專利名稱：表達(dá)牛β干擾素的CHO細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)脊椎動物(3干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼所述 動物P干擾素的基因。更具體地，本發(fā)明公開了表達(dá)牛(3干擾素的CHO 細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及利用上述CHO細(xì)胞系生產(chǎn)牛(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方 法以及通過該方法獲得的的牛(3干擾素，其具有極高的比活性和穩(wěn)定性， 可用作牛卩干擾素生物學(xué)活性檢測時的標(biāo)準(zhǔn)品和用于牛傳染性疾病的預(yù)防 和治療。
背景技術(shù)：
I型干擾素是脊椎動物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的 重要研究領(lǐng)域。如今，病毒感染宿主時逃避干擾素等天然免疫的機(jī)制成為 研究熱點["3]，這為病毒防治在理論上提供有力支持。牛病毒性腹瀉病毒 (bovine viral diarrhea virus， BVDV) [4]、牛皰疹病毒(Bovine herpesvirus ) [s]和牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus)間等病毒在感染宿 主時，破壞I型干擾素系統(tǒng)都為它們突破宿主免疫系統(tǒng)的一個重要的機(jī)制。
I型干擾素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [7'8]、慢性丙型肝 炎(chronic hepatitis C) [9]、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS) [10]、 腫瘤疾病[11'12]及其它疾病[13'14]的治療中發(fā)揮了重要作用。受到人類干擾素 在治療中的鼓舞，牛I型干擾素的表達(dá)和疾病治療研究也很多。目前，國 內(nèi)牛I型干擾素的生產(chǎn)主要采用原核[15]和酵母表達(dá)系統(tǒng)[16]。
因此，不管是I型干擾素相關(guān)的基礎(chǔ)研究還是臨床使用，都需要高活 性、天然的I型干擾素樣品，此外還需要對其生物學(xué)活性進(jìn)行準(zhǔn)確、便捷 的定量。干擾素的定量需要穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，目前農(nóng)業(yè)部頒布的獸用生物制 品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的脊椎動物天然牛白細(xì)胞干擾素是以雞新城疫病毒誘導(dǎo)牛 白細(xì)胞獲得的，制作工藝和產(chǎn)品成分復(fù)雜，最終產(chǎn)品的活性較低，約為 10000 AU* mL"。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的脊椎動物干擾素是與其它表達(dá)系統(tǒng)相比能夠正確折疊、糖基化和翻譯后修飾，因此更穩(wěn)定、比活性更高、更 適合作為標(biāo)準(zhǔn)品，尤其對于IFN-(3，而目前缺乏源于哺乳動物細(xì)胞的脊椎
動物牛的IFN-p標(biāo)準(zhǔn)品。綜上，獲得高水平哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的脊椎動物
牛I型干擾素具有重要的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為建立高效表達(dá)牛IFN-卩的CH0-K1細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
具體地，本發(fā)明涉及如下各項
1. 一種表達(dá)牛P干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼牛(3干擾素的基因。
2. 根據(jù)以上1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述牛(3干擾素的氨基酸序 列如SEQ IDNO:2所示。
3. 根據(jù)以上l所述的CHO細(xì)胞系，其中所述編碼牛p干擾素的基因 如SEQ ID NO: 1所示。
4. 根據(jù)以上1-3任一項所述的CHO細(xì)胞系，其中在所述編碼所述動 物(3干擾素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根據(jù)以上1所述的CHO細(xì)胞系，其是保藏號為CGMCC No. 2415 的CHO細(xì)胞系。
6. —種生產(chǎn)牛P干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方法，該方法包括
1) 培養(yǎng)根據(jù)以上1至5中任何一項所述的CHO細(xì)胞系；
2) 從所述的CHO細(xì)胞系的培養(yǎng)液中提取P干擾素，用作牛P干擾素 的標(biāo)準(zhǔn)品。
7. 根據(jù)以上6的方法，其中所述CHO細(xì)胞系是保藏號為CGMCC No. 2415的CHO細(xì)胞系。
8. 根據(jù)以上6或7的方法生產(chǎn)的牛(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品。
9. 一種用于牛傳染性疾病的預(yù)防和治療的試劑盒，其包含根據(jù)以上6 或7的方法生產(chǎn)的牛P干擾素標(biāo)準(zhǔn)品。
10. 根據(jù)以上1至5中任何一項所述的CHO細(xì)胞系生產(chǎn)的牛(3干擾素 在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于牛傳染性疾病的預(yù)防和治療。所述牛 傳染性疾病特別是牛病毒性腹瀉病毒、牛皰疹病毒和牛呼吸道合胞病毒等病毒引起的疾病。
更具體地，在本發(fā)明的一個實施方案中，將牛P干擾素(BoIFN-p) 的ORF基因克隆至真核穩(wěn)定表達(dá)載體pCI-neo (BoIFN-卩在高效啟動子 CMV控制下表達(dá))，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CH0-K1細(xì)胞，經(jīng)G418壓力篩選和2 次單克隆，篩選出可穩(wěn)定表達(dá)重組BoIFN-卩的CHO細(xì)胞克隆 (CHO-BoIFN-p)。本發(fā)明的一株陽性CHO細(xì)胞克隆(CHO-BoIFN-(3，分 類命名中國倉鼠卵巢細(xì)胞(C7^"e //amwer Ova/^ CW/))于2008年3月 25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC， 中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2415。在25cr^的細(xì)胞瓶中(5ml培 養(yǎng)液)，重組BoIFN-卩的累積表達(dá)水平達(dá)到8.4xl05AU(antiviralunits)/ml， 每天的表達(dá)量可達(dá)5.0xl05 AU/ml或0.5 AU/個細(xì)胞。CHO-BoIFN-(3細(xì)胞可 在無G418壓力篩選下穩(wěn)定表達(dá)至少20代。表達(dá)的重組BoIFN-(3可以誘導(dǎo) MDBK細(xì)胞表達(dá)牛Mx蛋白。綜上，本發(fā)明中CHO-BoIFN-p細(xì)胞穩(wěn)定、 高效表達(dá)的重組BoIFN-(3具有天然牛I型干擾素的生物學(xué)活性，具有重要 的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究價值。
本發(fā)明的專利性
新穎性
與已經(jīng)使用的表達(dá)脊椎動物牛P干擾素的技術(shù)相比(目前干擾素表達(dá)
所采用的表達(dá)系統(tǒng)主要是原核、酵母表達(dá)系統(tǒng)，使用CHO表達(dá)脊椎動物 牛(3干擾素的國內(nèi)外未見報道)，表達(dá)的技術(shù)路線完全不同。表達(dá)的產(chǎn)物 在折疊、糖基化、翻譯后修飾、穩(wěn)定性、比活性上要大大優(yōu)于已有的技術(shù) 手段(原核、酵母)。
創(chuàng)造性
1 、我們擴(kuò)增獲得的牛的氨基酸序列和堿基序列與已報道的(GeneBank 登錄的序列)都有所不同；
2、 與已有的原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)比較，本發(fā)明CHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出 的干擾素在蛋白的折疊、糖基化等翻譯后修飾上最接近于天然干擾素，比 活性更高，約是原核的10倍。
3、 由于我們的目的是表達(dá)最接近天然活性的干擾素，而農(nóng)業(yè)部頒布的 獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的天然豬白細(xì)胞干擾素是以雞新城疫病毒誘導(dǎo) 豬白細(xì)胞獲得的，制作工藝和產(chǎn)品成分復(fù)雜，最終產(chǎn)品的活性約10000AU mL"。與此相比較，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的BoIFN-P的表達(dá)水平是其70 倍或以上，且工藝簡單、產(chǎn)品成分容易控制，具有極大的優(yōu)越性。
綜上因此以CHO表達(dá)的牛|3干擾素與原核和酵母表達(dá)的相比較具 有極大的優(yōu)越性和創(chuàng)造性。
附圖簡述


圖1. RT-PCR驗證BoIFN-p基因在CHO-BoIFN-p細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 M. DL2000標(biāo)記；1. CHO-BoIFN-卩細(xì)胞；B. CHO-K1細(xì)胞； 圖2.重組BoIFN-卩在CHO-BoIFN-卩細(xì)胞中的表達(dá)； 圖3.傳代次數(shù)和G418對CHO-BoIFN-(3細(xì)胞表達(dá)重組BoIFN-|3的影
響；
圖4.免疫印跡檢測BoIFN-(3cHo誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞Mx蛋白的表達(dá)。 0.空白對照；M.蛋白分子量標(biāo)記；A F. 1.02X10"， 1.02X10°，…， 1.02X 104稀釋的BoIFN-(3cho;
圖5.牛卩干擾素的氨基酸序列(SEQIDNO:2); 圖6.編碼牛卩干擾素的基因(SEQIDNO:l);
圖7.質(zhì)粒pCN-BoIFN-卩的核苷酸序列，其中1144-1701位(斜體部 分)是BoIFN-卩基因，1118-1143位(雙下劃線標(biāo)記部分)是Kozak序歹U。
具體實施例方式
下文將參考實施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例 說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利 要求具體限定。
實施例1.高效穩(wěn)定表達(dá)重組牛P干擾素的CHO表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 1材料與方法
1.1質(zhì)粒、細(xì)胞株和毒株
穩(wěn)定真核表達(dá)載體pCI-neo (pCN)購自Promega公司，neo在SV40早期啟動子的控制下表達(dá)。CHO-K1細(xì)胞株商購自ATCC (ATCC No. CCL-61), CHO-K1細(xì)胞于含10%FBS的DMEM-Ham，s F12 (DF12)培 養(yǎng)基(invitrogen)中土咅養(yǎng)。
pMD18-T載體購自TaKaRa公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+) (Novagen 公司)、傳代牛腎細(xì)胞系(MDBK) (ATCC No. CCL-22)和BHK-21細(xì) 胞(ATCCNo. CCL-10)均由本實驗室保存；原代雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)采用10日齡的SPF雞胚常規(guī)方法[17]制備；表 達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒(VSV*GFP)由本實驗室參考文 獻(xiàn)通過反向遺傳技術(shù)構(gòu)建網(wǎng)、MDBK細(xì)胞系滴定PFU(plaque forming unit) 后-7(TC保存；新城疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615)商購自中國微 生物菌種保藏管理委員會組織系統(tǒng)(CCCCM)下屬的獸醫(yī)微生物菌種保 藏管理中心(CVCC)，由本實驗室保存，CEFs滴定PFU后-70'C保存?zhèn)?用。
1.2試劑與儀器
T4 DNA聚合酶購自MBI公司。Ni-NTA瓊脂糖親和樹脂、硝酸纖維 素膜購自Pierce公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、魚皮蛋白購自 Sigma公司；高亮螢光素酶檢測試劑(Bright-Glo Luciferase assay system) 購自Promega公司；各種限制性內(nèi)切酶和Ex-Taq酶都購自TaKaRa公司； T4 DNA連接酶購自MBI公司；質(zhì)粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司； 轉(zhuǎn)染試劑Fugene6購自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)購 自Coming公司；熒光倒置顯微鏡為LEICA公司產(chǎn)品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)為Bio-Tek公司產(chǎn)品，可檢測發(fā)光和熒光； CEQ8000自動測序儀為Beckman公司產(chǎn)品。Grace's培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng) 基、Trizol和M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司。熒光素(FITC) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉生物技術(shù)公司。DAB顯色試劑盒購自博 士德公司。
1.3干擾素基因克隆與質(zhì)粒構(gòu)建從GenBank獲取BoIFN-卩的ORF序列(GenBank Accession No. E00139),設(shè)計引物。上游引物為5，-TGCCACCATGACCTACCGGTG CCTC，下游引物為5，-ACAGGTGGG AGATGTTCAGTC AC，上游引 物在起始密碼子ATG前加入了利于真核表達(dá)的Kozak序列。
傳代牛腎細(xì)胞系(MDBK) (ATCCNo. CCL-22)細(xì)胞生長至密度為 90%左右時，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為l.O接種新城 疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615 )。 8h后收細(xì)胞，用Trizol (Invi加gen 公司)提取總RNA，采用上述引物進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增的BoIFN-pPCR產(chǎn) 物克隆到pMD18-T載體獲得質(zhì)粒pMD18-BoIFN-卩，通過測序鑒定。
從質(zhì)粒pMD18-BoIFN-卩以I/Z&a I雙酶切下BoIFN-(3的ORF片斷， 克隆至以屈o I/A%e I雙酶切的質(zhì)粒pCAGGS[18'19]，獲得瞬時真核表達(dá)質(zhì)粒 pCA-Bo麗-卩。
從質(zhì)粒pMD18-BoIFN-卩以Sal I/Xba I雙酶切下BoIFN-(3的ORF片斷，
以T4 DNA聚合酶平滑化末端后克隆至Sma I酶切的穩(wěn)定真核表達(dá)質(zhì)粒 pCI-neo (在本文中也稱為pCN) (Promega公司)，獲得穩(wěn)定真核表達(dá)質(zhì)粒 pCN-Bo顧-卩。
1.4瞬吋轉(zhuǎn)染
以pCA-BoIFN-卩和pCAGGS，按照Fugene6 (Roche公司)按操作說 明書轉(zhuǎn)染至BHK-2T細(xì)胞(ATCCNo.CCL-10)(于含5%FBS的DMEM 中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C及5XC02)，于轉(zhuǎn)染后16 h換新鮮培養(yǎng)基，繼 續(xù)在相同條件下培養(yǎng)48h收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別命名為BoIFN-Ppca和 mockpCA，分裝并于-7(TC保存?zhèn)溆谩?br> 1.5抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量檢測的操作步驟見參考文獻(xiàn)[17]，具體如下MDBK 細(xì)胞于96孔細(xì)胞板中生長至密度為90%，棄上清，每孔加IO倍梯度稀釋 IFN樣品100pl，每個稀釋倍數(shù)設(shè)3個平行對照孔，37"及5%<:02培養(yǎng)條 件下處理24h后，棄上清，用含2。/。FBS的DMEM稀釋VSV*GFP，按每孔30000 PFU (lOOpl)加入病毒稀釋液，同時設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染上清處理，只加 病毒液的病毒對照(Virus Control, VC)孑L。不加干擾素和病毒的孔，作 為空白孔(Blank Control, BC)。接毒后至VC孔的CPE (cyt叩athic effect) 約為100%時，熒光倒置顯微鏡下觀察GFP表達(dá)及病毒感染復(fù)制情況。最 后所有孔每孔加入50pl細(xì)胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，于搖床上裂解15min釋放細(xì)胞內(nèi)的 GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性設(shè)置為70，激發(fā)光485 nm， 吸收光528 nm)檢測每孔綠色熒光蛋白的相對表達(dá)水平。判定以BC孔 校0，以VC孔為參照，每mL中，以表達(dá)綠色熒光數(shù)減少為VC孔50X 的平均最高稀釋度為一個抗病毒活性抑制單位(Antiviral Unit， AU)，計 算具體如下。
基于VSV*GFP檢測方法是計算半數(shù)病毒復(fù)制抑制的稀釋倍數(shù)，方法 如下若綠色熒光蛋白相對熒光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用 F表示，以BC孔校0，則50%病毒復(fù)制抑制的熒光值(F50) 二F (VC) /2，按下面公式計算IFN的抗病毒活性單位log，Q[每mL中IFN抗病毒活 性單位(AU) ] = [F50—F(小于F50孑L)]/[F(高于F50孑L)一F(小于F50孑L)] 十logK)[小于F50孔的稀釋倍數(shù)]。
1.6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
首先確定篩選培養(yǎng)基中合適的G418 (invitrogen)濃度，方法如下 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種每孔1000個CHO-K1細(xì)胞，并加G418使其濃度分 別為100、 200、 300 1200昭/ml，選擇能在10_ 14天把細(xì)胞徹底殺死的 孔作為G418的篩選濃度。
參照轉(zhuǎn)染試劑Fugene 6操作說明書轉(zhuǎn)染pCN-BoIFN-卩至CHO-K1細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染后24小時，按1:8的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，用含有800嗎/mlG418 的壓力篩選培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)細(xì)胞，10 14天后，用克隆環(huán)圈住具有新霉素 抗性的細(xì)胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng) 板擴(kuò)大培養(yǎng)。篩選出的不同細(xì)胞克隆按照0.5><106個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中生長至密度為100%后24小時，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別如上用 VSV*GFP進(jìn)行抗病毒活性滴定，選擇表達(dá)水平最高的克隆按限稀釋法再進(jìn)行單細(xì)胞克隆，按上述步驟篩選表達(dá)量最高的克隆后，擴(kuò)增并按常規(guī)方
法凍存細(xì)胞，命名為CHO-BoIFN-P，含有重組BoIFN-(3的細(xì)胞培養(yǎng)上清 命名為BoIFN-(3cho。將CHO-BoIFN-P于2008年3月25日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏 號為CGMCC No. 2415。
1.7雞Mx蛋白多克隆抗體的制備
I型IFN發(fā)揮其抗病毒生物學(xué)功能的途徑之一是經(jīng)由JAK-STAT信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活Mx啟動子(Mx promoter, Mxp)，表達(dá)的Mx蛋白(Mx protein)能夠抑制負(fù)鏈RNA病毒復(fù)制；Mxp有較好的專一性，它不能被 白細(xì)胞介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 等其它細(xì)胞因子啟動。通過對雞、豬和牛的Mx蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源 性分析，發(fā)現(xiàn)有部分同源性，主要位于Mx蛋白的N端，因此設(shè)計引物擴(kuò) 增雞Mx蛋白的N端序列，長810bp，并克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)， 表達(dá)的原核蛋白經(jīng)Ni-NTA免疫小鼠制備的多抗，用于這三種動物的Mx 蛋白的檢測。
新城疫病毒MOI為1.0感染細(xì)胞密度為約為100X的CEFs，待細(xì)胞病 變達(dá)60%—80%時收獲細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，并用括號中的引物 (上游引物為5，-GGGGATATC AGC AATCAG ATGGCTTTC-3，，引入 五coi V酶切位點；下游引物為5，-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTT TTG-3，引入I酶切位點)進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增雞Mx蛋白ORF的前半 部分基因片段，PCR產(chǎn)物以五coR V/Sa/ I雙酶切后克隆到同樣EcoR VASa/ I雙酶切的pET-32a(+)上，獲得雞Mx蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，雞Mx 蛋白表達(dá)框架與載體上的His標(biāo)簽融合。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中， 用0.5mMIPTG于37T:誘導(dǎo)3小時后，SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達(dá)。 表達(dá)產(chǎn)物參照Ni-NTA瓊脂糖親和樹脂純化說明書純化后，透析除去尿素。 以純化的雞Mx蛋白原核表達(dá)蛋白按常規(guī)方法免疫BALB/C小鼠(商 購自維通利華公司)，免疫前斷尾采血，分離免疫前小鼠血清，然后按常 規(guī)程序免疫小鼠并采血分離血清，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?.8 Mx蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
MDBK細(xì)胞于6孔板中生長至單層匯合，分別加入梯度稀釋的以上獲 得的BoIFN-(3CH0， 37。C及5XC02孵育24小時后，用胰酶(amresco)消 化細(xì)胞，3000rpm離心5min后收集細(xì)胞，加入lxSDS上樣緩沖液100^1 混勻，于沸水中煮20min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜， 5%魚皮蛋白(PBST配制)封閉過夜，以PBST 1:100稀釋雞Mx蛋白小 鼠多抗為一抗，PBST 1:5,000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG為二 抗，DAB顯色3 5分鐘后加去離子水終止。
2結(jié)果
2.1瞬時表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性滴定
PCR產(chǎn)物電泳表明擴(kuò)增出的片段為581bp，與預(yù)期相符，經(jīng)測序鑒定 證實獲得了 BoIFN-p的完整ORF基因。再將BoIFN-卩的完整ORF克隆至 高效真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中，構(gòu)建成pCA-BoIFN-(3，并酶切鑒定正確。 以pCA-BoIFN-P和pCAGGS瞬時轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后16 h換液， 再培養(yǎng)48h收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別命名為BoIFN-PpCA和mockpCA，其抗 病毒活性用VSV*GFP于MDBK細(xì)胞進(jìn)行抗病毒活性滴定。實驗結(jié)果表明， 105倍稀釋的BoIFN-(3pCA仍然能夠部分抑制VSV*GFP表達(dá)GFP (即抑制 病毒的復(fù)制)，而10倍稀釋的mockpCA幾乎無抑制VSV*GFP表達(dá)GFP的 能力，計算出BoIFN-PpCA抗病毒活性約為lO"AU，mL-1，證實了所獲得的 BoIFN-卩完整ORF基因可用于下一步構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。
2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構(gòu)建
為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)BoIFN-卩的質(zhì)粒，首先從質(zhì)粒pMD18-BoIFN-卩以 5b/ 1/力a I雙酶切下BoIFN-P的ORF片斷，亞克隆至同樣雙酶切的質(zhì)粒 pCN，獲得穩(wěn)定真核表達(dá)質(zhì)粒pCN-BoIFN-p，使BoIFN-(3在CMV啟動子
的控制下表達(dá)。
ii2.3穩(wěn)定表達(dá)重組BoIFN-p的CHO-kl細(xì)胞克隆的篩選
為了確定篩選培養(yǎng)基中合適的G418濃度，于24孔板中每接種1000 個CHO細(xì)胞，G418濃度在700 800(ig/ml之間時，細(xì)胞于10—14天全 部死亡。因此選擇800 pg/ml作為今后實驗中CHO細(xì)胞的壓力篩選培養(yǎng)基 的G418濃度。
轉(zhuǎn)染pCATN-BoIFN-p至CHO細(xì)胞后，只有穩(wěn)定整合的基因才能穩(wěn)定 轉(zhuǎn)錄，用含有800嗎/mlG418的壓力篩選培養(yǎng)基篩選具有新霉素抗性的細(xì) 胞集落并擴(kuò)大培養(yǎng)，通過檢測各細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清的抗病毒活性，篩選出 表達(dá)量最高的克隆。此后再進(jìn)行一次單細(xì)胞克隆篩選，最后獲得單純、穩(wěn) 定表達(dá)的細(xì)胞克隆，液氮存種，命名為CHO-BoIFN-P。此后CHO-BoIFN-(3 細(xì)胞以含有400嗎/ml G418的壓力篩選培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。將該 CHO-BoIFN-(3于2008年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2415。
2.4重組BoIFN-p在CHO-BoIFN-p細(xì)胞中的表達(dá)
用Trizol提取CHO-BoIFN-卩細(xì)胞總RNA， RT-PCR擴(kuò)增BoIFN-卩基 因，擴(kuò)增出581bp的片段(圖1泳道1)，與預(yù)期相符，未從CHO-K1細(xì) 胞中擴(kuò)增出片段(圖1泳道B)，表明BoIFN-卩基因在CHO-BoIFN-(3細(xì)胞 中轉(zhuǎn)錄為mRNA。
CHO-BoIFN-P細(xì)胞于含有10%FBS的DF12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1:7傳 代至25cn^底面積的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(每瓶加培養(yǎng)液5ml，長滿后約5><106個 細(xì)胞)，待細(xì)胞長滿后，用3ml PBS洗細(xì)胞2次，換新鮮培養(yǎng)液，然后分 別于24、 48和72小時取樣，每次取10(Hd。所取含有重組BoIFN-卩的細(xì) 胞培養(yǎng)上清命名為BoIFN-(3cho，每次取的樣品凍存于-7(TC備用。所有樣 品以VSV*GFP在MDBK細(xì)胞上于同一批次進(jìn)行抗病毒活性滴定，結(jié)果如 圖2所示，最高的累積表達(dá)量可達(dá)8.4x105 AU/ml， 24 48 h的表達(dá)量可 達(dá)5.0x105 AU/ml，此時每個細(xì)胞每天能夠表達(dá)約0.5 AU/ml的重組 BoIFN-P，此后培養(yǎng)液中的重組BoIFN-P—直維持在約8.0x105 AU/ml左右， 不再增加。結(jié)合BoIFN-(3 mRNA的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性，可證實 BoIFN-(3基因在CHO細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
2.5 CHO-BoIFN-p細(xì)胞表達(dá)水平與傳代次數(shù)的關(guān)系
CHO-BoIFN-卩細(xì)胞分別在含有G418 (400嗎/ml)的篩選培養(yǎng)基和不含 有G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，于25 cn^的細(xì)胞瓶中、37^及5%(302條件 下培養(yǎng)，每3天到4天傳一代，基本每周傳代2次。分別于第0、 5、 10、 15和20代取樣，每種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞做3個重復(fù)。取樣前，上述兩種 培養(yǎng)條件下的CHO-BoIFN-(3細(xì)胞以相同細(xì)胞密度接種，待細(xì)胞形成匯合 單層時，再繼續(xù)培養(yǎng)24小時取樣，樣品保存于-7(TC，最后于同一批次進(jìn) 行抗病毒活性滴定。結(jié)果表明(圖3)，雖然每代次的重組BoIFN-(3表達(dá) 量都有所不同，這可能是由于細(xì)胞密度和狀態(tài)不能夠每次都保證完全相同 的原因?？偟膩砜矗珻HO-BoIFN-P細(xì)胞的重組BoIFN-P表達(dá)量水平非常 穩(wěn)定，無論是否有G418壓力存在，可穩(wěn)定表達(dá)至少20代。
實施例2. BoIFN-Pcho的生物學(xué)活性研究
把102316AU，mL—1的通過實施例1的CHO表達(dá)系統(tǒng)獲得的 BoIFN-卩cho (以VSV*GFP于MDBK細(xì)胞上滴定其抗病毒活性)進(jìn)行10 倍梯度稀釋(即O.l、 1.02、 10.2、 1.02xl02、 1.02xl。3和1.02xl04AUntiL"， 圖4泳道A F)，分別刺激MDBK細(xì)胞24小時，收獲MDBK細(xì)胞。然 后以雞Mx蛋白小鼠多抗為一抗，羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡檢測牛 Mx蛋白(分子量約78kDa)的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示BoIFN-(3cHo能夠 誘導(dǎo)出可檢測到的Mx蛋白下限為10.2Al^mL"(圖4泳道C)，且在10 K^AU'mL-1 (圖4泳道C F)范圍內(nèi)，誘導(dǎo)出的Mx蛋白量和BoIFN-|3CHO 活性單位成正相關(guān)，顯示BoIFN-卩cho具有良好的I型干擾素生物學(xué)活性； 未加干擾素誘導(dǎo)的空白對照孔(圖4泳道0)未誘導(dǎo)出Mx蛋白。
抗病毒活性滴定結(jié)果和Mx蛋白的誘導(dǎo)結(jié)果兩者相符合，表明 CHO-BoIFN-P細(xì)胞表達(dá)的重組BoIFN-p具備天然I型干擾素的生物學(xué)功本發(fā)明人建立的CHO-BoIFN-(3細(xì)胞(CGMCCNo.2415)能夠穩(wěn)定高 水平表達(dá)重組BoIFN-(3，累積表達(dá)的最高水平可達(dá)約8.4xl05AU/ml，每天 表達(dá)水平可達(dá)約5.0xl05 AU/ml，平均每個細(xì)胞每天能夠表達(dá)約0.5 AU 的重組BoIFN-p。表達(dá)重組BoIFN-P的CHO-BoIFN-P細(xì)胞是在G418的壓 力篩選下篩出的，但是經(jīng)過細(xì)胞單克隆篩選出的克隆，無論在有無G418 的培養(yǎng)液中傳20代，表達(dá)能力基本不變，表明BoIFN-p的表達(dá)框架已穩(wěn) 定整合至CHO-K1細(xì)胞的基因組中。
天然的I型干擾素發(fā)揮其抗病毒生物學(xué)活性的途徑之一激活是誘導(dǎo) Mx蛋白的表達(dá)。通過比較雞、豬、牛、鼠和人的Mx蛋白氨基酸序列， 可以發(fā)現(xiàn)在Mx蛋白的N端有幾段氨基酸序列同原性較高，因此本實驗使 用雞的Mx蛋白N端氨基酸制備的鼠多克隆抗體作為檢測雞、豬和牛Mx 蛋白的抗體。CHO-BoIFN-P細(xì)胞表達(dá)的重組BoIFN-p處理MDBK細(xì)胞后， 通過免疫印跡檢測出牛Mx蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，且與重組BoIFN-P的抗病毒 活性單位成正相關(guān)。這些都表明了 CHO-BoIFN-(3細(xì)胞表達(dá)的重組BoIFN-P 具有I型干擾素的生物功能，具有良好的天然牛IFN-P生物學(xué)活性。
哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的IFN-(3的糖基化和折疊與天然的完全相同，正確 的糖基化對于IFN-p的活性和穩(wěn)定性至關(guān)重要；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以病毒 為載體，在感染后期收獲表達(dá)產(chǎn)物，此時昆蟲細(xì)胞大部分死亡裂解，這為 純化和應(yīng)用帶來了問題，而CHO系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物熱源極少，經(jīng)過簡單的 純化就可以應(yīng)用于動物機(jī)體的抗感染預(yù)防治療；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)需要不 斷制備新鮮的昆蟲細(xì)胞和重組桿狀病毒，工藝復(fù)雜，而CHO細(xì)胞可連續(xù) 穩(wěn)定傳代，無需重新制備新鮮細(xì)胞，工藝簡單；CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的重 組BoIFN-p具有良好的熱及振蕩等穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未顯示)，且具有極高的 比活性，既使上清濃縮10倍也不能在SDS-PAGE膠上看到表達(dá)的重組 BoIFN-卩條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)論，本研究建立的CHO-BoIFN-p細(xì)胞表達(dá)的重組BoIFN-P具有天 然牛I型IFN相同的生物學(xué)功能，表達(dá)水平高，且具有極高的比活性和穩(wěn) 定性，可作為牛IFN-(3生物學(xué)活性檢測時的標(biāo)準(zhǔn)品，在病原一宿主細(xì)胞的 感染一抗感染天然免疫相關(guān)基礎(chǔ)研究中具有重要的應(yīng)用價值，同時具有良 好臨床應(yīng)用前景。工業(yè)實用性
1、 我們所表達(dá)的(3干擾素由于折疊、糖基化修飾比原核和酵母表達(dá)的 P干擾素更接近天然干擾素，比活性高，為我們開展病原一宿主的感染與 抗感染天然免疫機(jī)制研究提供了良好的樣品，具有重要的基礎(chǔ)研究應(yīng)用價 值。
2、 人類干擾素在人類病毒病的治療中(如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝 炎)發(fā)揮了重要的作用，并且其在SARS的體外抗病毒實驗、和動物實驗 中顯示出鼓舞人心的結(jié)果[2<)-22]。由于動物病毒病是畜牧業(yè)的最大威脅之 一，每年都造成了巨大的損失，而目前缺乏特效的抗病毒化學(xué)藥物。通過 人干擾素的應(yīng)用經(jīng)驗和已報道的動物干擾素體內(nèi)外抗病毒實驗，干擾素在 動物病毒病的預(yù)防和治療中具有必有大作為。因此，我們表達(dá)的(3干擾素 在對動物病毒病的預(yù)防和治療中具有重要的應(yīng)用價值，具有良好的市場前 景。
參考文獻(xiàn) Weber F, Kochs G， Haller 0. Inverse interference: how viruses fight the interferon system [J]. Viral Immunol, 2004, 17(4):498-515 Stetson D B, Medzhitov R. Type I interferons in host defense [J]. Immunity, 2006, 25(3):373畫381 Sen G C. Viruses and interferons [J]. Annu Rev Microbiol, 2001, 55:255-281 Valarcher J F， Furze J, Wyld S, et al. Role of alpha/beta interferons in the attenuation and immunogenicity of recombinant bovine respiratory syncytial viruses lacking NS proteins [J]. J Virol, 2003, 77(15):8426-8439[5] Henderson G, Zhang Y, Jones C. The Bovine herpesvirus 1 gene encoding infected cell protein 0 (bICPO) can inhibit interferon-dependent transcription in the absence of other viral genes [J]. J Gen Virol， 2005， 86(Pt 10):2697-2702 Valarcher J F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection [J]. Vet Res, 2007, 38(2): 153-180 Zhao L S. [Problems and strategies during interferon therapy for hepatitis B] [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2006， 14(5):378-379 Vilar Gomez E, Gra Oramas B, Arus Soler E, et al. [Sequential combination therapy with prednisone, lamivudine and interferon alfa-2b for HBeAg-positive chronic hepatitis B〗[J]. Gastroenterol Hepatol， 2006， 29(9):534-541 Koyama R, Arase Y, Ikeda K， et al. Efficacy of interferon therapy in elderly patients with chronic hepatitis C [J]. Intervirology, 2006, 49(3):121-126 Satoh J. [Interferon -beta therapy in multiple sclerosis] [J]. Nippon
Rinsho， 2006， 64(7): 1297-1309 [11] Miyake K, Tsuchida K, Sugino H, et al. Combination therapy of human
pancreatic cancer implanted in nude mice by oral fluoropyrimidine
anticancer agent (S-1) with interferon-alpha [J]. Cancer Chemother
Pharmacol, 2007, 59(1):113-126 [12] Yoshida J, Mizuno M, Wakabayashi T. Interferon-beta gene therapy forcancer: basic research to clinical application [J]. Cancer Sci, 2004， 95(11):858陽865 Kappos L， Hartung H R 10 years of interferon beta-lb (Beta feron
therapy [J]. J Neurol, 2005, 252 Suppl 3:iiil-iii2 [14] Mahmutovic S, Beslagic E. Significance of the interferon (IFN) in the
therapy [J]. Bosn J Basic Med Sci, 2004, 4(4):42-44 [15]李玉萍，景志忠，蒲訓(xùn)，et al.牦牛e-干擾素基因的克隆與表達(dá)[J].
中國獸醫(yī)科學(xué)，2006, 36(01):40-45 [16]李學(xué)仁，曹瑞兵，李斐，et al.奶牛a干擾素在畢赤酵母中的分泌表
達(dá)及其生物活性測定中國生物工程雜志，2005,25(09):64-68 [17] Li Z， Jiang Y, Jiao P, et al. The NSl gene contributes to the virulence of
H5N1 avian influenza viruses [J]. J Virol， 2006, 80(22): 11115-11123 [18] Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Efficient selection for
high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector [J]. Gene,
1991, 108(2):193畫199 [19] Takada A, Robison C, Goto H, et al. A system for functional analysis of
Ebola virus glycoprotein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,
94(26): 14764-14769 [20] Yu D X, Chen Q， Zhang L L， et al. A field trial of recombinant human
interferon alpha-2b for nasal spray to prevent SARS and other
respiratory viral infections [J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing
Du Xue Za Zhi, 2005, 19(3):216-219[21] Paragas J, Blatt L M， Hartmann C， et al. Interferon alfaconl is an inhibitor of SARS-corona virus in cell-based models [J]. Antiviral Res, 2005,66(2-3):99-102 Morgenstern B, Michaelis M， Baer P C, et al. Ribavirin and interferon-beta synergistically inhibit SARS-associated coronavirus replication in animal and human cell lines [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005, 326(4):905-908序列表
〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 〈120〉表達(dá)牛P干擾素的CHO細(xì)胞系及其應(yīng)用
<130> IB083074
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211> 561
〈212〉 DNA
〈213〉 牛
<400〉 1
atgacctaccggtgcctcctcccgatggttctcctgctgtgtttctccaccacagctctt60
tccaggagctacagcttgctccgattccagC3犯ggCgg3gcgctgaggtgtgtc3gaa^120
ctcctggggcagttacattcaacgcctcaacattgcctcgaggccaggatggacttccag180
gtccctgaggagatgaaccaagcacagc6igUccggaaggaagatgccatattggtcatc240
tatgagatgctccagcagatcttcaatattctcaccagag6LCttctccagcactggctgg300
tctgagaccatcattgaggacctccttgtgg已a(bǔ)ctct已tgggc卿tgaatcgtxtgcag360
3gg犯3ta3taacttcaccatggggg3C3Caaccg"ttctt420
cacctgaagaagtattacttc犯cctcgtgcagtacctggagtcc犯ggagtacaacagg480
tgtgcctggacagtcgtgcgagtgcaaatactcacgaacttttctttcctgatgagacta540
acagcttccctccgtgactg561
〈210> 2 <211> 186 <212〉 PRT <213> 牛 〈400〉 2
Met Thr Tyr Arg Cys Leu Leu Pro Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 15 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gin Gin Arg
30
His Ser Thr
Pro
Leu 20
Glu Val Cys Gin
Arg Ser Ala 35
His Cys Leu Glu
Ser 25
Leu Leu Gly Gin
Gin 50
Met Asn Gin Ala Gin 65
Tyr Glu Met Leu
Lys 40
Arg Met Asp Phe
Ala 55
Phe Arg Lys Glu
Leu 45
Vai Pro Glu Glu
Gin 70
Gin lie Phe Asn
Gin 60
Ala lie Leu Val
Gin 85
Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr lie 100
Met Asn Arg Leu
Asp 75
Leu Thr Arg Asp
Tyr Gly Gin 115
Asn Phe Thr Met
lie 90
lie Glu Asp Leu Leu 105
Pro lie Gin Lys
Phe 95 Glu
Glu
Gin 130
Tyr Phe Asn Leu
Gin 120
Asp Thr Thr Val
Tyr 145
Cys Ala Trp Thr
Leu Met Arg Leu 180
Gly 135
Gin Tyr Leu Glu
Val 150
Val Arg Val Gin
Val Val Arg Val Gin lie 165 170 Thr Ala Ser Leu Arg Asp
Arg 185
Leu 140
Lys Glu Tyr Asn
Ser 175
lie
80
Ser
Leu
Val 110
lie Met Gin
Glu 125
His Leu Lys Lys
Ser Lys Glu Tyr Asn Arg 155 160 Leu Thr Asn Phe Ser Phe
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)牛β干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼牛β干擾素的基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述牛P干擾素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述編碼牛(3干擾素的 基因如SEQ ID NO:所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的CHO細(xì)胞系，其中在所述編碼所 述動物P干擾素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其是保藏號為CGMCC No. 2415的CHO細(xì)胞系。
6. —種生產(chǎn)牛(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方法，該方法包括1) 培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項所述的CHO細(xì)胞系；2) 從所述的CHO細(xì)胞系的培養(yǎng)液中提取(3干擾素，用作牛P干擾素 的標(biāo)準(zhǔn)品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述CHO細(xì)胞系是保藏號為CGMCC No. 2415的CHO細(xì)胞系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法生產(chǎn)的牛(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品。
9. 一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法生產(chǎn)的牛卩干擾素 標(biāo)準(zhǔn)品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項所述的CHO細(xì)胞系生產(chǎn)的牛|3 干擾素在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于牛傳染性疾病的預(yù)防和治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)脊椎動物β干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼所述動物β干擾素的基因。更具體地，本發(fā)明公開了表達(dá)牛β干擾素的CHO細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及利用上述CHO細(xì)胞系生產(chǎn)脊椎動物β干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方法以及通過該方法獲得的牛β干擾素，其具有極高的比活性和穩(wěn)定性，可用作牛β干擾素生物學(xué)活性檢測時的標(biāo)準(zhǔn)品和用于牛傳染性疾病的預(yù)防和治療，具有重要的應(yīng)用前景和市場前景。
文檔編號C12P21/02GK101603033SQ200810109948
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者步志高, 陳偉業(yè) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所