專利名稱：得自涅斯捷連科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所公開的是涉及得自涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia spp.)的淀粉酶的組合物和方法。
背景技術(shù)：
淀粉由直鏈淀粉(15-30%w/w)和支鏈淀粉(70-85%w/w)的混合物組成。直鏈淀粉由a -I, 4-連接的葡萄糖單元的直鏈組成，分子量(MW)為約60，000至約800，000。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有a -I, 6分支點的支鏈聚合物；其MW可高達一億。濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，該方法涉及(1)用a -淀粉酶將固體淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度為約7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也稱為葡萄糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后通過酶法異構(gòu)化為稱為異糖漿(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。a -淀粉酶(EC 3. 2. I. I)通過隨機裂解內(nèi)部a -I, 4_糖苷鍵而水解淀粉、糖原和相關(guān)的多糖。多年以來，a-淀粉酶已用于多種不同的目的，包括淀粉液化、紡織脫漿、造紙和紙漿行業(yè)的淀粉改性以及用于釀造。這些酶也可用于在盤碟洗滌和衣物洗滌中除去淀粉污潰。衣物和盤碟污垢在組成上有很大差異，并因此在被有效和高效除去的能力方面大不相同。涅斯捷連科氏菌屬是歸類為放線菌綱放線菌目微球菌亞目微球菌科的革蘭氏陽性菌。在2004年首次描述的新疆涅斯捷連科氏菌(Nesterenkonia xinjianensis)從中國新疆省高鹽土壤樣品中分離得到(Wen-Jun Li et al. (2004) Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 54:837-41)(李文軍等人，2004年，《國際系統(tǒng)與進化微生物學(xué)雜志》，第54卷第837-841頁)。新疆涅斯捷連科氏菌不被認(rèn)為是產(chǎn)淀粉酶桿菌。事實上，模式菌株的菌種描述指示該生物體的淀粉水解反應(yīng)呈陰性，從而表明未產(chǎn)生或未分泌淀粉酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的組合物和方法涉及得自涅斯捷連科氏菌的阿爾法(a )-淀粉酶和相關(guān)的a -淀粉酶，它們在本文中統(tǒng)稱為AmyNEST。在一個方面，提供了分離的AmyNEST多肽。在一些實施例中，AmyNEST多肽在異源生物體中表達。在特定的實施例中，AmyNEST多肽作為分泌的多肽在異源生物體中表達。在一些實施方案中，AmyNEST多肽與序列標(biāo)識號11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。在一些實施例中，AmyNEST多肽與序列標(biāo)識號11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的總體氨基酸序列同一性，同時包含碳水化合物結(jié)合模塊(CBM) 25 (I)和/或CBM 25(2)的氨基酸序列。在一些實施例中，AmyNEST多肽與序列標(biāo)識號11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的總體氨基酸序列同一性，同時包含與CBM 25 (I)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在特定的實施例中，AmyNEST多肽包含與CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及與CBM 25 (2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施例中，在AmyNEST多肽中與CBM 25(1)和CBM 25 (2)相關(guān)的氨基酸序列通過連接基分隔開。在一些實施例中，提供了包含與序列標(biāo)識號11的氨基酸序列具有至少60%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的AmyNEST多肽。在特定的實施例中，該多肽與序列標(biāo)識號11的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性。在特定的實施例中，該多肽與序列標(biāo)識號11的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。在特定的實施例中，該多肽與序列標(biāo)識號11的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。在特定的實施例中，該多肽與序列標(biāo)識號11的氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一丨丨生。在一些實施例中，該多肽包含碳水化合物結(jié)合模塊(CBM) 25 (I)的氨基酸序列(序列標(biāo)識號12)和/或CBM 25(2)的氨基酸序列(序列標(biāo)識號13)。在特定的實施例中，該多肽包含CBM 25(1)的氨基酸序列和CBM25(2)的氨基酸序列，這兩者通過具有序列標(biāo)識號19的氨基酸序列的連接基分隔開。在一些實施例中，該多肽具有a -淀粉酶活性，其可例如通過本文所述的檢測分析法測定。在另一方面，提供了包含AmyNEST多肽的組合物。在一些實施例中，該組合物為清 潔組合物。在一些實施例中，該組合物有效除去衣物、盤碟或織物的淀粉污潰。在另一方面，提供了一種用于從表面除去淀粉污潰的方法，所述方法包括在存在包含有效量的AmyNEST多肽的水性組合物的情況下溫育該表面，讓多肽水解存在于淀粉污潰中的淀粉組分，以形成溶于水性組合物的較小的淀粉源分子，從而從該表面上除去淀粉污潰。在一些實施例中，該表面為紡織物表面。在一些實施例中，該表面在盤碟上。在一些實施例中，該表面為弄臟的硬質(zhì)表面。在另一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽的表達方法，包括構(gòu)建表達載體，該表達載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼連接到編碼AmyNEST多肽的多核苷酸的信號序列；
將該表達載體引入宿主細(xì)胞，表達該多肽；回收表達的多肽。在一些實施例中，將AmyNEST多肽引入異源宿主細(xì)胞。在一些實施例中，將AmyNEST多肽作為分泌多肽而表達。在另一方面，提供了包含編碼AmyNEST多肽的多核苷酸序列的載體。編碼AmyNEST多肽的序列可以可操作地連接到啟動子或連接到其他控制元件。在另一方面，提供了包含編碼AmyNEST多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞或包含這種多核苷酸的載體。分離的宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。分離的宿主細(xì)胞可以為桿菌(如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽胞桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪地芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前稱為 Bacillus stearothermophilus)、嗜喊芽抱桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌 (B. amyIoIiquefaciens)、凝結(jié)芽抱桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽抱桿菌(B. circulans)、B. lautus、蘇云金芽抱桿菌(B. thuringiensis)、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)、S. murinus 或大腸埃希氏菌(Escherichia coli))。另一方面構(gòu)思了包含AmyNEST多肽的洗滌添加劑，其中該洗滌添加劑的形式任選地為不起塵顆粒、微粒、穩(wěn)定化液體、凝膠或受保護的酶。洗滌添加劑中的多肽可為上述截短的多肽。該洗滌添加劑可含有每克洗滌添加劑約0.02mg至約200mg的多肽。該洗滌添加劑還可包含選自蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纖維素酶、聚酯酶以及任何它們的組合的酶。另一方面構(gòu)思了包含任何所述洗滌添加劑的洗滌劑組合物。洗滌劑組合物可任選地包含如下的一種或多種物質(zhì)表面活性劑、漂白體系或漂白劑、洗滌劑助洗劑、聚合物、穩(wěn)定劑、織物調(diào)理劑、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐劑、染料、香料、污垢懸浮劑、晦暗抑制劑、熒光增白劑或殺菌劑。洗滌劑組合物可包含或進一步包含另外的酶，其中該酶為蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纖維素酶、聚酯酶或任何它們的組合。在其他實施例中，該組合物為洗滌添加劑。另一方面構(gòu)思了包含AmyNEST多肽的手動或自動盤碟洗滌劑組合物。還有一方面構(gòu)思了洗滌盤碟的方法，包括將本文所述的手動或自動盤碟洗滌劑施用到有需要的盤碟(一個或多個)上。洗滌盤碟的方法構(gòu)思了添加盤碟洗滌劑的量使得洗滌液體包含本文所述多肽的量為約0. Olppm至約4ppm。另一方面構(gòu)思了包含本文所述的洗滌添加劑的衣物洗滌劑組合物。還有一方面構(gòu)思了清潔紡織物的方法，包括在具有本文所述的洗滌劑組合物的溶液中洗滌弄臟的紡織物。該方法還構(gòu)思了在溶液中含有本文所述的多肽，其在溶液中的量為約0. 01至約2ppm。通過本發(fā)明的描述和附圖，所述組合物和方法的這些方面和其他方面以及實施例將顯而易見。


圖I為載體pRANGER-BTB3_Cat的質(zhì)粒圖譜。圖2為示出AmyNEST蛋白質(zhì)組織的示意圖，其示出了催化結(jié)構(gòu)域和兩個碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)。圖3為考馬斯亮藍染色SDS-PAGE凝膠的圖象，其示出60、50和27kDa處的三條主帶。圖4為pHPLT的質(zhì)粒圖譜。圖5為pHPLT-AmyNEST的質(zhì)粒圖譜。圖6 不出 CS-28 米淀粉微樣本(microswatches)上的 AmyNEST 在 pH 8 (HEPES 緩沖液)下的清潔性能。
圖7示出CS-28米淀粉微樣本上的AmyNEST在pH 10 (CAPS緩沖液)下的清潔性倉泛。圖8列出文中提到的序列。序列的簡要說明序列標(biāo)識號I為新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 16S rRNA基因的部分核苷酸序列。
序列標(biāo)識號2為引物pRANGER-FW的核苷酸序列。序列標(biāo)識號3為引物pRANGER-RV的核苷酸序列。序列標(biāo)識號4為引物Nest-Insert3_RV的核苷酸序列。序列標(biāo)識號5為引物Nest-Insert3_FW的核苷酸序列。序列標(biāo)識號6為引物Nest-add-Fw的核苷酸序列。序列標(biāo)識號7為新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶基因的核苷酸序列。序列標(biāo)識號8為編碼新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶成熟蛋白的核苷酸序列。序列標(biāo)識號9為新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶前體蛋白的氨基酸序列，包括24-氨基酸信號序列。序列標(biāo)識號10為新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶信號肽的氨基酸序列序列標(biāo)識號11為新疆涅斯捷連科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶成熟蛋白的氨基酸序列。
序列標(biāo)識號12為碳水化合物結(jié)合模塊CBM 25 (I)的氨基酸序列。序列標(biāo)識號13為碳水化合物結(jié)合模塊CBM 25 (2)的氨基酸序列。序列標(biāo)識號14為引物pHPLT-AmyNest-Fw的核苷酸序列。序列標(biāo)識號15為引物pHPLT-AmyNest-Rv的核苷酸序列。序列標(biāo)識號16為引物pHPLT-Fl的核苷酸序列。序列標(biāo)識號17為引物pHPLT-Rl的核苷酸序列。序列標(biāo)識號18為芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp. ) 195 a -淀粉酶未成熟形式的氨
基酸序列。序列標(biāo)識號19為將CBM 25(1)與CBM 25(2)分隔開的連接基的氨基酸序列。
具體實施例方式描述了涉及從涅斯捷連科氏菌分離出來的a -淀粉酶及其變體和同源物的組合物和方法。這些多肽統(tǒng)稱為AmyNEST多肽。將描述涉及AmyNEST多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的各種組合物和方法。I.定義和首字母縮略詞
根據(jù)此詳細(xì)描述，應(yīng)用下面的縮寫和定義。注意，除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括多個指代物。因此，例如，提及“一種酶”包括多個此種酶，而提及“該劑型”，包括提及一個或多個劑型以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等
坐寸o除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。為了清楚起見，定義以下縮寫和/或術(shù)語
I. I縮寫/首字母縮略詞除非另外指明，否則以下縮寫/首字母縮略詞具有以下含義AE醇乙氧基化物AEO醇乙氧基化物AEOS 醇乙氧基硫酸鹽AES醇乙氧基硫酸鹽AOSa -烯烴磺酸鹽AS燒基硫酸鹽CBD 25 碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族25cDNA互補 DNACMC羧甲基纖維素DNA脫氧核糖核酸DTMPA 二亞乙基三胺五乙酸EC酶學(xué)委員會EDTA乙二胺四乙酸EMPA Eidgenossische Materialpriifungs-und Forschungs Anstalt (瑞士聯(lián)邦材料檢測與研究實驗室)EO環(huán)氧乙烷(聚合物片段)F&HC 織物及家居護理GA葡萄糖淀粉酶IPTG 異丙基-P -D-硫代半乳糖苷kDa千道爾頓LAS直鏈烷基苯磺酸鹽LAT屬于地衣芽孢桿菌淀粉酶MW分子量MWU改良的伍格母單位；I. 6 X l(T5mg/MWU=活性單位NOBS 壬?；趸交撬猁}NTA次氨基乙酸OxAmPurastar HPAM 5000L (杰能科國際有限公司(GenencorInternational, Inc.))PEG聚乙二醇pi等電點PVA聚(乙烯醇)
PVP聚(乙烯吡咯烷酮)RNA核糖核酸SAS烷基磺酸鹽SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳sp.物種TAED四乙?；叶穡/v重量/體積w/w重量/重量
v/v體積/體積wt%重量 ％V攝氏度H2O水dH20或DI去離子水dIH20Milli-Q過濾的去離子水g 或 gm克Ii g微克mg毫克kg千克u L 和 u I微升mL 和 ml毫升mm毫米u m微米M摩爾mM毫摩爾UM微摩爾U單位sec 和"秒min 和'分鐘h小時DO溶解氧Genencor位于加利福尼亞州帕羅奧圖市的美國丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA)Ncm牛頓厘米ETOH乙醇eq.當(dāng)量N當(dāng)量濃度ds或DS干固體含量I. 2 定義術(shù)語“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除別的方面以外能夠催化淀粉降解的酶。淀粉酶為裂解淀粉中a -D-(I — 4)0-糖苷鍵的水解酶。一般來講，a -淀粉酶(EC 3. 2. I. I ；a -D- (I — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為以隨機方式在淀粉分子內(nèi)裂解a -D- (I — 4)
0-糖苷鍵的內(nèi)切酶。相反地，外切淀粉分解酶如￠-淀粉酶(EC 3.2. 1.2 ;a-D_(l —4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如生麥芽糖a -淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)從底物的非還原端裂解淀粉分子。P -淀粉酶、a -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1.20 ； a -D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡萄糖淀粉酶(EC 3. 2. I. 3 ; a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可由淀粉生成特定長度的麥芽低聚糖。如本文所用，術(shù)語“淀粉”指由植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何材料，由具有式(C6HltlO5)x (其中X可以是任何數(shù)字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。該術(shù)語包括植物基材料，如谷物、草、塊莖和根，并且更具體地講是從小麥、大麥、玉米、裸麥、大米、高梁、糠、木薯、小米、馬鈴薯、甘薯和木薯獲得的材料。 關(guān)于多肽的術(shù)語“野生型”、“親本”或“參考”是指不在一個或多個氨基酸位置處包括人為制造的置換、插入或缺失的天然存在的多肽。類似地，關(guān)于多核苷酸的術(shù)語“野生型”、“親本”或“參考”是指不包括人為制造的核苷改變的天然存在的多核苷酸。然而，應(yīng)注意，編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵蓋編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的任何多核苷酸。關(guān)于多肽的術(shù)語“變體”是指不同于特定野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多肽，因為它在一個或多個氨基酸位置處包括人為制造的置換、插入或缺失。類似地，關(guān)于多核苷酸的術(shù)語“變體”是指核苷酸序列不同于特定野生型多核苷酸、親本多核苷酸或參考多核苷酸的多核苷酸。野生型、親本或參考多肽或多核苷酸的同一性從上下文來看將是顯而易見的。當(dāng)結(jié)合對象細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體使用時，術(shù)語“重組”表明對象已通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)、或者變更天然的核酸或蛋白質(zhì)而得到改性，或者細(xì)胞衍生自己經(jīng)過此類改性的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達未在天然(非重組)形式的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，或者以不同的水平或在不同于自然界中存在的條件下表達天然基因。術(shù)語“回收的”、“分離的”和“分開的”是指從如在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣與其天然相關(guān)的至少一種其他物質(zhì)或組分中移除的化合物、蛋白質(zhì)(多肽)、細(xì)胞、核酸、氨基酸或其他指定的物質(zhì)或組分。如本文所用，術(shù)語“純化的”是指處于相對純的狀態(tài)的物質(zhì)(如，分離的多肽或多核苷酸)，所述相對純的狀態(tài)如至少約90%純、至少約95%純、至少約98%純或甚至至少約99%純。結(jié)合酶的術(shù)語“熱穩(wěn)定的”和“熱穩(wěn)定性”是指酶在暴露于高溫后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的熱穩(wěn)定性是由其半衰期(t1/2)衡量的，所述半衰期以分鐘、小時或天為單位給出，在此期間酶活性在限定的條件下?lián)p失一半。半衰期可通過測量暴露于(即經(jīng)受)高溫后殘余的a-淀粉酶活性來計算。結(jié)合酶的“ pH范圍”是指酶顯示出催化活性的pH值范圍。如本文所用，結(jié)合酶的術(shù)語“pH穩(wěn)定的”和“pH穩(wěn)定性”涉及在預(yù)定的時間段(如，15分鐘、30分鐘、I小時)內(nèi)、酶在寬泛的pH值范圍內(nèi)保持活性的能力。如本文所用，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“肽”是同義詞，并且可互換使用。在此類氨基酸序列表現(xiàn)出活性的情況下，它們可被稱為“酶”。使用常規(guī)的氨基酸殘基的單字母或三字母代碼，其中氨基酸序列以標(biāo)準(zhǔn)的氨基端至羧基端取向(即，N — C)提供。術(shù)語“核酸”涵蓋DNA、RNA、異源雙鏈體和能夠編碼多肽的合成分子。核酸可為單鏈或雙鏈的，而且可為化學(xué)修飾物。術(shù)語“核酸”與“多核苷酸”可互換使用。由于遺傳密碼具有簡并性，故可以使用不止一個密碼子來編碼特定氨基酸，并且本發(fā)明組合物和方法涵蓋編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作說明，否則核酸序列是以5’至3’取向提供。所謂“同源物”，應(yīng)當(dāng)指與對象氨基酸序列和對象核苷酸序列具有某種程度的同一性的實體。同源序列被認(rèn)為包括與對象序列至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%相同的氨基酸序列，序列對比使用常規(guī)的序列對比 工具(如，Clustal、BLAST等)進行。通常，除非另外指明，否則同源物將包括與對象氨基酸序列相同的活性位點殘基。如本文所用，“雜交”是指核酸堿基對的一條鏈與互補鏈在印跡雜交技術(shù)和PCR技術(shù)期間所發(fā)生的過程。嚴(yán)格的雜交條件如下所示50°C和0. 2X SSC (IX SSC=O. 15M NaCl,0. 015M檸檬酸三鈉，pH 7.0)。高度嚴(yán)格的條件如下所示65°C和0. IX SSC(IX SSC=O. 15MNaCl，0. 015M 檸檬酸三鈉，pH 7.0)。如本文所用，“合成”分子通過體外化學(xué)合成或酶促合成而生成、而非由生物體生成。如本文所用，結(jié)合細(xì)胞使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)基因”意指包含整合到其基因組中或作為經(jīng)多代保留下來的附加體而攜帶的非天然(如，異源)核酸序列的細(xì)胞。在將核酸序列插入細(xì)胞的情況下，術(shù)語“引入”意指本領(lǐng)域已知的“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”?！八拗骶辍被颉八拗骷?xì)胞”為在其中表達所引入的載體、噬菌體、病毒或其他DNA構(gòu)建體，包括編碼所關(guān)注的多肽(如，AmyNEST多肽)的多核苷酸的生物體。示例性的宿主菌株為細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括由細(xì)胞形成的原生質(zhì)體，例如芽孢桿菌屬物種的原生質(zhì)體。結(jié)合多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“異源”是指并非天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。結(jié)合多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“內(nèi)源”是指天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“表達”是指基于核酸序列生成多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯?！斑x擇性標(biāo)記”或“可選標(biāo)記”是指這樣的基因，其能夠在宿主中表達以有利于選擇攜帶該基因的宿主細(xì)胞。可選標(biāo)記的實例包括(但不限于)抗微生物劑(如潮霉素、博來霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝益處(如營養(yǎng)益處)的基因?！拜d體”是指旨在將核酸引入一個或多個細(xì)胞類型中的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、曬菌體顆粒、表達盒等等?！氨磉_載體”是指包含編碼所關(guān)注多肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述編碼序列可操作地連接到能夠?qū)崿F(xiàn)DNA在合適宿主中表達的合適控制序列。這種控制序列可包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA上核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的增強子和序列。術(shù)語“可操作地連接”意指特定組分處于一種允許它們以預(yù)期的方式起作用的關(guān)系(包括但不限于并置)。例如，調(diào)控序列可操作地連接到編碼序列，使得編碼序列的表達受調(diào)控序列的控制?！靶盘栃蛄小笔沁B接到蛋白質(zhì)的N-端部分的氨基酸的序列，其促進蛋白質(zhì)細(xì)胞外分泌。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號序列，其在分泌過程期間被切除。如本文所用，“生物活性”是指具有特定生物活性(例如酶活性)的序列。
“水硬度”是對存在于水中的礦物質(zhì)(如，鈣和鎂)的量度。如本文所用，“包含AmyNEST淀粉酶(或AmyNEST多肽)的培養(yǎng)細(xì)胞材料”或者類似的語言是指包含AmyNEST多肽作為組分的細(xì)胞裂解液或上清液。細(xì)胞材料優(yōu)選地來自在出于產(chǎn)生AmyNEST多肽的目的的培養(yǎng)物中生長的異源宿主。本文所引用的所有參考文獻均據(jù)此全文以引用方式并入。2. AmvNEST淀粉酶核酸和多狀本發(fā)明組合物和方法的一個方面為從菌屬涅斯捷連科氏菌菌種中獲得的a-淀粉酶多肽，或者結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽，其統(tǒng)稱為AmyNEST淀粉酶或AmyNEST多肽。示例性的AmyNEST多肽從新疆涅斯捷連科氏菌菌株B4. 2S6中獲得，并且具有序列標(biāo)識號11的氨基酸序列。菌屬涅斯捷連科氏菌在如Stackebrandt, E. et al. (1995) Int. J. Syst.Bacteriol.)45:682-92 (Stackebrandt, E.等人，《國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志》1995年第45卷第682-692頁)中有所描述。另外的AmyNEST多肽與從新疆涅斯捷連科氏菌菌株B4. 2S6獲得的a -淀粉酶具有特定程度的氨基酸序列同一性。這種AmyNEST多肽包括天然存在的變體，包括人為制造的氨基酸置換、插入或缺失的變體，嵌合體和同源物。在一些情況下，這些AmyNEST多肽與從新疆涅斯捷連科氏菌菌株B4. 2S6 (序列標(biāo)識號11)獲得的a -淀粉酶具有至少57%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98%，或甚至至少 99% 的整體同源性 / 同一性。還有另外的AmyNEST多肽與從新疆涅斯捷連科氏菌菌株B4. 2S6獲得的a -淀粉酶具有特定程度的總體氨基酸序列同一性，同時包含新疆涅斯捷連科氏菌菌株B4. 2S6多肽的特定氨基酸序列。例如，AmyNEST多肽可與序列標(biāo)識號11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的總體氨基酸序列同一性，同時包含碳水化合物結(jié)合模塊(CBM) 25 (I)(即序列標(biāo)識號12)和/或CBM 25 (2)(即序列標(biāo)識號13)的氨基酸序列。類似地，AmyNEST多肽可與序列標(biāo)識號11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的總體氨基酸序列同一性，同時包含與CBM 25(1)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。AmyNEST多肽也可包含與CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及與CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。與AmyNEST多肽中的CBM 25(1)和CBM 25⑵有關(guān)的氨基酸序列可通過連接基分隔開，如，與序列標(biāo)識號19具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。AmyNEST多肽可為包含信號序列的“全長”(“f I ”)、“未成熟”或者“前體”多肽、或者不含信號序列的“成熟”多肽。示例性的未成熟AmyNEST多肽具有序列標(biāo)識號9的氨基酸序列，而示例性的成熟AmyNEST多肽具有序列標(biāo)識號11的氨基酸序列。一般來講，多肽的成熟形式活性最強，并且最適用于清潔和其他應(yīng)用。
AmyNEST多肽可被截短，使得它們不含成熟形式的N或C-端。一個示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端第二碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)(即CBM (2))，但保留了 N-端催化結(jié)構(gòu)域。另一個示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端CBM (S卩CBM⑴和CBM⑵)，但保留了 N-端催化結(jié)構(gòu)域。相關(guān)的AmyNEST多肽不含CBM(2)，但保留了 CBM(I)和N-端催化結(jié)構(gòu)域。不含一個或多個CBM的AmyNEST多肽可用于需要高催化轉(zhuǎn)化量的地方，理想地可用于AmyNEST多肽的濃度與要水解的底物相比足夠高以致CBM的存在不會對促進酶底物相互作用起關(guān)鍵作用的地方。類似地，AmyNEST多肽包含保留親本AmyNEST多肽的a -淀粉酶活性特征的至少一部分的片段。優(yōu)選的片段包含催化結(jié)構(gòu)域的至少一部分。如上所述，AmyNEST多肽包括變體多肽，例如包含人為制造的置換的那些。示例性
的置換為保守性氨基酸置換，例如下表中列出的那些。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列與序列標(biāo)識號11的所述氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一'丨生。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多肽，與序列標(biāo)識號11的所述氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一'丨生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的多肽，與序列標(biāo)識號11的所述氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多肽，與序列標(biāo)識號11的所述氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的多肽，與序列標(biāo)識號11的所述氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一'丨生。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離的多肽，包含碳水化合物結(jié)合模塊(CBM) 25 (I)的所述氨基酸序列(序列標(biāo)識號12)和/或CBM25 (2)的所述氨基酸序列(序列標(biāo)識號13)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的多肽，包含的CBM25(1)的所述氨基酸序列和CBM25(2)的所述氨基酸序列被具有序列標(biāo)識號19的所述氨基酸序列的連接基分隔開。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的分離的多肽，具有α-淀粉酶活性。
9.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽的組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物對于從衣物、盤碟或紡織物除去淀粉污潰是有效的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合物，還包含表面活性劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項所述的組合物，其中所述組合物為洗滌劑組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項所述的組合物，其中所述組合物為衣物洗滌劑或衣物洗滌劑添加劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項所述的組合物，其中所述組合物是人工或自動盤碟洗滌劑。
15.一種從表面除去淀粉污潰的方法，包括 在存在水性組合物的情況下溫育所述表面，所述水性組合物包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽， 讓所述多肽水解存在于所述淀粉污潰中的淀粉組分，以形成溶于所述水性組合物的較小的淀粉源分子， 從而從所述表面上除去所述淀粉污潰。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述水性組合物還包含表面活性劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述表面是紡織物表面。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述表面在盤碟上。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述表面是染污的硬質(zhì)表面。
20.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽的分離的多核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的多核苷酸，與序列標(biāo)識號8的所述多核苷酸具有至少90%的核苷酸序列同一'丨生。
22.—種包含根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的多核苷酸的表達載體。
23. —種包含根據(jù)權(quán)利要求22所述的表達載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了涉及得自涅斯捷連科氏菌(Nesterenkonia)和相關(guān)屬菌種的α-淀粉酶的組合物和方法。
文檔編號C12N9/28GK102782126SQ201180009998
公開日2012年11月14日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者B·E·瓊斯, M·科爾克曼 申請人:丹尼斯科美國公司