專利名稱：表達牛γ干擾素的Flp-In-293細胞系及其建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表達牛Y干擾素的Flp-h-293細胞系，其含有編碼牛γ干擾素的基因。該細胞系分泌的牛Y干擾素具有極高的比活力和穩(wěn)定性，可用作牛感染性疾病的臨床治療和相關診斷方法的研究。
背景技術：
γ干擾素(IFN- y )主要是由被有絲分裂原或特異性抗原刺激而活化的⑶4+ Thl 細胞、CD8+ T細胞及NK細胞等產生的細胞因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調節(jié)功能，如活化巨嗜細胞、提高MHC I類和II類分子的表達、促進抗原提呈等，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明外源性的IFN-Y既可以作為藥物用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果；內源性IFN-Y水平的高低在很大程度上可以反映機體的細胞免疫狀態(tài)，而抗原特異性的IFN-Y反應則可以作為機體針對某種特定外來抗原的細胞免疫狀態(tài)的指標。牛Y干擾素基因在正常情況下處于封閉狀態(tài)，必須在各種特異性或非特異性刺激因子的刺激下才能表達，利用傳統(tǒng)的方法從牛血液中提取和純化牛Y干擾素，過程繁瑣且含量很低，無法滿足實際使用的需求，因此要獲得高效價廉的牛Y干擾素，須通過基因工程技術大量制備和生產，使其在動物中的應用成為可能。大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的牛Y 干擾素蛋白不能進行翻譯后的修飾等過程，因此其空間結構及生物活性與天然抗原有較大差別；多以包涵體或部分可溶的形式存在，使其純化復性困難；還有內毒素難以去除等諸多缺陷，因此在臨床應用中受到一定程度的限制。桿狀病毒載體表達系統(tǒng)在病毒感染后期， 由于細胞裂解，胞內物質的釋放會導致目的蛋白的純化困難；釋放的一些水解酶也會降解重組蛋白；加工修飾體系與哺乳動物細胞也存在一定差異。哺乳動物細胞表達的牛Y干擾素與其他表達系統(tǒng)相比，可以對Y-干擾素蛋白進行正確的折疊加工及糖基化、二硫鍵的修飾，因此比活性更高，穩(wěn)定性更好，為II型干擾素相關的理論研究、臨床應用及診斷方法的研究提供了重要的生物材料，具有重要的基礎研究和實際應用意義。本研究利用Flp-h-293為穩(wěn)定轉染宿主細胞系，該細胞系含有一個位于轉錄活性基因座的FRT位點。帶有單一 FRT位點的真核表達質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG 與Flp重組酶表達載體pOG44共轉染Flp-h-293細胞，在Flp重組酶介導下真核表達質粒與細胞系中的FRT位點發(fā)生Flp/FRT位點特異性重組，可使BoIFN- γ基因整合到細胞基因組中相同的活性轉錄染色質區(qū)，在SV40早期啟動子和起始密碼子ATG的控制下得以表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是建立高效穩(wěn)定表達牛Y干擾素的Flp-h-293細胞系。本發(fā)明所述的細胞系，是以Flp-h-293為宿主細胞，在Flp-h_293細胞FRT位點通過Flp/FRT位點特異性重組，使BoIFN- γ基因整合到Flp-h_293細胞基因組中而獲得。 所以本發(fā)明所述的表達牛Y干擾素的Flp-h-293細胞系，是含有編碼牛γ干擾素基因BoIFN-Y的Flp4n-293細胞系，命名為Bi。本發(fā)明所述的細胞系Bi，還可以在所述編碼牛γ干擾素的基因之前加入Kozak序列。本發(fā)明所述的細胞系通過以下方法建立
本發(fā)明根據Flp-h 系統(tǒng)，將牛、干擾素的開放閱讀框(ORF)基因克隆至真核穩(wěn)定表達載體pcDNA5/FRT，與重組酶表達載體pOG44共轉染Flp-In-293細胞，經Hygromycin B 抗性篩選和亞克隆，獲得可穩(wěn)定表達重組牛Y干擾素的Flp-h-293細胞克隆Bi。本發(fā)明中細胞系Bl分泌表達的重組牛、干擾素具有近似天然牛、干擾素的空間結構與生物活性，具有重要的基礎研究和實際應用價值。


圖1.重組質粒pCR2. l-preBoIFN-γ雙酶切鑒定圖
1. λ -EcoT14 DNA 標記；2. DL2000 DNA 標記；3. Kpn I ,Xba I 雙酶切鑒定 pCR2. 1-preBoIFN-y。圖2.重組質粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG雙酶切鑒定圖
1. λ -EcoT14 DNA 標記；2. DL2000 DNA 標記；3. Kpn I ,Xba I 雙酶切鑒定 pcDNA3. 1-preBoIFN-y-FLAG0圖 3.重組質粒 pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG 雙酶切鑒定圖
1. λ -EcoT14 DNA 標記；2. DL2000 DNA 標記；3. Kpn I ,Apa I 雙酶切鑒定 pcDNA5/ FRT-preBoIFN-y-FLAG。圖4.間接免疫熒光鑒定瞬時轉染C0S-1細胞
A, C.抗BoIFN-γ單抗5G4檢測C0S-1細胞；B，D.抗FLAG單抗檢測C0S-1細胞。圖5.夾心ELISA方法檢測重組FLAG-BoIFN-γ表達。圖6.胞內染色分析重組FLAG-BoIFN-γ表達
A.抗BoIFN-γ單抗5G4檢測Bl細胞；B.抗FLAG單抗檢測Bl細胞；C.抗BoIFN-γ 單抗5G4檢測Flp-In-293細胞；D.抗FLAG單抗檢測Flp-In-293細胞。圖7.重組細胞Bl的β -半乳糖苷酶活性分析。圖8.重組細胞Bl的Zeocin抗性分析。
具體實施例方式一、牛Υ干擾素基因的克隆與重組質粒構建 1.引物的設計與合成
參照 GenBank 中 BoIFN-γ cDNA 序列(Accession No. I\C9867)設計引物，上游引物為 5，-AA GGT ACC ATG GCA ATG AAA TAT ACA AGC TA- 3，(SEQ ID NO :1)，下游引物為 5，-TA TCT AGA CGT TGA TGC TCT CCG GC- 3，(SEQ ID NO :2)，上下游引物分別帶有 Kpn I和損a I位點，上游引物中包含了起始密碼子ATG和真核表達所必需的Kozak序列 (一 3位G/A，+ 4位G，即G/ANN_)，下游引物去除了 BoIFN- γ基因終止密碼子。以經人刀豆素A刺激誘導的奶牛脾臟淋巴細胞總RNA中擴增出牛Y-干擾素 cDNA為模板，以SEQ ID NO :1和2的序列為擴增引物，用高保真酶PCR擴增preBoIFN- γ(含信號肽的BoIFN-γ基因序列)基因片段，預期擴增的片段大小為520bp (SEQ ID NO 3)，將擴增的preBoIFN-γ PCR產物克隆至pCR2. 1載體(Invitrogen公司)，重組質粒 PCR2. 1-preBoIFN-y酶切鑒定結果如圖1所示，泳道3上下兩個條帶分別為載體pCR2. 1和目的片段preBoIFN- γ，大小分別約為3900bp和506bp (SEQ ID NO :4)，與預期相符，且測
序結果正確。.重組質粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG 的構建與鑒定
用 Kpn I 和損a I 雙酶切質粒 pCR2. 1-preBoIFN-y 及載體 pcDNA3. I-FLAG (Invitrogen公司)，經過電泳、切膠回收后，通過T4 DNA連接酶連接，獲得瞬時真核表達質粒 pcDNA3. 1-preBoIFN-γ-FLAG。FLAG 片段長 26bp，序列如下C a 1)5，-GAC TAT AAG GAC GAT GAT GAC AAA TA - 3，(.Apa I ) (SEQ ID NO :5)，前 24 個堿基編碼 DYKDDDDK 8 個氨基酸，最后兩個堿基TA與如a I位點第一個G構成終止密碼子，重組質粒酶切鑒定結果如圖2所示，泳道3上下兩個條帶分別為載體pcDNA3. 1和目的片段preBoIFN- γ，大小分別約為M^bp和506bp (SEQ ID NO :4)，與預期相符，且測序結果正確。.重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG 的構建與鑒定
用 Xba I 和如a I 雙酶切質粒 pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG 及載體 pcDNA5/FRT anvitrogen公司)，經過電泳、切膠回收后，通過T4 DNA連接酶連接，獲得穩(wěn)定真核表達質粒pCDNA5/FRT-preB0IFN- y -FLAG,酶切鑒定結果如圖3所示，泳道3上下兩個條帶分別為載體 pcDNA5/FRT 和目的片段 preBoIFN- y -FLAG,大小分別約為 5070bp 和 542bp (SEQ ID NO :6)，與預期相符，且測序結果正確。二、瞬時轉染及鑒定 1.瞬時轉染
轉染前Mh，接種C0S-1細胞(ATCC)于6孔板中，5 X IO5細胞/孔；轉染前將0pti_MEM、 無血無抗DMEM于37 °C水浴預熱，質粒、Lipofectamine置于冰??；分別加入重組質粒 pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG、空載體質粒 pcDNA3. I-FLAG 各 1 μ g 至含 Opti-ΜΕΜ 的 1. 5mL指形管中至總體積100 μ L，振蕩混勻；攪拌式加入6 μ L Lipofectamine至含94 μ L Opti-MEM的2mL指形管中；分別將質粒/Opti-ΜΕΜ攪拌式加入Lipofectamine/Opti-MEM 中，靜置25min后攪拌式加入0. 6mL Opti-ΜΕΜ ；將轉染試劑加入預先用無血無抗DMEM輕洗一遍的細胞中，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱證；吸去培養(yǎng)上清，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL Zeocin),置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；轉染4 后檢測目的蛋白表達情況。.間接免疫熒光鑒定
吸去瞬時轉染細胞培養(yǎng)上清，使用500yL PBS洗一遍，加入300 μ L _20°C預冷的甲醇于-20°C固定IOmin ；用300 μ L PBS漂洗3次，加入現配的抗BoIFN- γ單抗、抗FLAG單抗 (用含m BSA的PBS 1 1000稀釋)置37°C水浴鍋孵育Ih ；使用300 μ L PBS漂洗3次，加入 FITC標記的羊抗鼠IgG (用PBS 1:200稀釋)置37°C水浴鍋Ih ；用300 μ L PBS漂洗3次， 再用300 μ L超純水漂洗2次，加入300 μ L 50%甘油/0. 5Μ碳酸鹽緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖4所示，重組質粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG轉染的C0S-1細胞有綠色熒光，而空載體轉染的C0S-1細胞沒有綠色熒光。三、穩(wěn)定轉染及鑒定
1. Hygromycin B工作濃度的確定在6孔培養(yǎng)板中加入適宜數量的細胞貼壁過夜，第二天換液加入含不同濃度 Hygromycin B的完全培養(yǎng)基，每3-4天補充選擇性培養(yǎng)基，觀察存活細胞的百分率，1-2周后確定Hygromycin B最佳工作濃度在100-150 μ g/mL之間，最終確定為120 μ g/mL。穩(wěn)定轉染及亞克隆純化
根據^witrogen公司的Flp-h System使用說明書，將重組酶表達載體pOG44 (Invitrogen 公司)與真核表達載體 pcDNA5/FRT-preBoIFN_ y -FLAG 共轉染 Flp4n_293 細胞(Invitrogen公司)，加入完全DMEM培養(yǎng)基，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉染4 后消化收獲細胞，用含120 μ g/mL Hygromycin B的完全培養(yǎng)基稀釋后于若干細胞培養(yǎng)皿中進行抗性篩選，每4-5天換液一次，3-4周后出現由單個細胞長成的肉眼可見的克隆。待克隆長至適宜大小，吸去選擇性培養(yǎng)基，吸取少量胰酶-EDTA點于單個細胞克隆上，停頓幾秒進行消化，待細胞團從細胞培養(yǎng)皿上松脫時即吸回消化液，轉移到預先加入選擇性培養(yǎng)基的6孔板中以終止消化，并用移液器吹打使細胞分散均勻，進行擴大培養(yǎng)并采用有限稀釋法進行亞克隆獲得重組細胞Bi。檢測
使用胰酶-EDTA分別消化、收獲Bl細胞、Flp-Inj93細胞，然后接種于6孔板中，5 X IO5 細胞/孔；置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)48h;收集細胞培養(yǎng)上清，使用胰酶消化細胞，加入適量PBS將細胞懸浮并進行反復凍融裂解；將收集的細胞上清、裂解上清使用B0VIGAM Mycobacterium bo vis Gamma Interferon Test Kit for cattle (Prionics 公司)檢測重組FLAG-BoIFN-γ的表達情況，具體操作參照試劑盒說明書進行。結果如圖5所示，細胞克隆Bl可以表達重組FLAG-BoIFN- γ，并且主要以分泌形式表達，而在陰性對照Flp-h_293 細胞培養(yǎng)上清和裂解上清中均未檢出重組FLAG-BoIFN- γ，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所
7J\ ο胞內染色檢測
使用胰酶-EDTA分別消化、收獲Bl和Flp-h-293細胞，然后接種于6孔板中，5 X IO5細胞/孔；加入阻斷劑BFA，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)證；吸去培養(yǎng)上清，每孔加入新鮮選擇培養(yǎng)基，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)若干小時；吸去細胞上清，加入適量PBS將細胞吹起加入1. 5mL指形管中；1500rpm，4°C離心5min，使用PBS洗兩次，加入固定液，室溫固定15min ；3000rpm，4°C離心5min，使用PBS洗兩次，加入破膜劑，室溫作用15min ；3000rpm, 4°C離心5min，使用PBS洗兩次，加入現配的抗BoIFN- γ單抗5G4、抗FLAG單抗(用含2%BSA 的PBS 1:200稀釋)，室溫作用30min ；3000rpm，4°C離心5min，使用PBS洗兩次，加入現配的 FITC標記的羊抗鼠IgG (用含2%BSA的PBS 1:200稀釋)，室溫作用30min ；3000rpm，4°C離心5min，使用PBS洗兩次，加入100 μ L PBS重懸細胞，上機檢測，結果如圖6所示，在進行阻斷后，可以在Bl細胞克隆胞內檢測到FLAG-BoIFN-γ的表達。β -半乳糖苷酶活性分析及kocin抗性分析
按照hvitrogen公司β -Gal Staining Kit說明書進行β _半乳糖苷酶活性分析。用胰酶-EDTA分別消化Bl和Flp-h-293細胞，加入選擇培養(yǎng)基將細胞懸浮并進行計數，加入適量細胞于M孔板，置37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)貼壁12h ；吸去M孔板中細胞培養(yǎng)上清，使用 250 μ L PBS洗一遍；每孔加入300 μ L固定液(含21甲醛/0. 2%戊二醛的PBS溶液)室溫固定 IOmin ；固定的同時配染色液溶液A (400mM鐵氰化鉀)、溶液B(400mM氰亞鐵酸鉀)、溶液C(400mM 氯化鎂)各 2. 5μ L，含 20mg/mL Χ-gal 的 DMF (N-N-二甲基甲酰胺)溶液 12. 5 μ L， PBS 230 μ L，混勻；吸去固定液，使用250 μ L PBS洗兩遍，每孔加入250 μ L染色液，置37°C 培養(yǎng)箱0. - 后，在倒置顯微鏡下觀察染色情況。結果如圖7所示，Flp-h-293細胞全部被染成藍色，細胞Bl沒有被染成藍色，即細胞Bl不再具有半乳糖苷酶活性。Zeocin抗性分析在M孔板中進行，用胰酶-EDTA分別消化Bl和Flp-h_293細胞，加入培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Zeocin，不含Hygromycin B)將細胞懸浮并進行計數后，加入適量細胞于M孔板，置37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，3、天后觀察細胞生長情況。結果如圖8所示，細胞Bl不再具有kocin抗性，在含100 μ g/mL Zeocin的培養(yǎng)基中不能生長。四、抗病毒活性滴定
采用微量細胞病變抑制法測定細胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性。用胰酶-EDTA消化MDBK 細胞，加入完全DMEM培養(yǎng)基將細胞懸浮并進行計數，加入適量細胞于96孔板，置37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)貼壁12h ；吸去上清，將含重組BoIFN-γ的293細胞培養(yǎng)上清(不含Hygromycin B)使用維持液作倍比稀釋，100 μ L/孔，置37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)Mh ；吸去細胞培養(yǎng)上清， 各孔加入100 TCID50的VSV, 100 μ L/孔；置37°C培養(yǎng)箱吸附2h后吸去上清，加入維持液， 100 μ L/孔，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細胞病變情況。以每mL干擾素樣品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50%)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數值定義為1個干擾素單位(U)。結果顯示，構建的Flp-h-293細胞系Bl表達的重組FLAG-BoIFN- γ具有較高抗病毒活性，達到 1.024 X IO4 U/mL。
權利要求
1.一種表達牛Y干擾素的細胞系Bi，其特征在于是含有編碼牛γ干擾素基因 BoIFN- γ 的 Flp-In-293 細胞系。
2.根據權利要求1所述的細胞系Bi，其特征在于在所述編碼牛Y干擾素的基因之前有Kozak序列。
3.一種建立權利要求1所述細胞系Bl的方法，包括以下步驟將序列正確的 preBoIFN- γ片段構建成重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG,采用脂質體轉染法將重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG與重組酶表達載體pOG44共轉染Flp-In-293細胞，使用含120yg/mL Hygromycin B的DMEM培養(yǎng)基進行陽性克隆篩選，擴大培養(yǎng)后采用有限稀釋法進行亞克隆，通過鑒定后獲得重組細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達牛γ干擾素的Flp-In-293細胞系，該細胞系命名為B1，含有編碼牛γ干擾素的基因。構建細胞系B1的方法是將序列正確的preBoIFN-γ片段構建成重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG，采用脂質體轉染法將重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG與重組酶表達載體pOG44共轉染Flp-In-293細胞，使用含120μg/mLHygromycinB的DMEM培養(yǎng)基進行陽性克隆篩選，擴大培養(yǎng)后采用有限稀釋法進行亞克隆，通過鑒定后獲得重組細胞系。細胞系B1分泌的牛γ干擾素具有極高的比活力和穩(wěn)定性。
文檔編號C12N5/10GK102321589SQ20111030671
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權日2011年10月10日
發(fā)明者孫林, 徐正中, 殷月蘭, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 陳祥, 黃金林 申請人:揚州大學