專利名稱：漿細(xì)胞鑒定和分離用熒光探針以及使用該探針的漿細(xì)胞的鑒定或分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的鑒定和分離用熒光探針以及使用該探針的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的鑒定或分離方法。
背景技術(shù)：
抗體通過與靶抗原特異性結(jié)合，在生物體防御中發(fā)揮重要的作用。近年來，利用抗 體對(duì)抗原的特異性結(jié)合性的抗體藥物是作為自身免疫疾病或癌癥等疑難病的治療藥開發(fā)，其有用性得到很高評(píng)價(jià)。近年來，對(duì)于可制成這樣的抗體藥物的、高特異性·高親和性單克隆抗體的高效制作技術(shù)的開發(fā)需求日益增高，因此，正在建立使用基因克隆法，由人和小鼠的抗體生成細(xì)胞制作抗原特異性單克隆抗體的方法。該方法主要包含以下3個(gè)步驟(I)由完成了免疫的動(dòng)物的末梢血、淋巴組織分離抗體生成細(xì)胞，(2)由抗體生成細(xì)胞克隆免疫球蛋白基因，(3)通過免疫球蛋白基因?qū)胨拗骷?xì)胞來生成抗體。為了采用本技術(shù)高效率地制作單克隆抗體，首先必須高純度地分離抗體生成細(xì)胞?？贵w生成細(xì)胞通常采用B淋巴細(xì)胞或其最終分化而成的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞最終分化所得，是為抗體生成而特化的細(xì)胞。由于已經(jīng)進(jìn)行了被稱為親和力成熟的抗體基因的體細(xì)胞突變和由抗原進(jìn)行的選擇，因此，這些細(xì)胞對(duì)于結(jié)合能力高的抗體的分離特別有用。但是，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞是含有若干亞型的不均一的細(xì)胞群，在淋巴組織內(nèi)的存在率低，為O. 1%以下，因此難以高純度分離。目前，對(duì)于從末梢血或淋巴結(jié)中鑒定·分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，必須進(jìn)行至少將3種以上的細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體組合的多個(gè)階段的正向·反向篩選操作(非專利文獻(xiàn)I)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I :Sanderson, R. D. , Lalor, P. , Bernfield, Μ. B lymphocytesexpress and lose syndecan at specific stages of differentiation: CellRegulation 1: 27-35 (1989)
非專利文獻(xiàn) 2 :Horst，A. Hunzelmannj N. Arcej S. Herberj M. Manzj R. A.Radbruchj A. Nischtj R. Schmitz, J. Assenmacherj M. Clin. Exp. Immunol. 130:370—378 Detection and characterization of plasma cells in peripheral blood:correlation of IgE+ plasma cell frequency with IgE serum titre (2002)
非專利文獻(xiàn)I和2的全部記載均作為特別公開引用到本說明書中。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，從末梢血或淋巴結(jié)中鑒定·分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞時(shí)，必須進(jìn)行多個(gè)階段的正向·反向篩選操作，因此，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的鑒定·分離需要時(shí)間和繁雜的步驟。并且，使用細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體進(jìn)行的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的分離方法在目前階段僅在人和小鼠中建立(非專利文獻(xiàn)1、2)。因此，目前在采用基因克隆法制作單克隆抗體時(shí)，只使用來自人和小鼠的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。但是，大部分作為抗體藥物靶標(biāo)的人蛋白質(zhì)的功能性抗原表位在人-小鼠間的同源性高，因此，即使用其對(duì)小鼠免疫，由于免疫耐受，大多也難以獲得特異性高的抗體。因此，為了避免免疫耐受的限制，作為新的抗體藥物開發(fā)的目標(biāo)，由使用小鼠以外的動(dòng)物種類進(jìn)行的免疫得到的單克隆抗體正顯示其重要性。但是，由于尚未制作出兔、大鼠、綿羊、山羊、雞等動(dòng)物的抗體生成細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體，從這些動(dòng)物中鑒定·分離抗體生成細(xì)胞一·漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法尚未建立。因此本發(fā)明的目的在于提供無需利用細(xì)胞表面標(biāo)記物，可高效率、高純度地從包括人和小鼠在內(nèi)的哺乳類直至鳥類的各種動(dòng)物中分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞具有其它細(xì)胞中未見的以下的特征形態(tài)。(I)與蛋白質(zhì)的翻譯·折疊·成熟有關(guān)的細(xì)胞器一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常發(fā)達(dá)，占有細(xì)胞質(zhì)的大部分。(2)細(xì)胞核小型且偏于細(xì)胞的一側(cè)存在，核內(nèi)有染色體聚集，可見車輪輻狀的異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人認(rèn)為，這些特征是漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞由于為大量的抗體生成而特化的原因出現(xiàn)的形態(tài)，因此利用該形態(tài)，不管動(dòng)物種類如何，均具有可分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的可能性?；谏鲜隹紤]，本發(fā)明人對(duì)于很多的熒光探針、對(duì)于對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的選擇性染色進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在這樣的熒光探針(熒光探針I(yè)):其對(duì)于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞強(qiáng)烈染色，而對(duì)于可能與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞共存的其它細(xì)胞的染色程度低，兩者間所得的熒光強(qiáng)度比顯示可識(shí)別程度的差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，存在這樣的熒光探針(熒光探針2):其對(duì)于可能與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞共存的其它細(xì)胞的核強(qiáng)烈染色，但對(duì)于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的核則親和性低。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，通過使用這些熒光探針，無需使用細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體，即可高效率地從淋巴結(jié)組織或血細(xì)胞試樣中鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，并且可以將鑒定的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞分離，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[I]熒光探針，該熒光探針是對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性比對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細(xì)胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞，用于漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的鑒定或分離。[2] [I]的熒光探針，該熒光探針選自(1)兩親性和陽離子性、并且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)；以及(2)對(duì)于顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。[3] [2]的熒光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(shù)(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數(shù)在O. ΙμΜ-O. InM的范圍。[4] [1]-[3]中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細(xì)胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、內(nèi)體或聚集體。[5] [1]-[4]中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，上述熒光探針選自熒光標(biāo)記格列本脲、熒光標(biāo)記布雷菲德菌素A、熒光探針和熒光蛋白。[6]熒光探針，該熒光探針是對(duì)細(xì)胞核的染色選擇性比對(duì)細(xì)胞核以外的細(xì)胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞，用于漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的鑒定或分離。[7] [6]的熒光探針，其中，熒光探針是對(duì)DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)。[8] [7]的熒光探針，其中，上述對(duì)DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)是如下的物質(zhì)兩個(gè)氮通過聚亞甲基鏈連接，各個(gè)氮獨(dú)立形成芳環(huán)，至少一個(gè)氮具有正電荷作為季銨基。[9] [8]的熒光探針，其中，對(duì)于上述物質(zhì)，兩親性指數(shù)(Al)〈8，疏水性指數(shù)(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。[10] [6]-[9]中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，上述熒光探針為SYTO(注冊(cè)商標(biāo))59或SYTO (注冊(cè)商標(biāo))24。[11] [1]-[5]中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞為選自紅細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的至少一種細(xì)胞。[12] [6]-[10]中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞是選自單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的至少一種細(xì)胞。[13] [1]-[12]中任一項(xiàng)的熒光探針，該熒光探針用于來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的分離。[14]鑒定淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓中的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，該方法包括使用[1]_[5]中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。[15]漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的制備方法，該方法包括收集按照[14]所述方法鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。[16] [15]的方法，該方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集。[17]鑒定淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓中的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。[18]漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的制備方法，該方法包括收集按照[17]所述方法鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。[19] [17]的方法，該方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集。
[20]漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的制備方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)[15]或[16]中收集的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞或者漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的候選細(xì)胞，收集所鑒定的細(xì)胞，將剩余的細(xì)胞作為漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞進(jìn)行收集。[21] [20]的方法，該方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞或者漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集、以及剩余細(xì)胞的收集。[22][13]-[21]中任一項(xiàng)的方法，其中，淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負(fù)鼠、臭駒鼯(suncus)、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。 在本發(fā)明中，無需使用細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體，而是關(guān)注于熒光探針對(duì)細(xì)胞器等的染色選擇性，即可鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。因此，不需要用于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞鑒定的細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體本身，不限于特定的動(dòng)物的種類，即可以鑒定且分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明，可制成不依賴特定的動(dòng)物種類的單克隆抗體。目前，只有人和小鼠抗體應(yīng)用于抗體藥物的開發(fā)，但采用本發(fā)明，則可以將由很多動(dòng)物種類得到的單克隆抗體用于抗體藥物的開發(fā)。繼而，本發(fā)明對(duì)于占新藥開發(fā)主流的抗體藥物開發(fā)提供了新的的有力的技術(shù)。附圖
簡(jiǎn)述
圖I表示實(shí)施例I中使用選擇性染色內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細(xì)胞群用ER-Tracker (注冊(cè)商標(biāo))Blue-White DPX/lipid染色，通過熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。圖2表示實(shí)施例2中使用選擇性染色內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針和常染色質(zhì)親和性熒光探針鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細(xì)胞群用SYTO (注冊(cè)商標(biāo))59以及ER-Tracker (注冊(cè)商標(biāo))Blue-White DPX/lipid染色，通過熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。圖3表示實(shí)施例3中存在于通過細(xì)胞分選儀分選的Blue-White DPX/lipid強(qiáng)陽性且SYTO(注冊(cè)商標(biāo))59弱陽性細(xì)胞群中的免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果。圖4表示實(shí)施例4中存在于通過細(xì)胞分選儀分選的ER-Tracker (注冊(cè)商標(biāo))Blue-White DPX/lipid強(qiáng)陽性大鼠細(xì)胞群中的免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果。圖5表不實(shí)施例5中存在于通過細(xì)胞分選儀分選的ER-Tracker(注冊(cè)商標(biāo))Blue-White DPX/lipid強(qiáng)陽性豚鼠細(xì)胞群中的免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施發(fā)明的方案 <熒光探針1>
本發(fā)明的方案I的熒光探針(熒光探針I(yè))是用于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的鑒定或分離的熒光探針，對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的親和性比對(duì)其它細(xì)胞器的親和性高，換言之，是選擇性染色細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常發(fā)達(dá)，結(jié)果，通過熒光探針I(yè)的染色所得到的熒光強(qiáng)度與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞用熒光探針I(yè)染色時(shí)的熒光強(qiáng)度相比，顯示出可以識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以及漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的程度的差異。熒光探針I(yè)所顯示的上述熒光強(qiáng)度比(漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度/漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度)例如為3倍以上。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)于熒光探針I(yè)的親和性沒有很大差異，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達(dá)程度的不同產(chǎn)生了上述熒光強(qiáng)度的差異。因此，根據(jù)上述熒光強(qiáng)度比、通過用熒光探針I(yè)染色，可以識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以及漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞。用熒光探針I(yè)染色，則可以通過來自漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與來自漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱差異，來將共存有漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞兩者進(jìn)行識(shí)別。因此，通過用熒光探針I(yè)染色，可以容易地從共存有漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的細(xì)胞群中鑒定出漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，并且可以收集所鑒定的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，由此可以獲得較多含有漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的細(xì)胞群。 如果來自染色的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為來自染色的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的3倍以上，則熒光探針I(yè)可以識(shí)別兩者，從容易識(shí)別的角度考慮，優(yōu)選4倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選5倍以上。不過，根據(jù)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的種類不同，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達(dá)程度也不同，因此，該熒光強(qiáng)度比隨著漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的種類不同而變化。上述熒光強(qiáng)度比越高，則可以更高效率地從含有漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的細(xì)胞群中鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞例如可舉出紅細(xì)胞、血小板、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨曬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。本發(fā)明中，使用本發(fā)明的熒光探針I(yè)的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的判別可如下進(jìn)行。將熒光探針I(yè)加于細(xì)胞懸液中，在37 °C下進(jìn)行30分鐘染色。適合染色的熒光探針I(yè)的濃度根據(jù)熒光探針I(yè)的種類而不同，例如IOOnM-I μ M0染色后，將細(xì)胞用PBS洗滌。洗滌后的細(xì)胞例如可以(I)使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中熒光探針的定位，或者(2)根據(jù)細(xì)胞發(fā)出的熒光的強(qiáng)度來判別是漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，或者是漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的判別方法在漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的鑒定·分離方法中詳述?？梢赃M(jìn)一步應(yīng)用上述漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的判別方法，由對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性未知的物質(zhì)篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高、適合作為本發(fā)明的熒光探針I(yè)的熒光探針的篩選可利用以下方法進(jìn)行通過后述的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)的免疫染色(在漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞中為免疫球蛋白)，或者使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移性的重組熒光蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，由此鑒定細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用該方法求出細(xì)胞全體的熒光強(qiáng)度A與來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強(qiáng)度B的比例(Β/Α)。篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)的方法中，既可以只使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞，也可只使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞實(shí)施。不過，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，可通過染色獲得高熒光強(qiáng)度，因此，使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞更容易進(jìn)行物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性的評(píng)價(jià)。但是，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的獲得并不容易，因此也可以使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞，評(píng)價(jià)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性(染色力)，篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。例如，在使用常規(guī)的培養(yǎng)細(xì)胞(例如Hela細(xì)胞)的染色試驗(yàn)中，通過求出上述細(xì)胞全體的熒光強(qiáng)度A和來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強(qiáng)度B的比例(B/A)，可以篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。不過，在使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞作為細(xì)胞時(shí)，根據(jù)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達(dá)程度，將作為閥值的B/A的值適當(dāng)設(shè)定為比在使用漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的篩選方法中所采用的閥值B/A的值低的值(例如為50%左右)是適當(dāng)?shù)?。漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的例子可舉出紅細(xì)胞、血小板、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等作為其它的細(xì)胞。并且，上述方法中的篩選也可以使用雜交瘤細(xì)胞、漿細(xì)胞瘤或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞代替漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。這是由于，雜交瘤細(xì)胞、漿細(xì)胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞也生成免疫球蛋白，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，因此可通過染色獲得高熒光強(qiáng)度，更容易進(jìn)行物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性的評(píng)價(jià)。作為對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以及漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高的熒光探針I(yè)的物質(zhì)的例子，可舉出(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性 的物質(zhì)，以及(2)對(duì)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。具有上述(I)或(2)的性質(zhì)的物質(zhì)對(duì)于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性、以及對(duì)于漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性兩者均比對(duì)于細(xì)胞的其它細(xì)胞器的染色性高。上述(I)中的“兩親性和陽離子性”具體來說是指兩親性指數(shù)(Al)例如為+6>AI>0。其中，兩親性指數(shù)是通過計(jì)算分子的脂溶性結(jié)構(gòu)域表觀上的IogP值所得到的值。具體來說，是根據(jù)Hansch等人提出的碎片值，考慮碳鏈的長(zhǎng)度及其位置關(guān)系與陽離子性季銨基的極性效果，根據(jù)Morrall等人的模型計(jì)算的值。[Hansch C，Leo AJ. ExploringQSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, p.160， AmericanChemical Society: Washington, DC, 1995. ， Morrall SWj Herzog RRj Kloepper-SamsPj Rosen MJ. Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance totoxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress, vol.3. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227。上述⑴中的“中等程度的脂溶性”是指疏水性指數(shù)(IogP)例如為+6>logP>0。疏水性指數(shù)是根據(jù)Hansch等人的碎片推算法計(jì)算的分子全體的疏水性值。具體來說，是在以Al所示的疏水基團(tuán)上加上其附帶的結(jié)構(gòu)的影響而得出的。上述(2)中的“對(duì)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性”具體來說是指具有解尚常數(shù)為O. I μ Μ-0. InM的未和性。對(duì)顯不內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)也是選擇性染色細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針。(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性的物質(zhì)的例子可舉出下述Α、Β或C所示的化合物。式A所示的化合物是Di0C6 (3) ( 3，3’ - 二己基氧雜碳菁碘化物)，在低濃度下聚集于線粒體，但在高濃度聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。式B所示的化合物是羅丹明B己酯，在低濃度下聚集于線粒體，在高濃度下聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。式C所示的化合物是ER-Tracker Blue whiteDPX，主要聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在高濃度也對(duì)高爾基體染色。是實(shí)施例中使用的熒光探針。這些A、B或C所示的化合物均為兩親性和陽離子性，具有中等程度的脂溶性(參考文獻(xiàn)，參照Whyfluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental andQSAR-modeling study)。A所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為4. 5和4. 4，具有I價(jià)陽離子。B所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為4. 8和5. 9，具有I價(jià)陽離子。C所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為5. I和O. 7，具有I價(jià)陽離子。C所示的化合物如實(shí)施例所示，對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞染色時(shí)的熒光強(qiáng)度為對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞染色時(shí)的熒光強(qiáng)度的4倍以上。[化I]
權(quán)利要求
1.熒光探針，所述熒光探針是對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性比對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細(xì)胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞，用于漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的鑒定或分離。
2.權(quán)利要求I的熒光探針，其中，所述熒光探針選自(1)兩親性和陽離子性、并且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)；以及(2)對(duì)于顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的熒光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(shù)(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數(shù)在O. I μ M-ο. InM 的范圍。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細(xì)胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、內(nèi)體或聚集體。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的突光探針,其中，上述突光探針選自突光標(biāo)記格列本脲、熒光標(biāo)記布雷菲德菌素Α、熒光探針和熒光蛋白。
6.熒光探針，所述熒光探針是對(duì)細(xì)胞核的染色選擇性比對(duì)細(xì)胞核以外的細(xì)胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識(shí)別漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞與漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞，用于漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的鑒定或分離。
7.權(quán)利要求6的熒光探針，其中，熒光探針是對(duì)DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的熒光探針，其中，上述對(duì)DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)是如下的物質(zhì)兩個(gè)氮通過聚亞甲基鏈連接，各個(gè)氮獨(dú)立形成芳環(huán)，至少一個(gè)氮具有正電荷作為季銨基。
9.權(quán)利要求8的熒光探針，其中，對(duì)于上述物質(zhì)，兩親性指數(shù)(Al)〈8，疏水性指數(shù)(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，上述熒光探針為SYTO(注冊(cè)商標(biāo))59或SYTO (注冊(cè)商標(biāo))24。
11.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞為選自紅細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的至少一種細(xì)胞。
12.權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞是選自單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的至少一種細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的熒光探針，其中，所述熒光探針用于來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的分離。
14.鑒定淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓中的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者衆(zhòng)細(xì)胞和/或衆(zhòng)母細(xì)胞的候選細(xì)胞。
15.漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的制備方法，所述方法包括收集按照權(quán)利要求14所述方法鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，該方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和/或衆(zhòng)母細(xì)胞或者衆(zhòng)細(xì)胞和/或衆(zhòng)母細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集。
17.鑒定淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓中的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)來自淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞試樣或骨髓的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者衆(zhòng)細(xì)胞和/或衆(zhòng)母細(xì)胞的候選細(xì)胞。
18.漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的制備方法，所述方法包括收集按照權(quán)利要求17所述方法鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞。
19.權(quán)利要求17的方法，所述方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或漿母 細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集。
20.漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的制備方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的熒光探針或其組合對(duì)權(quán)利要求15或16中收集的細(xì)胞實(shí)施染色，接著，根據(jù)來自細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞或者漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的候選細(xì)胞，收集所鑒定的細(xì)胞，將剩余的細(xì)胞作為漿細(xì)胞和/或漿母細(xì)胞或者漿細(xì)胞和/或者漿母細(xì)胞的候選細(xì)胞進(jìn)行收集。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，所述方法是通過細(xì)胞分選儀的分選來進(jìn)行所鑒定的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞或者漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞以外的細(xì)胞的候選細(xì)胞的收集、以及剩余細(xì)胞的收集。
22.權(quán)利要求13-21中任一項(xiàng)的方法，其中，淋巴結(jié)組織、血細(xì)胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負(fù)鼠、臭駒鼯、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。
全文摘要
本發(fā)明提供無需利用細(xì)胞表面標(biāo)記物，可以高效率、高純度地由哺乳類或鳥類分離漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法。熒光探針，與對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細(xì)胞器的染色選擇性相比，其對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高。涉及鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，該方法包括使用該熒光探針，對(duì)來自淋巴結(jié)組織等的細(xì)胞進(jìn)行染色，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。熒光探針，與對(duì)細(xì)胞核以外的細(xì)胞器的染色選擇性相比，其對(duì)細(xì)胞核的染色選擇性高。鑒定淋巴結(jié)組織等中的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的方法，該方法包括使用該熒光探針，對(duì)來自淋巴結(jié)組織等的細(xì)胞染色，根據(jù)來自染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來鑒定漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102947463SQ20118001581
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者黑澤信幸, 磯部正治 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人富山大學(xué)