用類似物替代ー種或多種天然存在的核苷酸。其它修飾包括核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酷、磷酸三酷、氨基磷酸酷、氨基甲酸酯等)、帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酯等)、懸垂的模塊(例如，肽)、插入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素(psoralen)等)、螯合剤、烷化劑、和經(jīng)修飾的連接(例如，α異頭核酸等)。術(shù)語“核酸分子”還包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾的、環(huán)狀、和掛鎖的構(gòu)象?？刹僮鬟B接的在第一核酸序列在與第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可存在連接。例如，在啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列可操作連接。在重組生成時(shí)，可操作連接的核酸序列一般是連續(xù)的，且在必需連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況中，處于相同閱讀框中。然而，元件不需要為了是可操作連接的而是連續(xù)的。啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄需要的一般位于上游(朝向基因的5’區(qū))的DNA區(qū)。啟動(dòng)子容許其控制的基因的正確活化或阻抑。啟動(dòng)子含有轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的特定序列。這些因子結(jié)合啟動(dòng)子DNA序列，并且導(dǎo)致RNA聚合酶，即自基因的編碼區(qū)合成RNA的酶的募集。在ー些實(shí)施方案中，使用組織特異性啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子是在相對(duì)于生物體的其它組織而言啟動(dòng)子是特異性的組織中指導(dǎo)關(guān)聯(lián)基因的較高水平轉(zhuǎn)錄的DNA序列。組織特異性啟動(dòng)子的例子包括絨氈層特異性啟動(dòng)子；花藥特異性啟動(dòng)子；花粉特異性啟動(dòng)子(見例如美國(guó)專利No. 7，141，424和國(guó)際PCT公開文本No. WO 99/042587);胚珠特異性啟動(dòng)子(見例如美國(guó)專利申請(qǐng)No. 2001/047525 Al);果實(shí)特異性啟動(dòng)子(見例如美國(guó)專利No. 4，943，674和5，753，475);和種子特異性啟動(dòng)子(見例如，美國(guó)專利No. 5，420，034和5，608，152)。在一些實(shí)施方案中，也使用發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子，例如，在較晚的發(fā)育階段有活性的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化的在病毒或載體將核酸分子轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中時(shí)其“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”細(xì)胞。在核酸分子通過將核酸分子整合入細(xì)胞基因組中，或者通過附加體復(fù)制被細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制吋，細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸分子“轉(zhuǎn)化”。如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”涵蓋可以將核酸分子導(dǎo)入此類細(xì)胞中的所有技術(shù)。例子包括但不限于用病毒載體轉(zhuǎn)染、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、電 穿孔(Fromm 等(1986)Nature 319:791-3)、脂轉(zhuǎn)染(Feigner 等(1987)Proc. Natl. Acad.Sci.USA84:7413-7)、微注射(Mueller 等(1978)Cell 15:579-85)、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(Fraley 等(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)、直接的 DNA 攝取、和微粒轟擊(Klein 等(1987)Nature 327:70)。轉(zhuǎn)基因外源核酸序列。在一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)基因是基因序列(例如，除草劑抗性基因)、編碼エ業(yè)或藥學(xué)上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因。在又ー個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因是反義核酸序列，其中反義核酸序列的表達(dá)展現(xiàn)出靶核酸序列的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。在一些實(shí)施方案中，要通過ELP靶向性重組引入的感興趣的核酸分子是轉(zhuǎn)基因。然而，在其它實(shí)施方案中，感興趣的核酸分子是內(nèi)源核酸序列，其中內(nèi)源核酸序列的額外的基因組拷貝是期望的，或相對(duì)于宿主生物體中的靶核酸分子處于反義取向的核酸分子。載體如導(dǎo)入細(xì)胞中，由此生成經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的核酸分子。載體可以包括容許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制起點(diǎn)。例子包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、或?qū)⑼庠碊NA攜帯到細(xì)胞中的病毒。載體還可以包含ー種或多種基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志基因和本領(lǐng)域中已知的其它遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、或感染細(xì)胞，由此引起細(xì)胞表達(dá)由載體編碼的核酸分子和/或蛋白質(zhì)。任選地，載體可以包含幫助實(shí)現(xiàn)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞中的材料(例如，脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)編碼等)。IV.供植物中基因靶向用的工程化降落場(chǎng)A.概述在一些實(shí)施方案中，將ELP導(dǎo)入植物中，例如以便于引入一種或多種其它感興趣的核酸分子。其它感興趣的核酸分子可以包含例如編碼要在宿主生物體中表達(dá)的蛋白質(zhì)的任何核酸序列。在其它實(shí)施方案中，使用ELP以便于引入未知功能的核酸分子，從而基于異位基因表達(dá)辨別其功能。在ELP側(cè)翼的區(qū)域與宿主植物的基因組核酸序列可以是同源的，使得ELP以位點(diǎn)特異性方式整合入宿主植物基因組中。可以使用ELP以摻入各種長(zhǎng)度的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，靶向至轉(zhuǎn)基因ELP靶物的核酸分子可以含有第二 ELP以容許靶位點(diǎn)處的繼續(xù)基因添加?？梢栽诖诉^程中序貫或同時(shí)使用ー種或多種靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)。若想要的話，可以另外在與宿主植物的基因組核酸序列同源的ELP區(qū)內(nèi)部整合超過ー個(gè)靶向性內(nèi)切核酸酶結(jié)合位點(diǎn)(例如，ZFN結(jié)合位點(diǎn))。在一些實(shí)施方案中，可以添加靶向性內(nèi)切核酸酶結(jié)合位點(diǎn)，使得它們?cè)贓LP側(cè)翼。在此后ー種和其它實(shí)施方案中，在植物中在添加的結(jié)合位點(diǎn)處切割的靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)的表達(dá)導(dǎo)致切除ELP。在一些實(shí)施方案中，也可以與其它側(cè)翼DNA組合使用與宿主植物的基因組核酸序列同源的區(qū)域以容許插入與在ELP靶物處引入的感興趣的核酸分子相鄰的核酸分子，諸如例如基因表達(dá)元件或感興趣的基因?？梢允褂肈NA切割以增強(qiáng)此位點(diǎn)處的同源重組。在一些實(shí)施方案中，也可以使用ELP中與基因組核酸序列同源的同源性區(qū)以靶向性插入核酸分子，其由切割DNA的酶，諸如ZFN、大范圍核酸酶或其它靶向性內(nèi)切核酸酶促進(jìn)。在一些實(shí)施方案中，ELP可以摻入經(jīng)修飾的染色體區(qū)中，諸如可以通過DNA擴(kuò)增過 程或在微型染色體中生成。在一些實(shí)施方案中，使用同源性區(qū)和適當(dāng)放置的靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)以便于修飾在與宿主植物的基因組核酸序列同源的側(cè)翼區(qū)內(nèi)部的序列。B. ELP 的設(shè)計(jì) 在一些實(shí)施方案中，ELP可以設(shè)計(jì)為便于植物染色體位置中的同源重組。ELP對(duì)周圍的基因或DNA序列可以具有中性的影響。ELP可以代表植物基因組內(nèi)獨(dú)特的、可靶向的序列。在某些實(shí)施方案中，期望的染色體位置的每個(gè)5’和3’同源性區(qū)的大小(例如，Ikb)選擇為滿足認(rèn)為對(duì)于便于同源性指導(dǎo)的重組期望的最小大小。在具體的實(shí)施方案中，每個(gè)5’和 3，同源性區(qū)的大小是約 50bp ；IOObp ；200bp ；400bp ；600bp ；700bp ；750bp ；800bp ；lkb ；1.2kb ；1.4kb ；1.6kb ；1.8kb ；2kb ;或3kb。5’和3’同源性區(qū)在具體的實(shí)施方案中不需要是相同大小的。例如，可以使用用于隨機(jī)數(shù)目生成的計(jì)算機(jī)程序生成ELP序列。然后，基于期望的特征，包括但不限于與靶生物體的天然基因組序列基本上或完全缺乏同源性的序列，可以選擇例如通過隨機(jī)序列生成所生成的ELP序列以用作ELP。也可以修飾選擇的ELP，如下文進(jìn)ー步詳述的。在一些實(shí)施方案中，用于設(shè)計(jì)ELP和/或修飾選定的ELP的標(biāo)準(zhǔn)可以包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)除去常規(guī)用于克隆的限制性位點(diǎn)；潛在甲基化位點(diǎn)(例如，CG和CNG)數(shù)目的減少；和缺乏大于300bp的任何可讀框。另外，在ELP設(shè)計(jì)期間，可以除去核酸序列中的其它位點(diǎn)，包括例如外顯子內(nèi)含子連接(5’或3’ );多聚A添加信號(hào)；RNA聚合酶終止信號(hào)；和高度穩(wěn)定的鏈內(nèi)ニ級(jí)結(jié)構(gòu)。也可以分析并修飾序列以降低TA或CG雙聯(lián)體的頻率。也可以在ELP設(shè)計(jì)期間自序列除去具有超過約6個(gè)連續(xù)的[G+C]或[A+T]殘基的序列區(qū)組。在實(shí)施方案中，ELP可以包含例如式X1-Y-X2的核苷酸序列，其中Y是至少ー個(gè)靶向性內(nèi)切核酸酶結(jié)合位點(diǎn)(例如，ZFN結(jié)合位點(diǎn))，其中Xl是與宿主生物體的基因組缺乏同源性的選定核苷酸序列，并且位于Y的5’，且其中X2是同與Xl不同的宿主生物體基因組缺乏同源性的選定核苷酸序列。例示性的Xl和X2核苷酸序列可以獨(dú)立選自下列序列SEQ ID NO: I; SEQ IDNO:2;SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5;SEQ ID NO:6;SEQ ID NO:7;SEQ ID NO:8;SEQID N0:9;和SEQ ID N0:10o可以在ー些實(shí)施方案中進(jìn)行對(duì)這些序列的其它修飾、刪除、或添加(例如，除去或添加限制性位點(diǎn))以提供添加的或不同的功能性。例如，在某些實(shí)施方案中可以修飾SEQ ID NO: I以生成SEQ ID NO: 11 ;可以修飾SEQ ID NO: 3以生成SEQ IDN0:12 ;可以修飾SEQ ID N0:2以生成SEQ ID NO: 13 ;可以修飾SEQ ID N0:4以生成SEQ IDNO: 14 ;可以修飾SEQ ID N0:5以生成SEQ ID NO: 17 ;并且可以修飾SEQ ID N0:6以生成SEQ ID NO:18。在具體的實(shí)施方案中，例示性的ELP包括但不限于下列序列SEQ ID NO: 15; SEQID NO:16;和 SEQ ID NO:19?？梢栽贓LP側(cè)翼引入限制酶位點(diǎn)(例如，F(xiàn)seI限制酶位點(diǎn))以實(shí)現(xiàn)ELP對(duì)合適的載體的克隆。也可以在ELP側(cè)翼引入在限制酶消化后生成相容末端的限制酶位點(diǎn)(例如，BglII和BamHI位點(diǎn))，以容許將ELP在宿主植物基因組中例如以多聯(lián)體鏈接在一起。也可以引入限制酶位點(diǎn)以容許在宿主植物中分析隨后通過重組靶向至ELP的感興趣的核酸序列。可以在單個(gè)ELP側(cè)翼引入兩個(gè)或更多個(gè)限制酶位點(diǎn)。例如，BglII和BamHI位點(diǎn)可以包含在FseI位點(diǎn)內(nèi)部。也可以引入限制酶位點(diǎn)以容許在宿主植物中分析通過重組靶向至 插入的ELP的感興趣的核酸序列。例如，可以引入PmeI位點(diǎn)以在插入位點(diǎn)側(cè)翼。C.將核酸分子投遞入含有ELP的植物細(xì)胞中為了經(jīng)由靶向性整合實(shí)現(xiàn)感興趣的核酸分子(例如，ELP和/或靶向至先前整合的ELP的外源核酸分子)對(duì)植物基因組的靶向性內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的整合，需要投遞靶向性內(nèi)切核酸酶或靶向性內(nèi)切核酸酶編碼核酸分子，接著在植物細(xì)胞中表達(dá)功能性靶向性內(nèi)切核酸酶蛋白。感興趣的核酸分子還應(yīng)當(dāng)與其中投遞或表達(dá)靶向性內(nèi)切核酸酶同時(shí)存在于植物細(xì)胞中，使得功能性靶向性內(nèi)切核酸酶蛋白可以在靶位點(diǎn)處誘導(dǎo)雙鏈斷裂，然后，其經(jīng)由感興趣的核酸分子對(duì)靶基因座的同源性驅(qū)動(dòng)的整合來修復(fù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想可以通過幾種方法，包括但不限于靶向性內(nèi)切核酸酶編碼構(gòu)建體的基因轉(zhuǎn)移，或靶向性內(nèi)切核酸酶編碼構(gòu)建體的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)現(xiàn)功能性靶向性內(nèi)切核酸酶蛋白的表達(dá)。在這兩種情況中，植物細(xì)胞中功能性靶向性內(nèi)切核酸酶蛋白的表達(dá)和供體DNA的投遞可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)以驅(qū)動(dòng)靶向性整合。如此，在具體的實(shí)施方案中，自經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中的核酸分子表達(dá)靶向性內(nèi)切核酸酶(例如，ZFN)以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的基因組中，例如在先前引入植物的ー個(gè)或多個(gè)ELP中引入雙鏈斷裂。可以使用靶向性內(nèi)切核酸酶，其靶向設(shè)計(jì)為存在于ELP中的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別序列。因此，可以通過確定ー種或多種特定的核酸序列開始用于構(gòu)建本發(fā)明的ELP的設(shè)計(jì)和選擇方法，所述ー種或多種特定的核酸序列由隨后要用于在ELP處引入感興趣的核酸分子的靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別。ZFN系統(tǒng)的柔性和特異性提供先前通過已知的重組酶介導(dǎo)的基因切除策略不可實(shí)現(xiàn)的控制水平。作為ー個(gè)例子，可以容易地工程化改造ZFN，例如以識(shí)別特定的核酸序列(例如，ELP)。Wu等(2007)Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44。鋅指識(shí)別殘基的密碼子的隨機(jī)化容許選擇對(duì)任意選擇的DNA序列具有高親和カ的新指。此外，鋅指是天然的DNA結(jié)合分子，并且已經(jīng)顯示了工程化鋅指對(duì)活細(xì)胞中其設(shè)計(jì)的靶物起作用。如此，基于鋅指的核酸酶可靶向特定的但任意的識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)嵌合鋅指核酸酶的切割域的ニ聚化的需要賦予高水平的序列特異性。因?yàn)槿齻€(gè)指的每組結(jié)合9個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)，所以若每個(gè)鋅指域具有完全的特異性，則兩個(gè)嵌合核酸酶有效要求18bp靶物。此長(zhǎng)度的任何給定序列預(yù)測(cè)為在単一基因組內(nèi)是獨(dú)特的(假設(shè)約109bp) ο Bibikova 等(2001)Mol. Cell. Biol. 21 (I) :289-97;Wu 等(2007)，見上文。此外，其它指提供增強(qiáng)的特異性，Beerli 等(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14628-33;Kim和 Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci.USA94:5525-30，因此可以增加每個(gè)DNA結(jié)合域中的鋅指數(shù)目以提供甚至進(jìn)ー步的特異性。例如，可以通過使用識(shí)別24bp序列的ー對(duì)4指ZFN來進(jìn)ー步提高特異性。Urnov等(2005)Nature 435:646-5 I。如此，可以使用ZFN，使得導(dǎo)入宿主植物基因組中的ELP中的識(shí)別序列在基因組內(nèi)是獨(dú)特的。通過ELP處的靶向性重組引入的感興趣的核酸分子可以以足夠的量與驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的ー種或多種植物啟動(dòng)子可操作連接以賦予期望的性狀或表型。適合于這種和其它用途的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。描述此類啟動(dòng)子的非限制性例子包括美國(guó)專利No. 6，437，217 (玉米R(shí)S81啟動(dòng)子)；5，641，876 (稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)；6，426，446 (玉米R(shí)S324啟動(dòng)子)；6，429，362 (玉米PR-I啟動(dòng)子)；6，232，526 (玉米A3啟動(dòng)子)；6，177,611(組成性玉米啟動(dòng)子);5，322，938、5，352，605、5，359，142、和 5,530，196 (35S啟動(dòng)子)；6，433，252 (玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)；6，429，357 (稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和 稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)；5，837，848(根特異性啟動(dòng)子)；6，294，714 (光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6，140，078 (鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子);6，252，138 (病原性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子);6，175，060 (磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6，388，170 (雙向啟動(dòng)子)；6，635，806 (gamma-薏苡辛(coixin)啟動(dòng)子)；和美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)09/757，089 (玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)。其它啟動(dòng)子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 (16) : 5745-9)；章魚堿合酶(OCS)啟動(dòng)子(其在根瘤土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帯)；花椰菜花葉病毒(caulimovirus)啟動(dòng)子，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S啟動(dòng)子(Lawton等(1987)Plant Mol. Biol. 9:315-24) ；CaMV 35S 啟動(dòng)子(Odell 等(1985)Nature 313:810-2 ;玄參花葉病毒 35S 啟動(dòng)子(Walker 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19) :6624-8);蔗糖合酶啟動(dòng)子(Yang 和 RusselI (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8) ;R 基因復(fù)合物啟動(dòng)子(Chandler等(1989) Plant Cell 1:1175-83);葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子；CaMV35S (美國(guó)專利 No. 5，322，938，5，352，605，5，359，142 和 5，530，196) ；FMV35S (美國(guó)專利No. 6，051，753 和 5，378，619) ;PC1SV啟動(dòng)子(美國(guó)專利 No. 5，850，019) ；SCP1 啟動(dòng)子(美國(guó)專利 No. 6，677，503);和 AGRtu. nos 啟動(dòng)子(GenBank 登錄號(hào) V00087; Depicker 等(1982)J. Mol. Appl. Genet. 1:561 73;Bevan 等(1983)Nature304:184-7)等?？梢匀芜x地與感興趣的核酸分子可操作連接的其它遺傳元件包括編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。例如，已經(jīng)顯示了合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，諸如擬南芥(A. thaliana)EPSPS CTP(Klee等(1987)Mol. Gen. Genet. 210:437-42)和矮牽牛(Petunia hybrida) EPSPS CTP (dellaCioppa 等(I 986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)的摻入將異源 EPSPS 蛋白序列革巴向至轉(zhuǎn)基因植物中的葉綠體。也可以將麥草畏單加氧酶(Dicamba monooxygenase, DM0)革巴向至葉綠體，如記載于國(guó)際PCT公開文本No. WO 2008/105890的?？梢匀芜x地與感興趣的核酸分子可操作連接的其它遺傳元件還包括位于啟動(dòng)子序列和功能為翻譯前導(dǎo)序列的編碼序列間的5’ UTR0翻譯前導(dǎo)序列存在于在翻譯起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響前轉(zhuǎn)錄物(primary transcript)加工成mRNA、mRNA穩(wěn)定、和/或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)物(美國(guó)專利No. 5，362，865)、植物病毒殼體蛋白前導(dǎo)物、植物rubisco前導(dǎo)物等。見例如 Turner 和 Foster (1995)Molecular Biotech. 3 (3) : 225-36。5’UTR 的非限制性例子包括 GmHsp (美國(guó)專利 No. 5，659，122) ;PhDnaK (美國(guó)專利 No. 5，362，865) ；AtAntl ；TEV(Carrington 和 Freed(1990) J. Virol. 64:1 590-7)；和 AGRtunos (GenBank 登錄號(hào)V00087 ;和 Bevan 等(1983)Nature 304:184-7)?？梢匀芜x地與感興趣的核酸分子可操作連接的其它遺傳元件還包括3’非翻譯序列、3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于多核苷酸分子下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號(hào)的多核苷酸、和/或能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、或基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)信號(hào)。多腺苷酸化信號(hào)在植物中發(fā)揮功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前體的3’端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因、多種植物基因、或T-DNA基因。3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的非限制性例子是胭脂氨酸合成酶3’區(qū)(nos 3，;Fraley等(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:4803-7)。在Ingelbrecht等，(1989)植物細(xì)胞1:671-80中提供使用不同3’非翻譯區(qū)的例子。多腺苷酸化信號(hào)的非限制性例子包括來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2 E9; Coruzzi 等(1984) EMBO J. 3:1671-9)和 AGRtu. nos (GenBank 登錄號(hào) EO13 12) 的。D.用核酸分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以使用用于將核酸分子導(dǎo)入植物中的本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來生成依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物，例如以將ー個(gè)或多個(gè)ELP引入宿主植物基因組中，和/或以進(jìn)行引入感興趣的核酸分子。認(rèn)為適合于轉(zhuǎn)化植物的方法實(shí)質(zhì)上包括可以將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的任何方法，諸如通過電穿孔，如美國(guó)專利No. 5，384，253中例示的；通過微粒轟擊，如美國(guó)專利No. 5，015，580,5, 550，318,5, 538，880,6, 160，208,6, 399，861 和 6，403，865 中例示的；通過土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，如美國(guó)專利No. 5，635，055，5，824，877，5，591，616; 5，981，840和6，384，301中例示的；及通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如美國(guó)專利No. 5，508，184中列出的，等等。經(jīng)由應(yīng)用諸如這些技術(shù)，可以將實(shí)際上任何植物物種的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將這些細(xì)胞開發(fā)成轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以在棉轉(zhuǎn)化背景中特別有用的技術(shù)披露于美國(guó)專利No. 5，846，797，5，159，135，5，004，863和6，624，344 ;特別地，用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬(Brassica)植物的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 5，750，871 ;用于轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 6，384，301 ;并且用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 7，060，876、美國(guó)專利 No. 5，591，616 和國(guó)際 PCT 公開文本 WO 95/06722。在實(shí)現(xiàn)外源DNA對(duì)接受細(xì)胞的投遞后，一般地，鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以進(jìn)ー步培養(yǎng)和植物再生。為了改善鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可以期望與用于生成轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化載體一起采用選擇或篩選標(biāo)志基因。在此情況中，可以通過將細(xì)胞暴露于ー種或多種選擇劑來測(cè)定潛在轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體，或者可以對(duì)細(xì)胞篩選期望的標(biāo)志基因性狀?？梢詫⑿颐庥趯?duì)選擇劑暴露的細(xì)胞，或在篩選測(cè)定法中得分為正的細(xì)胞在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，可以通過包含其它物質(zhì)，諸如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物修飾任何合適的植物組織培養(yǎng)基(例如，MS和N6培養(yǎng)基)。可以將組織在具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上維持，直至足夠的組織可用于開始植物再生努力，或者在手工選擇的重復(fù)輪次后，直至組織的形態(tài)學(xué)適合于再生(例如，至少2周)，然后轉(zhuǎn)移至進(jìn)行枝條形成的培養(yǎng)基。周期性轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直至已經(jīng)發(fā)生足夠的枝條形成。一旦形成枝條，便將它們轉(zhuǎn)移至進(jìn)行根形成的培養(yǎng)基。一旦形成足夠的根，可以將植物轉(zhuǎn)移至土壤以進(jìn)一步生長(zhǎng)和成熟。為了確認(rèn)感興趣的核酸分子在再生植物中的存在，可以實(shí)施多種測(cè)定法。此類測(cè)定法包括例如分子生物學(xué)測(cè)定法，諸如Southern和Northern印跡和PCR ;生物化學(xué)測(cè)定法，諸如檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如，通過免疫學(xué)手段(ELISA和/或Western印跡)或者通過酶功能；植物部分測(cè)定法，諸如葉或根測(cè)定法；和分析再生的全植物的表型。例如，可以使用例如對(duì)感興趣的核酸分子特異性的寡核苷酸引物通過PCR擴(kuò)增篩選靶向性整合事件。PCR基因型分型理解為包括但不限于源自分離的宿主植物愈傷組織(callus tissue)的基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)克隆和序列分析，所述宿主植物愈傷組織預(yù)測(cè)為含有整合入基因組中的感興趣核酸分子。PCR基因型分型的方法已經(jīng)充分描述(例如，Rios, G.等(2002) Plant J. 32:243-53),并且可以應(yīng)用于源自任何植物物種或組織類型，包括細(xì)胞培養(yǎng)物的基因組DNA?？梢栽赑CR 擴(kuò)增反應(yīng)中序貫使用或多重化(multiplex)結(jié)合靶序列和引入序列兩者的寡核苷酸引物的組合。設(shè)計(jì)為與靶位點(diǎn)、引入的核酸序列、和/或兩種的組合退火的寡核苷酸引物是可行的。如此，PCR基因型分型策略可以包括(但不限干)擴(kuò)增植物基因組中的特異性序列、擴(kuò)增植物基因組中的多個(gè)特異性序列、擴(kuò)增植物基因組中的非特異性序列、或其組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)引物和擴(kuò)增反應(yīng)的其它組合以詢問基因組。例如，一組正向和反向寡核苷酸引物可以設(shè)計(jì)為與對(duì)在引入的核酸序列邊界外部的靶物特異性的核酸序列退火。正向和反向寡核苷酸引物可以設(shè)計(jì)為與引入的感興趣核酸分子(例如，在與感興趣的核酸分子內(nèi)的編碼區(qū)對(duì)應(yīng)的序列處)或感興趣的核酸分子的其它部分特異性退火?？梢耘c上文所描述的引物聯(lián)合使用這些引物。寡核苷酸引物可以依照期望的序列合成，并且是商品化的(例如，來自 Integrated DNA Technologies, Inc.，Coralville, IA)。擴(kuò)增可以繼之以克隆和測(cè)序，或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的直接序列分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想用于分析PCR基因型分型期間生成的擴(kuò)增產(chǎn)物的備選方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在PCR擴(kuò)增中采用對(duì)基因靶物特異性的寡核苷酸引物。E.轉(zhuǎn)基因植物的培養(yǎng)和使用包含ー個(gè)或多個(gè)ELP和/或通過在依照本發(fā)明的ELP位點(diǎn)處的靶向性重組插入的感興趣的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物可以具有一種或多種期望的性狀。此類性狀可以包括例如對(duì)昆蟲、其它有害物和引起疾病的媒介物的抗性；對(duì)除草劑的耐受性；增強(qiáng)的穩(wěn)定性、產(chǎn)量、或貨架期；環(huán)境耐受性；藥物生成；エ業(yè)產(chǎn)品生成；和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)。期望的性狀可以由在展現(xiàn)出期望性狀的植物中表達(dá)的通過ELP位點(diǎn)處的靶向性重組插入的ー種或多種核酸分子賦予。如此，在一些實(shí)施方案中，期望的性狀可以是由于植物中存在轉(zhuǎn)基因所致，所述轉(zhuǎn)基因在ELP位點(diǎn)處導(dǎo)入植物基因組中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以經(jīng)由常規(guī)育種獲得期望的性狀，該性狀可以由通過ELP位點(diǎn)處的靶向性重組插入的ー種或多種核酸分子賦予。依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是能夠用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的任何植物。因而，植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。在本方法中可用的雙子葉植物的非限制性例子包括苜猜、豆、花莖甘藍(lán)(broccoli)、甘藍(lán)(cabbage)、胡蘿卜、花椰菜、斧菜、白菜(Chinesecabbage)、棉、黃瓜、爺子、萵苣、甜瓜(melon)、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜、蘿卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜、甜菜、向日葵、煙草、番茄和西瓜。本方法中可用的單子葉植物的非限制性例子包括玉米、洋蔥、稻、高粱、小麥、黒麥、黍(millet)、甘蔗、燕麥、黑小麥、柳枝稷和草地草(turfgrass)?？梢砸匀魏畏绞绞褂没蛟耘嘁勒毡景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，其中ELP和/或感興趣的核酸分子是想要的。因而，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法工程化改造為具有一種或多種期望的性狀等(通過用依照本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化)，種植并栽培。
實(shí)施例包括以下實(shí)施例以例示本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，實(shí)施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本發(fā)明中運(yùn)行良好的技木。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)可以在不偏離本發(fā)明范圍的前提下對(duì)公開的具體實(shí)施方案做出許多變化，并且仍獲得相似或類似的結(jié)果。更具體地，會(huì)顯而易見的是，可以用化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些藥劑替換本文中描述的藥劑，同時(shí)會(huì)實(shí)現(xiàn)相同或類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類相似替代和修改視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如所附權(quán)利要求書限定的。
實(shí)施例I :載體構(gòu)建合成兩種不同ELP，其由Ikbp 5’同源性區(qū)(pDAB100610/pDAB100640中的“工程化降落場(chǎng)區(qū)1”(SEQ ID NO: 11)和pDAB100611/pDAB100641中的“工程化合成同源性區(qū)3”(SEQID NO: 12))和Ikbp 3，同源性區(qū)(pDAB100610中的“工程化降落場(chǎng)區(qū)2” (SEQ ID NO: 13)和pDAB100611/pDAB100641中的“工程化合成同源性區(qū)4”(SEQ ID NO: 14))組成。這些同源性區(qū)以兩種不同EXZACT鋅指核酸酶(eZFN)結(jié)合位點(diǎn)分開。使用GATEWAY LR 克隆酶反應(yīng)(Invitrogen，Carlsbad, CA)將分別用于pDAB100610和pDAB100611 的兩種ELP(稱作ELPl(SEQ ID NO: 15)和ELP2(SEQ ID NO: 16))轉(zhuǎn)移到pDAB100704,即一種源自pSBll的目的超ニ兀載體(destination superbinaryvector) (W094/00977 和 W095/06722)中。pDAB100704 含有 ZmUbil 啟動(dòng)子(源自玉蜀黍(Zea mays)泛素I啟動(dòng)子的啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)(UTR)和內(nèi)含子(Christensen等，(I992) Plant Molecular Biology, 18 (4) ; 675-89))、AAD-1 選擇標(biāo)志基因(即ー種來自Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291)的芳氧基鏈燒酸酯(aryloxyalkanoate)加雙氧酶基因的合成的經(jīng)植物優(yōu)化的型式，所述芳氧基鏈烷酸酯加雙氧酶基因編碼具有賦予對(duì)芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑的抗性的alpha酮戍ニ酸依賴性加雙氧酶活性的酶(W02005/107437、WO 2008/141154A2 和 US 2009/0093366，通過述及將每篇并入本文)、和ZmLip 3’UTR(包含玉蜀黍LIP基因的轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)(UTR)；GenBank 登錄號(hào) L35913)。使用GATEWAY LR 克隆酶反應(yīng)(Invitrogen，Carlsbad, CA)將分別用于PDAB100640 和 pDAB100641 的兩種 ELP (分別稱作 ELPl (SEQ ID NO: 15)和 ELP2 (SEQ IDNO: 16))轉(zhuǎn)移到pDAB101849，即ー種ニ元載體中。pDAB101849含有OsActl啟動(dòng)子(源自稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子和內(nèi)含子(美國(guó)專利No. 5641876))、pat選擇標(biāo)志基因(草月安月粦(phosphinothricin)こ酸基轉(zhuǎn)移酶基因；Wohlleben 等，(1988) Gene 70:25-37)、和ZmLip 3’UTR(包含玉蜀黍LIP基因的轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)(UTR)；GenBank 登錄號(hào) L35913)。將所得的克隆pDAB100610(圖 I)、pDAB100611(圖 2)、pDAB100640(圖 3)和PDAB100641 (圖4)進(jìn)行序列證實(shí)。將pDAB100610和pDAB100611載體轉(zhuǎn)移到含有pSBl ニ元載體的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404中，并經(jīng)由同源重組將T鏈區(qū)整合入PSBl中。將pDAB100640和pDAB100641載體轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。通過限制酶消化確認(rèn)每種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。通過在ELPl和ELP2的5’和3’同源性區(qū)的截短型式(稱為型式2(v2))間插入YFP表達(dá)盒和PAT或AAD-I表達(dá)盒裝配含有感興趣的核酸分子(供體DNA)的載體。PAT表達(dá)盒含有用于表達(dá)pat基因(草胺膦こ酰基轉(zhuǎn)移酶基因；Wohlleben等，(1988)Gene 70:25-37)的OsActl啟動(dòng)子(稻肌動(dòng)蛋白I啟動(dòng)子；McElroy等，(1990) Plant Cell 2:163-171)及其側(cè)翼的ZmLip 3’非翻譯區(qū)。AAD-I表達(dá)盒含有驅(qū)動(dòng)aad_l基因的ZmUbi I啟動(dòng)子和ZmPer5 3’UTR(美國(guó)專利No. US 6384207)。YFP表達(dá)盒由用于驅(qū)動(dòng)PhiYFP基因(黃色熒光蛋白(美國(guó)專利申請(qǐng)US2007/0298412))表達(dá)的ZmUbil啟動(dòng)子及其側(cè)翼的ZmPer53’UTR (美國(guó)專利 No. US 6384207)組成。將PAT和YFP表達(dá)盒在ELPl中的“工程化降落場(chǎng)區(qū)I ”和“工程化降落場(chǎng)區(qū)2”的 截短型式間克隆(PDAB105955，圖5)?；蛘撸瑢AT和YFP表達(dá)盒在ELP2中的“工程化同源區(qū)3”和“工程化同源區(qū)4”的截短型式間克隆(PDAB105956，圖6)。同樣地，將AAD-I和YFP表達(dá)盒在ELPl中在“工程化降落場(chǎng)區(qū)I”的截短型式和“工程化降落場(chǎng)區(qū)2”的截短型式間克隆(PDAB105979，圖7)?；蛘?，將AAD-I和YFP表達(dá)盒在ELP2中在“工程化同源區(qū)3”的截短型式和“工程化同源區(qū)4”的截短型式間克隆(pDAB105980，圖8)。將供體DNA構(gòu)建體克隆入ニ元載體中以進(jìn)行生物射彈、晶須(WHISKERS)或土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。另外，可以將DNA構(gòu)建體克隆入高拷貝數(shù)質(zhì)粒(例如攜帯ColEl復(fù)制起點(diǎn)的PBR322衍生物)中以生成用于直接DNA投遞轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。實(shí)施例2 :晶須介導(dǎo)的DNA投遞生成玉米的胚胎發(fā)生Hi-II細(xì)胞培養(yǎng)物，如記載于美國(guó)專利No. 7，179,902的，并用作例示靶向性整合的活植物細(xì)胞的來源。使用含有AAD-I植物選擇標(biāo)志盒和分別來自pDAB100610和pDAB100611的ELPl和ELP2的片段和含有PAT植物選擇標(biāo)志盒和分別來自pDAB100640和pDAB100641的ELPl和ELP2的片段來生成轉(zhuǎn)基因事件。分離并表征轉(zhuǎn)基因事件。然后，使用同源性指導(dǎo)的同源重組靶向這些事件，其中感興趣的核酸分子可以在工程化降落場(chǎng)內(nèi)整合。將加上28mL條件化培養(yǎng)基的12mL壓緊細(xì)胞體積(packed cell volume, PCV)的來自先前冷凍保存的細(xì)胞系傳代培養(yǎng)入500mL錐形瓶中的80mL GN6液體培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu 等，(1975) Sci Sin. 18:659-668)、2. Omg/L 2，4_D、30g/L 蔗糖，pH 5.8)中，并在搖動(dòng)器上于28°C以125rpm放置。使用相同細(xì)胞系將此步驟重復(fù)兩次，使得將總共36mL PCV在三個(gè)燒瓶間分配。在24小時(shí)后，將GN6液體培養(yǎng)基除去，并用72mL GN6 S/M滲透培養(yǎng)基(N6 培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4_D、30g/L 蔗糖、45. 5g/L 山梨糖醇、45. 5g/L 甘露醇、100mg/L 肌肉肌醇，pH 6.0)替換。將燒瓶在黑暗中于28°C以中等攪動(dòng)(125rpm)的情況中溫育30-35分鐘。在溫育期期間，通過將8. ImL GN6 S/Μ液體培養(yǎng)基添加至405mg無菌碳化硅晶須來制備 50mg/mL 碳化娃晶須(Advanced Composite Materials, LLC, Greer, SC)懸浮液。在GN6 S/M滲透培養(yǎng)基中溫育后，將每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物合并入250mL離心瓶中。在燒瓶中的所有細(xì)胞沉積至底部后，將超過約14mL的內(nèi)容物體積的GN6 S/Μ液體抽取，并在無菌I-L燒瓶中收集，供未來使用。將晶須的預(yù)先濕潤(rùn)的懸浮液在渦旋上以最大速度混合60秒，然后添加至離心管。將170μ g來自PDAB100610或PDAB100611質(zhì)粒DNA的純化片段添加至每瓶。一旦添加DNA,立即將瓶在改良的Red Devil 5400商業(yè)涂料混合機(jī)(Red Devil EquipmentCo.，Plymouth, MN)中放置，并攪動(dòng)10秒。在攪動(dòng)后，將細(xì)胞、培養(yǎng)基、晶須和DNA的混合物與125mL新鮮的GN6液體培養(yǎng)基一起添加至1_L燒瓶?jī)?nèi)容物以減少滲壓劑(osmoticant)。容許細(xì)胞在設(shè)置于125rpm的搖動(dòng)器上恢復(fù)2小吋。使用與房屋真空線連接的玻璃細(xì)胞收集器單元將6毫升分散的懸浮液過濾到Whatman#4濾紙(5. 5cm)上，使得每瓶獲得60升。將濾紙放到GN6固體培養(yǎng)基(與GN6液體培養(yǎng)基相同，除了具有2. 5g/L Gelrite膠凝劑)的60x20mm板上，并于28°C在黑暗條件下培養(yǎng)I周。實(shí)施例3 :推定的轉(zhuǎn)基因事件的鑒定和分離DNA投遞后一周，將濾紙轉(zhuǎn)移到含有合適的選擇劑的GN6(1H)選擇培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4-D、30g/L 蔗糖、100mg/L 肌肉肌醇、2. 5g/L Gelrite, pH 5.8)的 60x20mm 板。將這些選擇板于28°C在黑暗中溫育I周。在黑暗中選擇I周后，通過將1/2的細(xì)胞從每塊板刮到含有于37-38°C保持的3. OmL GN6瓊脂糖培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2. 0mg/L 2，4_D、30g/L蔗糖、100mg/L肌肉肌醇、7g/L SEAPLAQUE 瓊脂糖，pH 5. 8，于121°C高壓滅菌10分鐘)的管中將組織包埋到新鮮培養(yǎng)基上。用刮刀打碎瓊脂糖/組織混合物，隨后，將3mL瓊脂糖/組織培養(yǎng)物均勻地倒入含有GN6 (IH)培養(yǎng)基的100x15mm培養(yǎng)皿的表面上。對(duì)每塊板的兩半都重復(fù)此過程。一旦將所有組織包埋，將板單獨(dú)用NESCOF丨LM 或PARAF丨L.M M密封，并于28°C在黑暗條件下培養(yǎng)多至10周。將在這些選擇條件下生長(zhǎng)的推定的轉(zhuǎn)化隔離群自包埋板取出，并轉(zhuǎn)移到60x20mm板中的新鮮選擇培養(yǎng)基。若持續(xù)生長(zhǎng)在約2周后是明顯的，則將事件視為對(duì)應(yīng)用的除草劑(選擇劑)有抗性，并且隨后收獲細(xì)胞的等分試樣以進(jìn)行基因型分析。實(shí)施例4 :事件的分子表征基因組DNA提取。將基因組DNA(gDNA)自分離的玉米細(xì)胞分離，并作為模板用于PCR基因型分型實(shí)驗(yàn)。自約100-300 μ I壓緊細(xì)胞體積(PCV)的依照DNEASY 96植物試劑盒(QIAGENInc. , Valencia, CA)中詳述的制造商的方案分離的Hi-II愈傷組織提取gDNA。將基因組DNA在100 μ I試劑盒供應(yīng)的稀釋緩沖液中稀釋，產(chǎn)生20-200ng/μ L的終濃度，隨后經(jīng)由基于PCR的基因型分型方法分析?？截悢?shù)的分子分析。使用L.IGHTCYCLER480 系統(tǒng)(RocheApplied Science, Indianapolis, IN)通過實(shí)時(shí)PCR實(shí)施通過與TAQMAN 測(cè)定法類似的水解探針測(cè)定法的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)測(cè)定。使用LIGHTCYCLER 探計(jì)設(shè)汁軟件2. O對(duì)AAD-I和PAT基因和內(nèi)部參照基因設(shè)計(jì)測(cè)定法。對(duì)于擴(kuò)増，將LIGHTCYCLER 480探針Master混合物(Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)以Ix終濃度在含有0. 4 μ M姆種引物和0. 2 μ M姆種探針的10 μ L體積多重反應(yīng)中制備。在熒光采集的情況中實(shí)施兩步擴(kuò)增反應(yīng)，其中于58°C延伸38秒。將所有樣品一式三份運(yùn)行，并使用平均循環(huán)閾值(Ct)數(shù)值來分析每份樣品。使用LightCycler 軟件第I. 5版使用相對(duì)定量模塊實(shí)施對(duì)實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的分析，并且其基于Δ ACt方法。對(duì)于這點(diǎn)，來自單拷貝校準(zhǔn)物和已知的2個(gè)拷貝檢驗(yàn)(check)的基因組DNA的樣品包含在每次運(yùn)行(與用于上述Invader 測(cè)定法的那些運(yùn)行相同)中。然后，通過此數(shù)據(jù)，對(duì)每份樣品評(píng)估表觀AAD-I或PAT拷貝數(shù)。用于PCR基因型分型的引物設(shè)計(jì)。將寡核苷酸引物在標(biāo)準(zhǔn)脫氧條件下合成(例如，Integrated DNATechnologies, Inc. (Coralville, ΙΑ))，并用水稀釋至100 μ M的濃度。將寡核苷酸引物設(shè)計(jì)為與DNA插入物的末端區(qū)退火。在存在自非轉(zhuǎn)基因生物體分離的DNA的情況中使用質(zhì)粒DNA的稀釋液測(cè)試引物。使用引物自推定事件的基因組DNA PCR擴(kuò)增pDAB100610、pDAB100611、pDAB100640和pDAB100641的插入物。將所得的片段克隆入質(zhì)粒載體中，并測(cè)序以確認(rèn)工程化降落場(chǎng)在轉(zhuǎn)化期間完全整合入植物基因組中。Southern 印跡分析。實(shí)施Southern分析以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。對(duì)于此分析，將基因組DNA用合適的限 制酶消化并探査。將通過基因座特異性PCR鑒定為含有推定的ELP的玉米組織進(jìn)行Sothern印跡分析。對(duì)于Southern分析,將組織樣品在2ml eppendorf管中收集，并凍干2天。用Kleco組織粉碎機(jī)和鎢珠(Kleco，Visalia，CA)實(shí)施組織浸潰。在組織浸潰后，使用DNeasy植物迷你試劑盒(Qiagen, Germantown, MD)依照制造商提示的方案分離基因組DNA。通過Quant-IT Pico Green DNA 測(cè)定試劑盒(MolecularProbes, Invitrogen, Carlsbad, CA)量化基因組DNA。將量化的DNA調(diào)節(jié)至4μ g以進(jìn)行Southern印跡分析，并使用合適的限制酶于37°C消化過夜。使用Quick-Precip (EdgeBioSystem, Gaithersburg, MD)依照制造商提示的方案純化經(jīng)消化的DNA。將沉淀的DNA在IOX染料中重懸，并在O. 8%SeaKem LE瓊脂糖凝膠(Lonza, Rockland, ME)上以40伏特進(jìn)行電泳達(dá)17小時(shí)。將DNA過夜轉(zhuǎn)移到尼龍帶電荷膜O (Millipore，Bedford，MA)，并使用 UV Strata 連接儀(linker) 1800 (Stratagene, La Jolla, CA)與膜交聯(lián)。將印跡與2OmL PerfectHyb Plus (Sigma, St. Louis, MO)預(yù)雜交，并用合適的放射性標(biāo)記的探針探查過夜。將印跡清洗，并在磷光體圖像屏(phosphor image screen)上放置24小時(shí),然后使用 ST0RMTM 860 掃描儀(Molecular Dynamics)分析。實(shí)施例5 :選擇具有插入DNA的轉(zhuǎn)基因事件如上文所描述，通過水解探針測(cè)定法和PCR對(duì)事件篩選含有AAD-I或PAT基因盒的完整植物轉(zhuǎn)錄單元(PTU)和完整ELP。用AAD-I和PAT基因和ELP探針使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過Southern分析進(jìn)ー步確認(rèn)拷貝數(shù)。維持來自含有來自pDAB100610和pDAB100611的單拷貝、完整插入物的選定轉(zhuǎn)基因事件的愈傷組織，隨后測(cè)試AAD-I基因的表達(dá)。使用AAD-IqRT-PCR法和ELISA (下文)的篩選鑒定出表達(dá)AAD-I的事件。對(duì)AAD-I表達(dá)事件的qRT-PCR分析。使用定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)量化AAD-I基因表達(dá)的mRNA表達(dá)。開發(fā)通過相對(duì)于來自內(nèi)部參照基因的mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化這些水平來量化來自轉(zhuǎn)基因Hi-II愈傷組織樣品的相對(duì)AAD-I mRNA表達(dá)的測(cè)定法。相對(duì)于來自內(nèi)部參照基因的mRNA標(biāo)準(zhǔn)化AAD-I mRNA容許比較不同樣品間的AAD-I表達(dá)，并且可以用于鑒定表現(xiàn)為高度表達(dá)的事件。使用Qiagen RNeasy 96試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)自新鮮的愈傷組織制備總RNA。用無RNA酶的DNA酶依照試劑盒的用法說明書處理RNA以除去任何基因組DNA污染物。依照Superscript⑩III逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)制造商的用法說明書建立第一條鏈合成，并使用隨機(jī)六聚體引發(fā)。將合成的cDNA鏈在水中以1:10和1:50的比率稀釋(這提供足夠的模板以PCR擴(kuò)增多種靶物)。將每份等分試樣于20°C無限期保存。為了擴(kuò)增AAD-I cDNA如下設(shè)立qRT-PCR反應(yīng)混合物7. 5μ L 2Χ LC480探針Master緩沖液(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)、0· 3 μ L 來自 10 μ M 儲(chǔ)液的基因特異性正向引物、O. 3 μ L來自10 μ M儲(chǔ)液的基因特異性反向引物、來自LightCyc丨er 480探針Master, RocheDiagnostic, Indianapolis, IN)的 O. 15 μ L UPL 探針，1. 5μ 10%(w/v)聚こ烯批咯燒酮-40 (PVP-40)和 3. 9 μ L 水。UPL 探針(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)是一種鎖定核酸，并且因此比其它方式計(jì)算的Tm具有更高的Tm。在處理標(biāo)準(zhǔn)品和未知物前將所有組分放回冰箱中。將384孔微量板劃界并標(biāo)記，每孔添加13. 5 μ LMaster混合物。將密封箔溫和附著于微量板。將板以3，OOOrpm在Qiagen微量板離心機(jī)中離心I分鐘。添加1.5yL融化的、稀釋的合成的cDNA鏈。另外，將I. 5μ L質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品以最低至最高濃度的稀釋系列添加至不同孔，將這些標(biāo)準(zhǔn)品與AAD-I cDNA(自總mRNA合成)比較以定量拷貝數(shù)。通過將祀擴(kuò)增子克隆入pCR2. I質(zhì)粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，并生成稀釋系列以量化拷貝數(shù)來生成AAD-I DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品系列。將箔封條穩(wěn)固地附于板并離心，如先 前所描述的。實(shí)施PCR程序，并在實(shí)時(shí)PCR儀LC480 (Roche, Indianapolis, IN)或等同物中擴(kuò)增DNA。實(shí)施例6 :通過ELISA測(cè)定玉米組織中的AAD-I蛋白開發(fā)使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)技術(shù)定量測(cè)定玉米愈傷組織中的AAD-I蛋白的方法?？梢允褂帽疚闹兴枋龅姆椒▉頇z測(cè)AAD-I蛋白并分析來自轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織的植物組織樣品。用基于含有0.05%TWeen 20 (PBST)，并且可能含有牛血清清蛋白、蛋白酶抑制劑或抗壞血酸的磷酸鹽緩沖鹽水溶液的愈傷組織特異性緩沖液自玉米樣品提取AAD-I蛋白。將提取物離心；將水性上清液收集、稀釋并使用特異性AAD-I ELISA測(cè)定。在此測(cè)定法中應(yīng)用同時(shí)三明治式ELISA形式。將稀釋樣品的等分試樣和生物素化的抗AAD-I單克隆抗體(單抗473F185)在用固定化的抗AAD-I單克隆抗體(單抗473H274)包被的微量滴定板的孔中溫育。這些抗體與孔中的玉米表達(dá)的AAD-I蛋白結(jié)合以與可溶的和固定化的抗體間結(jié)合的AAD-I蛋白形成“三明治”。然后，通過用PBST清洗自板除去未結(jié)合的樣品和綴合物。將過量的鏈霉抗生物素蛋白-酶(堿性磷酸酶)綴合物添加至孔以進(jìn)行溫育。通過將酶綴合物與酶底物一起溫育；生成有色產(chǎn)物檢測(cè)AAD-I的存在。因?yàn)锳AD-I在抗體三明治中結(jié)合，所以顯色的水平與樣品中的AAD-I濃度成比例(S卩，較低的蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致較低的顯色)。使用讀板儀測(cè)量于405nm的吸光度。將高表達(dá)AAD-I事件自選擇的轉(zhuǎn)基因事件鑒定并維持以進(jìn)行隨后用供體DNA的靶向。實(shí)施例7 生物射彈介導(dǎo)的DNA對(duì)含有ELP的植物細(xì)胞的投遞再生具有靶DNA的轉(zhuǎn)基因事件再生來自確認(rèn)為低拷貝且含有完整PTU的pDAB100160和pDAB100611的事件以生成未成熟的胚供體材料以進(jìn)行靶向。首先將健康的生長(zhǎng)組織轉(zhuǎn)移至28+100吡氟氯禾靈(MS培養(yǎng)基(Murashige 和 Skoog (1962) Physiol Plantl5:473-497)、0· 025mg/L 2，_4D、5mg/LBAP、0.0362mg/L 吡氟氯禾靈、30g/L 蔗糖、2.5g/L gelrite, pH 5. 7)，并在低光照(14 μ E/m2 ·秒16小時(shí)光周期)中溫育7天，接著高光照(89 μ E/m2 ·秒16小時(shí)光周期)再溫育7天。將變綠的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至36+100吡氟氯禾靈(與28+100吡氟氯禾靈相同，減去BAP和2，4-D)，并在高光照(40 μ E/m2·秒16小時(shí)光周期)中溫育，直至枝條結(jié)構(gòu)形成足夠的根以移植到溫室。使用95%Metro-Mix 360 和5%粘土 /壤土的混合物在溫室中將植物培養(yǎng)至成熟，并根據(jù)植物健康傳粉。將有力生長(zhǎng)的植物自交或同胞雜交(sib)(來自同一事件的植物)，并將不太有力的植物與Hi-II、A188或B104雜交以維持供體材料的胚胎發(fā)生能力。實(shí)施例8 生物射彈介導(dǎo)的DNA對(duì)含有ELP的植物細(xì)胞的投遞自pDAB100610和pDAB100611生成的事件的靶向。使用兩種不同轉(zhuǎn)化方案完成供體序列的靶向。對(duì)于含有AAD-I作為選擇標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因完整ELP事件(pDAB100610和pDAB100611事件)，經(jīng)由生物射彈介導(dǎo)的DNA對(duì)愈傷組織形成前(pre-calIused)未成熟胚的投遞實(shí)施革巴向。傳粉后10-13天收獲大小I. 2-2. Omm 的胚，并將其分配到N6E培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4_D、2.8 g/L L-脯氨酸、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、100 mg/L肌肉肌醇、4. 25mg/L硝酸銀、30g/L蔗糖，pH 5. 8)上，并于28°C在黑暗中溫育2-3天。將溶脹的胚轉(zhuǎn)移到填充Whatman#4濾紙上2. 5cm直徑圓的N60SM (與N6E相同，其中添加36. 4g/l山梨糖醇、36. 4g/L甘露醇和降低至O. 7g/L的L-脯氨酸)。使用1，OOOym屏，含有供爆破(blasting)用的胚，并將胚在黑暗中于28°C溫育4小時(shí)，之后進(jìn)行爆破。為了用DNA包被生物射彈顆粒，將3mg O. 60微米直徑金顆粒用100%こ醇清洗一次，用無菌蒸餾水清洗兩次，并在50 μ I水中在硅化處理的微離心(microfuge)管中重懸。將總共5 μ g質(zhì)粒DNA，編碼鋅指核酸酶和供體DNA片段的不同載體；pDAB105955或PDAB105956) ,20 μ I亞精胺(0. 1Μ)和50 μ I氯化鈣(2. 5Μ)分開添加至金懸浮液，并在旋渦上混合。將混合物于室溫溫育10分鐘，以10，OOOrpm在臺(tái)上(benchtop)微離心機(jī)中沉淀10秒,在60 μ I冷100%こ醇中重懸，并將8_9 μ I分配到姆個(gè)巨載體(macrocarrier)上。使用生物射彈FOS-IOOO/HE 系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)發(fā)生轟擊。將含有胚的板在中間架上在650psi和27英寸Hg++真空的條件下放置，并遵照參照手冊(cè)轟擊一次。轟擊后24小時(shí)，將胚直接轉(zhuǎn)移(無濾紙)到N6E(與上文相同)以進(jìn)行恢復(fù)，并于28°C在黑暗中溫育13天。每2周將胚轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基N6S(N6培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4-D、100mg/L 肌肉肌醇、0. 85mg/L 硝酸銀、2 mg/L 雙丙氨膦(bialaphos)、30g/L 鹿糖、
2.5g/L gelrite，且pH 5. 8)，在選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移3次，并于28v°C在黑暗條件下溫育多至10周。將在這些選擇條件下生長(zhǎng)的推定地轉(zhuǎn)化的隔離群自包埋板取出，并轉(zhuǎn)移到60x20_板中的新鮮的選擇培養(yǎng)基。若持續(xù)生長(zhǎng)在約2周后是明顯的，則事件被視為對(duì)應(yīng)用的除草劑(選擇劑)有抗性，并且隨后收獲細(xì)胞的等分試樣以進(jìn)行基因型分析(下文所描述的分析)。自pDAB100640和pDAB100641生成的事件的靶向。對(duì)于含有PAT作為選擇標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因完整ELP事件(pDAB100640和pDAB100641)，經(jīng)由生物射彈介導(dǎo)的DNA對(duì)胚胎發(fā)生玉米愈傷組織的投遞實(shí)施靶向。傳代培養(yǎng)后6至8天，將胚胎發(fā)生玉米組織((約0. 4mL PCV的細(xì)胞)在100x15mm培養(yǎng)皿上放置的Whatman#4濾紙上方的直徑2. 5cm的圓中薄層涂布，所述培養(yǎng)皿含有用2. 5g/L gelrite凝固的GN6 S/M培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4_D、30g/L蔗糖、45. 5g/L山梨糖醇、45. 5g/L甘露醇、IOOmg/L肌肉肌醇，pH 5. 8)。將細(xì)胞在黑暗條件下溫育4小吋。制備DNA以進(jìn)行爆破，如先前所描述的，使用PDAB105979和pDAB105980進(jìn)行靶向。使用生物射彈F*DS-1000/HETM系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)發(fā)生轟擊。將含有細(xì)胞的板在中間架上在1，IOOpsi和27英寸Hg++真空的條件下放置，并遵照參照手冊(cè)■轟擊一次。轟擊后24小時(shí),將含有植物細(xì)胞的濾紙轉(zhuǎn)移到用2. 5g/L Gelrite凝固的GN6固體培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4-DU00mg/L肌肉肌醇、30g/L蔗糖，pH 5. 8)，并于28°C在黑暗條件下溫育24小吋。在24小時(shí)恢復(fù)期后，將含有植物細(xì)胞的濾紙轉(zhuǎn)移到GN6+100 吡氟氯禾靈(N6 培養(yǎng)基、2. Omg/L 2，4_D、100mg/L肌肉肌醇、30g/L蔗糖、0. 0362mg/L批氟氯禾靈、2. 5g/L Gelrite, pH5. 8),將細(xì)胞在濾紙上在薄層中涂開。姆2周在選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)轉(zhuǎn)移，達(dá)3次轉(zhuǎn)移。將組織溫育多至12周，直至源自供體DNA整合的推定的轉(zhuǎn)基因隔離群開始出現(xiàn)。將在這些選擇條件下生長(zhǎng)的推定地轉(zhuǎn)化的隔離群自包埋板取出，并轉(zhuǎn)移到60x20mm板中的新鮮的選擇培養(yǎng)基。若持續(xù)生長(zhǎng)在約2周后是明顯的，則事件被視為對(duì)應(yīng)用的除草劑(選擇劑)有抗性，并且隨后收獲細(xì)胞的等分試樣以進(jìn)行基因型分析(下 文所描述的分析)。實(shí)施例9 :經(jīng)由PCR基因型分型篩選靶向性整合事件通過使用I)基因座特異性PCR ；2)供體特異性TaqMan，和；3)基因座特異性Southern 印跡的組合分析供體分子(pDAB105979, pDAB105980, pDAB105955, pDAB105956)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中ELP的靶向以評(píng)估插入物精確性、完整性和拷貝數(shù)。預(yù)期陽性再靶向事件具有a)陽性輸出-輸出(out-out) PCR或重疊的輸入-輸出(in-out) PCR結(jié)果和2)供體存在診斷性Southern圖像。DNA 提取將來自再靶向轉(zhuǎn)基因玉米的組織(愈傷組織或植物葉)在96孔收集板(Qiagen, Germantown, MD)中凍干至少2天。使用BioSprint 96エ作站(Qiagen, Germantown, MD)遵循制造商的用法說明書自凍干的組織提取DNA,并在200 μ I水中重懸。使用2-96Α型Kleco組織粉碎機(jī)(Garcia Manufacturing, Visalia CA)進(jìn)行組織破壞。DNA 量化使用 QUANT-IT Pico Green DNA 測(cè)定試劑盒(MolecularProbes, Invitrogen. Carlsbad, CA)量化所得的基因組DNA。使用范圍為20ng/ μ L至1.25ng/yL(連續(xù)稀釋的)的5種預(yù)先量化的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線生成。首先將未知的樣品以1:10或1:20稀釋度稀釋至測(cè)定法的線性范圍內(nèi)。將5 μ L稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品與100 μ L稀釋的Pico Green底物(1:200)混合，并在黑暗中溫育10分鐘。然后，使用Synergy2讀板儀(Biotek)記錄突光?；蚪MDNA濃度自背景突光校正后計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估。隨后，使用Biorobot-3000自動(dòng)化液體處理器(Qiagen, Germantown, MD)相對(duì)于2 ng/μ L的濃度標(biāo)準(zhǔn)化DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)化的DNA進(jìn)行PCR和拷貝數(shù)分析。PCR 分析實(shí)施這些類型的基因座特異性PCR(輸出-輸出、5’輸出-輸入(out_in)、3’輸出-輸入)以評(píng)估供體質(zhì)粒是否靶向至ELP。實(shí)施PCR反應(yīng)以調(diào)查供體DNA的完整拷貝的存在(out-out PCR)。其它PCR反應(yīng)聚焦于靶物與供體間的5’邊界和供體與靶物間的3’邊界(輸入-輸出PCR)。圖9中例示了具有用于分析的引物的位置的示意圖。表I中概述了每種供體和ELP靶物的預(yù)期PCR產(chǎn)物。表2中顯示了用于分析的引物的序列。
表I :用于靶向性供體整合分析的基因座特異性PCR的預(yù)期擴(kuò)增子大小。
預(yù)期的擴(kuò) 靶ELP質(zhì)粒ID__再靶向供體__引物* 增子(kB)
610F-611R 8.5
pDAB 100640pDAB 105979610-YFP3.5
sLPlL-YFP-AADi-sLPIR YFP-6115.4
611/6117,6
pDAB100641pDAB 105980611/YFP4.4
__SLP2L-YFP-AADI-sLP2R YFP/611__3.5
610F-611R8.5
pDAB 106685pDAB 105979610-YFP3 ·5
__sLP IL-YFP-AADI -sLP IR YFP-611__5.4
_2]611/6117.6
pDAB 106686pDAB105980611/YFP4.4
__SLP2L-YFP-AADI -sLP2R YFP/611__3.5
610F-611R 8.5
pDAB100610pDAB 105955610-YFP3.5
__sLP I L-YFP-PAT-sLP IR YFP-611__5.4
611/6117.6
pDAB 丨 00611pDAbl05956611/YFP4.4
_ sLP2L-YFP-PAT-sLP2R | YFP/611 | 3.5
*列出的引物為了進(jìn)行輸出-輸出 5'輸入-輸出 3’輸出-輸入表2 :用于靶向性整合分析的引物的序列寡聚物SEQ ID NO:__
權(quán)利要求
1.一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物或植物組織的方法，該方法包括 提供核酸分子，該核酸分子包含與植物細(xì)胞的基因組DNA基本上缺乏序列同源性的至少兩個(gè)核酸序列區(qū)和至少ー個(gè)靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏基本的性序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)在所述至少ー個(gè)靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)側(cè)翼； 用所述核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞或包含所述植物細(xì)胞的植物組織，其中所述核酸分子穩(wěn)定整合入所述植物細(xì)胞的基因組中；并 自用所述核酸分子轉(zhuǎn)化的所述植物細(xì)胞生成植物組織或再生植物。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸分子進(jìn)ー步包含不同限制性位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述不同限制性位點(diǎn)包含相容的單鏈末端，其容許多個(gè)ELP的連環(huán)化。
4.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)不包含可讀框。
5.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少ー個(gè)核酸序列區(qū)不包含可讀框。
6.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)是約50bp至約3kb。
7.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)選自下組中的ー種或多種序列ID NO I到10。
8.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)和靶向性內(nèi)切核酸酶包含序列ID 15和16。
9.權(quán)利要求I的方法，其中與所述植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的所述至少兩個(gè)核酸序列區(qū)和靶向性內(nèi)切核酸酶包含并入用于轉(zhuǎn)化單子葉植物、雙子葉植物，包括蕓苔的植物轉(zhuǎn)化載體 pDAB104137、pDAB104139、pDAB104141、或 pDAB104143 中的序列 ID 15和16。
10.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述靶向性內(nèi)切核酸酶是鋅指核酸酶。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸分子在所述植物細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定地隨機(jī)整ムロ ο
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸分子在所述植物細(xì)胞的基因組中在ー個(gè)或多個(gè)已知靶位點(diǎn)處穩(wěn)定整合。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸分子穩(wěn)定整合入染色體或微型染色體的擴(kuò)增區(qū)中。
14.通過權(quán)利要求I的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物組織或植物。
15.由權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物生成的種子。
16.一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括 提供自權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物組織或植物分離的細(xì)胞或組織； 提供至少ー種靶向性內(nèi)切核酸酶或包含編碼所述至少ー種靶向性內(nèi)切核酸酶的核酸序列的第一核酸分子，其中所述至少ー種靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因植物的基因組中的至少ー個(gè)靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；提供第二核酸分子，其包含感興趣的核酸序列和在所述感興趣的核酸序列側(cè)翼的兩個(gè)額外的核酸序列，其中所述兩個(gè)額外的核酸序列各與同基因組DNA缺乏序列同源性的兩個(gè)核酸序列區(qū)之一同源； 將(i)所述至少ー種靶向性內(nèi)切核酸酶或所述第一核酸分子；和(ii)所述第二核酸分子導(dǎo)入所述植物細(xì)胞或組織中，其中所述感興趣的核酸序列穩(wěn)定整合入所述植物細(xì)胞的基因組中；并 自用所述第一和第二核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織再生植物。
17.通過權(quán)利要求16的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物。
18.由權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物生成的種子。
19.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸分子在姆個(gè)末端側(cè)翼有ー個(gè)或多個(gè)額外的革巴向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。
20.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)ー步包括將識(shí)別所述ー個(gè)或多個(gè)額外的靶向性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的ー種或多種靶向性內(nèi)切核酸酶導(dǎo)入所述植物組織或植物中，其中自所述植物組織或植物的基因組切除所述核酸分子。
21.依照權(quán)利要求16的方法，其中所述靶向性內(nèi)切核酸酶是鋅指核酸酶。
全文摘要
一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提供包含與植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的至少兩個(gè)核酸序列區(qū)和至少兩個(gè)鋅指核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的核酸分子，其中與植物細(xì)胞的基因組DNA缺乏序列同源性的至少兩個(gè)核酸序列區(qū)在至少兩個(gè)鋅指核酸酶識(shí)別位點(diǎn)側(cè)翼。轉(zhuǎn)化具有穩(wěn)定整合入植物細(xì)胞的基因組中的核酸分子的植物細(xì)胞或組織。自植物細(xì)胞再生植物。通過所述方法生成轉(zhuǎn)基因植物。通過轉(zhuǎn)基因植物生成種子。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102821598SQ201180015548
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者W.M.安利, R.C.布魯, M.G.莫雷, D.R.科賓, R.R.邁爾斯, S.R.韋布 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司