靶向olfm4基因的干擾rna、慢病毒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種靶向OLFM4基因的干擾RNA及慢病毒載體，用于制備預防、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。本發(fā)明利用所述干擾RNA不僅具有抑制胃癌細胞的體外遷移與侵襲能力，還能具有抑制胃癌細胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力；使得減弱OLFM4表達具有潛在治療晚期胃癌惡性進展的有效方式。并進一步明確NF-kB信號為OLFM4表達的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，還具有反饋調(diào)控NF-kB信號功能。
【專利說明】靶向0LFM4基因的干擾RNA、慢病毒及其應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，主要涉及利用RNAi沉默0LFM4基因用于制備預防、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉(zhuǎn)移的藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是我國第二大常見惡性腫瘤，亦是癌癥致死的第二大原因。盡管目前胃癌綜合治療措施不斷發(fā)展完善，使得當前的治療仍不能獲得滿意效果，由于多數(shù)胃癌患者在首診時已屬中晚期，進展期胃癌占住院病例90 %以上，術(shù)后5年生存率長期徘徊在30-50 %。目前研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)惡性腫瘤治療效果不佳的主要原因在于轉(zhuǎn)移與復發(fā)。胃癌晚期，惡性癌細胞經(jīng)侵襲發(fā)生血行播散經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)移至其他器官如肝臟，導致多種臟器功能衰竭，因此胃癌侵襲與肝轉(zhuǎn)移是晚期胃癌患者死亡的最主要原因之一。由此，對于胃癌的抗轉(zhuǎn)移治療現(xiàn)狀，尋找一個治療性靶點抑制胃癌的浸潤和肝轉(zhuǎn)移，將有助于改善胃癌治療，在提高晚期胃癌患者生存率具有重要意義。
[0003]從醫(yī)學角度而言，腫瘤細胞無限制增殖是良性與惡性腫瘤的共同特征；而腫瘤的惡性侵襲與轉(zhuǎn)移則是區(qū)分良性腫瘤與惡性腫瘤的主要特征之一。惡性腫瘤最重要的生物學特點在于惡性腫瘤不僅可在原發(fā)部位浸潤生長、累及組織；而且還可通過多種途徑擴散轉(zhuǎn)移到身體其他部位。盡管侵襲和轉(zhuǎn)移均為惡性腫瘤的生長特性，但二者是不同病理過程，浸潤是轉(zhuǎn)移的前奏，但并不等于一定發(fā)生轉(zhuǎn)移，然而轉(zhuǎn)移必定包含侵襲的過程，它們共同構(gòu)成惡性腫瘤的播散。許多治療靶點對腫瘤細胞的增殖能力調(diào)控并不等同與其同時具有調(diào)控惡性侵襲與轉(zhuǎn)移能力。 目前發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤高表達蛋白如Cyclin D1，具有調(diào)控細胞周期與細胞增殖功能，但并不具有控制惡性侵襲與轉(zhuǎn)移功能。
[0004]0LFM4，又名GW112、hGC_l、h01fD，是2002年新發(fā)現(xiàn)的一種由粒細胞集落刺激因子GM-CSF刺激產(chǎn)生的具有嗅覺介導素結(jié)構(gòu)域(olfactomedin domain)蛋白家族成員分子。它最初被克隆于人的原始粒細胞，位于人類13號染色體13ql4.3，編碼510個氨基酸，其蛋白產(chǎn)物為olfactomedin4的前體,屬于嗅覺介導素olfactomedin相關蛋白家族。此類蛋白多表達于神經(jīng)系統(tǒng)，涉及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
[0005]0LFM4蛋白是一種分泌性糖蛋白，包括N-連接的碳水化合鏈和二硫化物多聚體，它與細胞表面的多種凝集素結(jié)合，如普通的凝集素1、刀豆蛋白凝集素A、麥胚凝集素。GWl 12蛋白的保守半胱氨酸對蛋白寡聚化或分泌非常重要，其中半胱氨酸83，85，246和437是蛋白二聚體形成所必需的，半胱氨酸226是多聚體形成的關鍵。0LFM4蛋白和鈣粘蛋白的相互作用，依賴于0LFM4蛋白C端的嗅覺介導素區(qū)域。0LFM4蛋白可粘附在細胞表面，增強NIH3T3和293T/17細胞的擴散和粘附作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種靶向0LFM4基因的干擾RNA在用于制備預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。[0007]本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的:
[0008]一種靶向0LFM4基因的干擾RNA，其核苷酸序列如下
[0009]正義鏈:
[0010]5' -CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTC [CTCGAG^GAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3'；
[0011]反義鏈:
[0012]5, -AATTCAAAA AAACGCTTGGAATTCACAGCTC:jCTCGAG[ GAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'。
[0013]體外合成所述述可轉(zhuǎn)錄出特異靶向0LFM4基因干擾性RNA(RNAi)的DNA序列，0LFM4 基因 RNAi 靶點 DNA 序列為:AACGCTTGGAATTCACAGCTC。干擾 RNA，下劃線部分[CTCGAG ,
所示為0LFM4基因RNAi靶點DNA序列，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄后RNA的“Stem(莖)”結(jié)構(gòu)部分；框中所示部分為6個堿基的loop環(huán)結(jié)構(gòu)，具有連接轉(zhuǎn)錄后RNA的“莖”結(jié)構(gòu)功能。
[0014]本發(fā)明進一步提供了包含上述干擾性RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。上述RNA干擾序列經(jīng)退火體外合成為雙鏈DNA，并通過兩段酶切位點連接入RNAi干擾載體，轉(zhuǎn)染或包裝入病毒并感染細胞后，在細胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄出特異抑制0LFM4基因信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄的RNAi片段，有效的降低0LFM4基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平進而對0LFM4蛋白表達進行抑制。
[0015]上述靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒載體，制備方法包括以下步驟:
[0016](I)體外合成上述DNA序列；
[0017](2)退火配對產(chǎn)生DNA雙鏈，通過兩端所含的酶切位點AgeI與EcoRI連入酶切后的GVl 15載體；
[0018](3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞，抽提DNA重組質(zhì)粒；DNA測序驗證陽性重組克??；
[0019](4) Lentivirus 病毒包裝:
[0020]①轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.2X IO7細胞/20ml，重新接種于15cm細胞培養(yǎng)皿，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細胞密度達70%~80%時即可用于轉(zhuǎn)染。細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，因此需要保證良好的細胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。
[0021]②轉(zhuǎn)染前2h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
[0022]③向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV載體20 μ g，pHelperl.0載體15 μ g，pHelper2.0載體10 μ g)，與相應體積的Opt1-MEM培養(yǎng)基混合均勻，調(diào)整總體積為2.5ml,在室溫下溫育5分鐘。
[0023]④將Lipofectamine2000 試劑輕柔搖勻，吸取 100 μ I Lipofectamine2000 試劑在另一管中與2.4ml Opt1-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。
[0024]⑤把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合。
[0025]⑥混合后,在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復合物。
[0026]⑦將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37°C,5% C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[0027]⑧培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。
[0028]⑨每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基25ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0029](5)病毒的收獲及濃縮
[0030]①收集轉(zhuǎn)染后48小時(轉(zhuǎn)染即可為O小時計起)的293T細胞上清液。
[0031]②于4°C，4000g離心10min，除去細胞碎片。
[0032]③以0.45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中。
[0033]④把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中(最多19ml)，蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。
[0034]⑤組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。
[0035]⑥在4000Xg離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15分鐘。
[0036]⑦離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。
[0037]⑧將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。
[0038]⑨離心力不超過 lOOOg，時間為2分鐘。過高轉(zhuǎn)速會導致樣品損失。把過濾杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。
[0039]⑩將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，_80°C長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。
[0040](6) Lentivirus 滴度測定
[0041]①測定前一天，為測定滴度所需的細胞(293T細胞:貼壁生長)鋪板，96孔板，每個孔加4X IO4個細胞，體積為IOOyL ；
[0042]②根據(jù)病毒的預期滴度，準備7-10個無菌的Ep管，每管加入90 μ I的無血清培養(yǎng)基。
[0043]③取待測定的病毒原液10 μ I加入到第一個管中，混勻后，取10 μ I加入到第二個
管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。
[0044]④選取所需的細胞孔，吸去90 μ I培養(yǎng)基，丟棄；加入90 μ I稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0045]⑤24小時后，加入完全培養(yǎng)基100 μ I。小心操作，不要吹起細胞。
[0046]⑥4天后，觀察熒光表達情冴觀察熒光表達情況。熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。
[0047]⑦滴度計算:根據(jù)熒光圖片中GFP表達情況。
[0048]上述干擾性RNA或慢病毒在制備用于預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
[0049]上述干擾性RNA或慢病毒在制備用于抑制NF-KB信號途徑傳導的藥物中的用途。
[0050]有益效果
[0051]1.本發(fā)明提供了 0LFM4基因新的用途，其利用RNAi沉默0LFM4表達抑制了胃癌細胞向肝臟和腹腔的轉(zhuǎn)移，確立了轉(zhuǎn)移防治靶點，是一種有效的干預策略提高胃癌的療效。
[0052]2.本發(fā)明設計并構(gòu)建了特異性靶向0LFM4基因的干擾RNA及其載體，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞株，從而抑制0LFM4蛋白表達，為抑制胃癌的轉(zhuǎn)移從而為胃癌轉(zhuǎn)移治療的干預提供有效靶點。
[0053] 3.本發(fā)明證明利用慢病毒介導的0LFM4_siRNA不僅具有抑制胃癌細胞的體外遷移與侵襲能力，還能具有抑制胃癌細胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力；使得減弱0LFM4表達具有潛在治療晚期胃癌惡性進展的有效方式。并進一步明確NF-kB信號為0LFM4表達的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，還具有反饋調(diào)控NF-kB信號功能。本發(fā)明在慢病毒介導的0LFM4-siRNA在胃癌抗轉(zhuǎn)移治療的關鍵問題上，具有如下創(chuàng)新
[0054](1)采用慢病毒介導的0LFM4-siRNA方式，可作為體內(nèi)外siRNA傳遞有效方式；而其表達的siRNA能特異性抑制0LFM4基因表達，達到穩(wěn)定抑制胃癌細胞內(nèi)0LFM4基因表達的效果。
[0055](2)慢病毒介導0LFM4-siRNA對0LFM4表達的穩(wěn)定抑制，具有減低胃癌細胞體外遷移與侵襲能力；尤其顯著抑制了體內(nèi)胃癌細胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力。
[0056](3) 0LFM4基因的表達下調(diào)能夠反饋抑制NF-KB信號途徑，利用抑制0LFM4通過反饋抑制NF-KB信號，抑制胃癌細胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖
[0058]圖2實施例1中構(gòu)建的干擾RNA慢病毒的滴度測定熒光照片(樣品說明:第一個Ep管中加入IOul病毒原液,記為1E+1 μ I ;第二個Ep管中進行了第一次十倍稀釋，所得病毒原液為第一個Ep中的1/10,記為1Ε+0μ I ;第三個Ep管中進行了第二次十倍稀釋,所得病毒原液為第二個Ep中的1/10,記為IE-1 μ I)
[0059]圖3實施例1中0LFM4_siRNA序列測序圖譜
[0060]圖4實施例1中NC-siRNA陰性對照(NC-GFP-LV)序列測序圖譜[0061 ] 圖5實施例1中MKN-45細胞感染慢病毒48h后熒光效果
[0062]圖6實施例1中經(jīng)流式細胞儀分選后測得GFP+熒光率
[0063]圖7實施例1中經(jīng)Real-time PCR檢測細胞中0LFM4mRNA表達
[0064]圖8實施例1中0LFM4敲減后Western blot檢測0LFM4蛋白表達
[0065]圖9實施例2中Transwell法測定遷移能力，左圖為三次實驗中典型圖片(200X)，右圖為顯微鏡下10個隨機視野的平均遷移細胞數(shù)
[0066]圖10實施例2中Transwell法測定MKN-45細胞侵襲能力，左圖為三次實驗中典型圖片(200X)，右圖為顯微鏡下10個隨機視野的平均侵襲細胞數(shù)
[0067]圖11實施例2中經(jīng)尾靜脈注射和腹腔注射MKN-45后肝臟表面和腸系膜轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量比較，上圖為肉眼下轉(zhuǎn)移腫瘤典型圖片，下圖為肝臟表面及腸系膜轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)
[0068]圖12實施例2中HE染色檢測轉(zhuǎn)移腫瘤組織
[0069]圖13實施例3中比較0LFM4敲減后總蛋白中NF- κ B相關蛋白表達水平
[0070]圖14實施例3中比較0LFM4敲減后胞漿蛋白中0LFM4的表達及胞漿胞核蛋白中NF- κ B通路相關蛋白表達水平
[0071 ] 圖15實施例3中0LFM4敲低后胞核蛋白與NF- κ B DNA的結(jié)合活性明顯被抑制
[0072]圖16實施例3中人腫瘤轉(zhuǎn)移Real-time PCR芯片基因檢測的擴增曲線㈧和部分融解曲線(B)
【具體實施方式】
[0073]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0074]實施例1慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定感染細胞株的建立
[0075]I 材料
[0076]1.1細胞株
[0077]人胃癌細胞株MKN-45購自生科院上海細胞所。
[0078]1.2慢病毒構(gòu)建RNA序列
[0079]0LFM4-RNAi 干擾靶點序列:AACGCTTGGAATTCACAGCTC
[0080]NC-RNA 序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT
[0081]1.3引物設計
[0082]0LFM4擴增弓丨物序列: [0083]0LFM4-F:5/ -ACAGAGTGGAACGCTTGGAA-3'
[0084]0LFM4-R: 5' -CCTTCTCCATGATGTCAATTCG-3'
[0085]內(nèi)參β -actin擴增引物序列:
[0086]β -actin-F:5/ -CCAACCGCGAGAAGATGA-3'
[0087]β -actin-R:5/ -CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3'
[0088]1.4主要試劑及耗材
[0089]
【權(quán)利要求】
1.一種祀向0LFM4基因的干擾RNA,其核苷酸序列如下: 正義鏈:5,
-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3 '，即 SEQ IDN0.1 ； 反義鏈辦’
-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'，即 SEQ IDN0.2。
2.包含權(quán)利要求1所述的靶向0LFM4基因的干擾RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的Lentivirus慢病毒,制備方法包括以下步驟: (1)體外合成上述DNA序列； (2)退火配對產(chǎn)生DNA雙鏈，通過兩端所含的酶切位點AgeI與EcoRI連入酶切后的GVl 15載體； (3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入制備好的細菌感受態(tài)細胞，抽提DNA重組質(zhì)粒；DNA測序驗證陽性重組克?。? (4)Lentivirus 病毒包裝: ①轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.2X IO7細胞/20 ml，重新接種于15cm細胞培養(yǎng)皿，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后待細胞密度達70%~80%用于轉(zhuǎn)染； ②轉(zhuǎn)染前2h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基； ③向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV載體20μ g , pHelper 1.0載體15 μ g，pHelper 2.0載體10 μ g)，與相應體積的Opt1-MEM培養(yǎng)基混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 ml,在室溫下溫育5分鐘； ④將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，吸取100μ I Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4ml Opt1-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘； ⑤把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進行混合,輕輕地顛倒混勻，在5分鐘之內(nèi)混合； ⑥混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復合物； ⑦將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； ⑧培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20 ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去； ⑨每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基251111，于371:、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時； (5)病毒的收獲及濃縮 ①收集轉(zhuǎn)染后48小時的293T細胞上清液； ②4°C，4000g離心10min，除去細胞碎片； ③以0.45 μ m濾器過濾上清液于40 ml超速離心管中；④把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中(最多19ml)，蓋上蓋子；將過濾杯插到濾過液收集管中； ⑤組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上； ⑥在4000Xg離心10-15分鐘，至需要的病毒濃縮體積； ⑦離心結(jié)束后，芰出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開； ⑧將過濾杯倒扣在樣品收集杯上； ⑨離心力不超過1000g,時間為2分鐘；把過濾杯從樣品收集杯上移開；樣品收集杯中的即為病毒濃縮液； ⑩將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，_80°C長期保存；取其中一支進行病毒生物學滴度測定； (6) Lentivirus 滴度測定 ①測定前一天，293T細胞鋪96孔板，貼壁生長，每個孔加4XIO4個細胞，體積為100μ L ；②根據(jù)病毒的預期滴度，準備疒10個無菌的Ep管，每管加入90μ I的無血清培養(yǎng)基； ③取待測定的病毒原液10μ I加入到第一個管中，混勻后,取10 μ I加入到第二個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管； ④選取所需的細胞孔，吸去90μ I培養(yǎng)基，丟棄；加入90 μ I稀釋好的病毒溶液；放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)； ⑤24小時后，加入完全培養(yǎng)基100μl ; ⑥4天后，觀察熒光表達情冴觀察熒光表達情況；熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少； ⑦滴度計算:根據(jù)熒光圖片中GFP表達情況。
4.如權(quán)利要求1所述的干擾性RNA或如權(quán)利要求2所述的慢病毒在制備用于預防、診斷、治療胃癌腫瘤向腹腔或/和肝轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
5.如權(quán)利要求1所述的干擾性RNA或如權(quán)利要求2所述的慢病毒在制備用于抑制NF-KB信號途徑傳導的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK103981186SQ201410186285
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】黃軼, 宋利華, 李陽, 包黎明 申請人:重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院