專利名稱：檢測i型干擾素生物學活性的細胞系及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測動物I型干擾素的生物學活性的方法。更具體地，本發(fā)明涉 及一種基于雞Mx啟動子和螢光素酶報告基因定量檢測動物的I型干擾素生物學活性 的方法。
背景技術：
干擾素(interferon, IFN)是重要的抗病毒活性物質(zhì)，是機體非特異免疫系統(tǒng)的 重要組成部分，在動物和人類抗感染和腫瘤臨床治療上有著廣泛的應用。但長期以來， 一直缺乏理想的IFN活性標準定量檢測方法。傳統(tǒng)的IFN活性定量手段主要包括1、 抗病毒活性檢測法(antiviral assays, AVA),常用病毒為水皰性口炎病毒(Vesticular stomatitis virus ， VSV)禾卩月囟心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV[']。 AVA 有其局限性，敏感性和準確性低，并具有一定生物安全危險性，因此研究者不斷探索 新的方法來替代AVA。 2、 ELISA"'a方法，檢測IFN的活性盡管方便快捷，但只能檢 測IFN的抗原性， 一些無生物學活性的類IFN蛋白會影響檢測結果，所以并不可靠， 而且不同種的IFN需要不同的單抗，因此也影響其通用性。3、依據(jù)IFN具有的細胞 增殖抑制、細胞活性功能調(diào)節(jié)、細胞分化和免疫調(diào)節(jié)等特性建立的其它生物學方法， 均具有不同程度的局限性，或方法比較繁瑣，或適用范圍較窄。探索一種適用范圍廣 且準確敏感的方法對IFN的基礎和應用研究具有重要現(xiàn)實意義[3—8]。
在哺乳動物、禽類和魚類中，I型IFN發(fā)揮其抗病毒生物學功能的途徑之一是經(jīng) 由JAK-STAT信號轉導途徑激活Mx啟動子(Mx promoter, Mxp)，表達的Mx蛋白(Mx protein)能夠抑制負鏈RNA病毒復制[6'9—Mxp有較好的專一性，它不能被白細胞 介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)等其它細胞因子啟 動[12'13]。
在已有的報告基因系統(tǒng)中，熒光素酶(luciferase， Luc)檢測系統(tǒng)比氯霉素乙酰轉 移酶(CAT)、 P—半乳糖苷酶(LacZ)等其它報告基因檢測系統(tǒng)系統(tǒng)更具快捷敏感的 顯著優(yōu)勢。采用Luc系統(tǒng)檢測96個樣品只需要幾分鐘即可完成，便于大通量檢測；熒光素酶的檢測量能低至10—2()niol，比CAT靈敏100倍，具有極高的敏感性，卻安全無 放射性；檢測線性范圍寬，0.0002 — 200pg，可檢測最小稀釋度的樣品。Luc報告基因 檢測系統(tǒng)在受體活性、細胞內(nèi)信號傳導、mRNA加工、蛋白質(zhì)折疊及蛋白-蛋白相互 作用等研究中廣泛應用[14]。
本文構建了基于雞Mxp和luc報告基因的IFN質(zhì)粒檢測系統(tǒng)，就其應用于檢測禽 類如雞、或哺乳動物如豬或牛的I型干擾素生物活性的敏感性與傳統(tǒng)抗病毒活性檢測 方法進行了比較研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于Mx啟動子和螢光素酶報告基因定量檢測動物的I 型干擾素生物學活性的方法。
具體地，本發(fā)明涉及如下各項
1. 一種檢測動物I型干擾素的生物學活性的方法，該方法包括以下步驟
1) 構建表達熒光素酶的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含Mx啟動子和與該啟動子可操作地 連接的編碼熒光素酶的基因；
2) 將步驟l)中構建的重組質(zhì)粒轉染所述動物細胞；
3) 用待測的動物I型干擾素樣品處理在步驟2)中獲得的轉染細胞，比較在處理 前后所述細胞的熒光素酶基因的表達水平。
2. 根據(jù)以上1所述的方法，其中所述Mx啟動子是雞Mx啟動子。
3. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中所述動物是禽類如雞、或哺乳動物如豬或牛。
4. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中所述I型干擾素是a或(3干擾素。
5. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中在步驟1 )中的雞Mx啟動子的序列如SEQ ID NO: 1所示。
6. 根據(jù)以上5所述的方法，其中在步驟l)中的重組質(zhì)粒為pMxp-luc，其核苷酸 序列如SEQIDN0:2所示。
7. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中在步驟2)中的所述轉染是穩(wěn)定轉染或瞬時 轉染。
8. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中在步驟3)中的動物I型干擾素樣品是重組 表達所述動物I型干擾素的細胞系的培養(yǎng)上清液或相應I型干擾素重組質(zhì)粒轉染哺乳 動物細胞的培養(yǎng)上清液。9. 根據(jù)以上8的方法，其中所述細胞系是BHK-21細胞或CHO細胞。
10. 根據(jù)以上1或2所述的方法，其中在步驟2)中獲得的動物細胞是 MDBK-Mxp-Luc細胞系，其保藏編號為CGMCC 2416。
與所有已報道的基于Mx啟動子一報告基因檢測方法中相比，該檢測方法所需時 間最短，可大幅度節(jié)約檢測時間；與傳統(tǒng)抗病毒定量檢測方法相比，本發(fā)明的檢測方 法具有快速簡便、準確敏感、便于高通量檢測等顯著優(yōu)勢，在禽類乃至哺乳動物干擾 素生物學基礎和應用研究及產(chǎn)業(yè)化過程中具有重要應用價值。
發(fā)明詳述
干擾素是一種重要的抗病毒物質(zhì)，對其生物學活性的定量檢測具有重要的基礎研 究和生產(chǎn)應用意義。Mx啟動子是干擾素主要效應轉錄啟動子之一，受I型IFN作用表 達Mx蛋白。
在一個實施方案中，本發(fā)明克隆了雞Mx啟動子(Mxp)，其序列與已報道的都不 同，有6個堿基的差異。在其下游連接熒光素酶(luciferase,luc)報告基因，構建成雞 I型干擾素活性檢測質(zhì)粒pMxp-Iuc。以pMxp-luc瞬時轉染DF-1雞胚成纖維細胞系， 24小時后用雞IFN-ot/p處理細胞，結果螢光素酶基因在Mx啟動子作用下獲得轉錄表 達；螢光素酶的表達量與干擾素的抗病毒活性有著良好的線性相關性，并在干擾素處 理細胞6個小時后就可以檢測；對雞IFN-ot和IFN-P檢測的敏感性是分別是抗病毒活 性定量檢測方法的10和100倍；檢測的線性范圍約為0.3 30AU/ml。
在另一個實施方案中，本發(fā)明克隆了雞Mx啟動子(Mxp)，在其下游連上了螢光 素酶(luciferase， Luc)報告基因。穩(wěn)定轉染pMxp-Luc至MDBK細胞中，篩選出同 時可用于檢測牛、豬等動物的I型干擾素生物學活性的細胞克隆MDBK-Mxp-Luc。 MDBK-Mxp-Luc對不同來源(轉染、CHO)的牛、豬IFN-a/卩檢測范圍約為0.5-100 AU/ml;并且重復性良好，批次內(nèi)、批次間的變異系數(shù)分別不大于5.6%和9.2%，與已 報道的重復性最高報告基因檢測方法相近;IFN處理后5 6 h螢光素酶表達水平最高， 12h降到l/5;整個檢測過程可在14h內(nèi)完成，是所有檢測方法中最快的；操作安全， 整個過程沒有用到病毒；檢測簡單準確，適用于高通量檢測。MDBK-Mxp-Luc細胞還 可以作為研究病毒感染與牛I型IFN系統(tǒng)相互作用的分子機制的有力工具。
5附圖簡述


圖1.雞Mxp PCR和ChIFN-a和ChIFN-(3的ORF RT-PCR產(chǎn)物電泳圖 M, DL2000標記(marker); 1,雞Mxp; 2,雞IFN-a; 3,雞IFN-(3; 圖2.使用VSV*GFP的pCA-ChIFN-a, pCA-ChIFN-p和pCAGGS轉染上清的抗 病毒活性檢測。表達pCA-ChIFN-a, pCA-CMFN-p和pCAGGS的轉染BHK-21的上清 被分別命名為ChIFN-a,ChIFN-p和mock。病毒對照(VC)是不含IFN樣品、但是也 加入VSV*GFP的孔。ChlFN-a和ChIFN-卩的抗病毒活性分別約為1025()禾卩104'45 AU/ml， 在pCAGGS的10倍稀釋上清中未檢測到抗病毒活性。* ()中的數(shù)字是IFN樣品的稀 釋倍數(shù)；
圖3. Mxp啟動螢光素酶轉錄表達質(zhì)粒pMxp-luc的構建； 圖4.以Mxp和螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測雞IFN-a/(3的生物學活性； 空白-對照(BC):不含IFN但是以同樣方式轉染。(A)所有樣品稀釋IOO倍；(B)所 有樣品作IO倍系列稀釋；
圖5.牛、豬IFN-a/p的抗病毒活性滴定。病毒對照(VC)是不含IFN樣品、但 是也加入VSV*GFP的孔。* ()中的數(shù)字是IFN樣品的稀釋倍數(shù)；
圖6.瞬時轉染驗證IFN對Mxp的激活反應?；谒矔r轉染驗證IFN對Mxp的激 活反應。MDBK細胞于24孔細胞培養(yǎng)板中過夜生長至密度為70%，參照說明書以 Fugene6進行pMxp-Luc和pRL-tk共轉染。轉染后24小時，細胞用100倍稀釋的BoIFN-p (A)禾口PoIFN-卩(B)處理，于37°(:及5% C02中培養(yǎng)6小時。然后，兩種質(zhì)粒表達的熒 光素酶用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase assay system)檢測。其中，pRL-tk表 達的海腎熒光素酶作為轉染效率的內(nèi)參。
圖7. IFN處理MDBK-Mxp-Luc細胞后螢光素酶表達量的時間曲線。 MDBK-Mxp-Luc細胞在24孔板中過夜生長至單層匯合后，分別用100倍稀釋的 BoIFN-a (A)、 BoIFN-pCHO (B)、 PoIFN-a (C)禾卩PoIFN-pCHO (D)處理，于37。C及5% C02 中培養(yǎng)，分別于2、 4、 5、 6、 8、 10和12小時用高亮熒光素酶檢測系統(tǒng)(Bright-Glo Luciferase Assay System)檢測熒光素酶的表達。設不加干擾素的空白對照孔(blank control, BC)。
圖8. MDBK-Mxp-Luc檢測豬、牛IFN-a禾Q IFN-(3的生物學活性?；?MDBK-Mxp-Luc細胞分析BoIFN-a (A)、BoIFN-|3CHO (B)、PoIFN-a (C)和PoIFN-pCHO (D) 的生物學活性。MDBK-Mxp-Luc細胞在24孔板中過夜生長至單層匯合后，用10倍梯度稀釋的干擾素樣品處理，于37'C及5M C02中培養(yǎng)5小時后，用高亮熒光素酶檢測 系統(tǒng)(Bright-Glo Luciferase Assay System)檢測熒光素酶的表達。設不加干擾素的空 白對照孔(blank control, BC)。圖中曲線旁的數(shù)字表示此稀釋度干擾素的抗病毒活性 單位(AU/ml)。
具體實施例方式
下文將參考實施例和附圖詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明， 而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權利要求具體限定。
實施例1.基于Mx啟動子和螢光素酶報告基因定量檢測雞I型干擾素生物學活性的研 究
1材料與方法
1.1質(zhì)粒、細胞株和病毒毒株
雞胚成纖維傳代細胞系(DF-1) (ATCC No. CRL-12203)為本實驗室保存，含有 熒光素酶基因的質(zhì)粒pGL3-Basic購自Promega公司。
穩(wěn)定真核表達載體pCI-neo (pCN)購自Promega公司，neo在SV40早期啟動子 的控制下表達。CHO-K1細胞株商購自ATCC (ATCC No. CCL-61)， CHO-K1細胞于 含10%FBS的DMEM-Ham，sF12 (DF12)培養(yǎng)基(invitrogen)中培養(yǎng)。
pMD8-T載體購自TaKaRa公司；克隆質(zhì)粒pBluescript II KS(+)購自invitrogen公
司；原核表達質(zhì)粒pET-32a(+) (Novagen公司)、傳代牛腎細胞系(MDBK) (ATCC No.
CCL-22)和BHK-21細胞(ATCC No. CCL-10)均由本實驗室保存；原代雞胚成纖維
細胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)采用10日齡的SPF雞胚常規(guī)方法[15]制備；
表達增強綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒(VSV*GFP)商購自中國農(nóng)業(yè)部哈爾冰獸
醫(yī)研究所，或者可以按照參考文獻[151通過反向遺傳技術構建，MDBK細胞系滴定PFU
(plaque forming unit)后一70'C保存;新城疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615)商
購自中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統(tǒng)(CCCCM)下屬的獸醫(yī)微生物菌種保藏
管理中心(CVCC，北京)，由本實驗室保存，CEFs滴定PFU后一7(TC保存?zhèn)溆谩?1.2試劑與儀器
雙螢光素酶檢測試劑(Dual-Luciferase assay system, Promega)購自Promega公司。 T4 DNA聚合酶購自MBI公司。Ni-NTA瓊脂糖親和樹脂、硝酸纖維素膜購自Pierce 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、魚皮蛋白購自Sigma公司；高亮螢光素酶 檢測試劑(Bright-Glo Luciferase assay system)購自Promega公司；各種限制性內(nèi)切酶和Ex-Taq酶都購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自MBI公司；質(zhì)粒中量提取試劑 盒購自Qiagen公司；轉染試劑Fugene6購自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)購自Corning公司；熒光倒置顯微鏡為LEICA公司產(chǎn)品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)為Bio-Tek公司產(chǎn)品，可檢測發(fā)光和熒光；CEQ8000自動測序儀為 Beckman公司產(chǎn)品。Grace's培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Trizol和M-MLV反轉錄試劑盒 購于Iiwi加gen公司。熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉生物技術公司。 DAB顯色試劑盒購自博士德公司。
1.3 Mxp基因克隆及其啟動hie報告基因轉錄表達質(zhì)粒的構建
根據(jù)GenBank雞Mxp序列(GenBank Accession No. Z23167),設計引物，上游弓l 物為5'-ccc gaattc teg gtg tea cat ccacac ggt，引入了 ￡coiH酶切位點；下游引物為 5'-ccc etc gag ctg cca gag tea cac age aag，弓|入為I酶切位點。常規(guī)方法提取CEFs基 因組，采用Ex-Taq酶進行PCR， PCR產(chǎn)物膠回收后￡coi I和I雙酶切克隆到￡coi I禾口屈o I雙酶切的pBluescript II KS(+)中得到pBlue-Mxp， CEQ8000自動測序儀測序。 pIRES2-eGFP (購自Clontech)以I單酶切后，用T4 DNA聚合酶平端化，再以 屈o I酶切，切掉CMV啟動子，膠回收載體片段；pBlue-Mxp以Sma I和I雙酶切 下的Mxp片段，與如前述處理的pIRES2-eGFP載體片段連接，以Mxp替換 pIRES2-eGFP載體的CMV啟動子，獲得質(zhì)粒pMxp-IRES-eGFP， pGL3-Basic以I 和Z&a I雙酶切下Luc，克隆至同樣I禾卩I雙酶切的pMxp-IRES-eGFP,構建成 luc報告基因轉錄質(zhì)粒pMxp-luc(質(zhì)粒pMxp-luc的DNA全序列如SEQ ID NO: 2所示)。
pMxp-luc采用中量制備試劑盒制備用于轉染。
1.4 IFN表達質(zhì)粒的構建
從GenBank獲取雞IFN-ot (ChIFN-a)或IFN-p (ChIFN-P)的ORF序列(ChIFN-a GenBank Accession No. U07868; ChIFN-(3 GenBank Accession No. AY974089),設計引 物。ChIFN-a的上游引物為5'-TGCCACCATGGCTGTGCCTGC AAG-3';下游引 物為5'-TGGGAGGTGCGTTTGGGGCTAAGT陽3'。 ChlFN-J3的上游引物為5'-TGC CAC CAT GAC TGC AAA CCA TCA G-3，；下游引物為5'陽ACT CAC TGG GTG TTG AGACGTT-3'。兩種上游引物均在起始密碼子ATG前加入了利于表達的Kozak序歹廿。
CEFs待生長至100%左右時,按感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為1.0 接種新城疫LaSota株病毒。感染后8個小時收細胞，用Trizol(invitrogen)提取總RNA， 進行RT-PCR。擴增的ChlFN-a/卩PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，獲得質(zhì)粒 pMD18-CMFN-a和pMD18-CWFN-卩，并測序鑒定。
把pMD18-ChIFN-a和pMD18-ChlFN-p分別以5*a/ IAY&a I和1雙酶切下
ChIFN-a和ChIFN-卩的ORF片斷分別亞克隆至以lo I/A/7ze I和￡coi I/^o I雙酶切的
質(zhì)粒pCAGGS[16，17]，獲得真核表達質(zhì)粒pCA-ChIFN-a和pCA-ChIFN-卩。 1.5瞬時轉染
8分別以pCA-ChIFN-a、 pCA-ChlFN-(3和pCAGGS，按照Fugene 6按操作說明書轉
染至BHK-21細胞，于轉染后48小時收獲細胞培養(yǎng)上清，分別命名為ChlFN-a、ChlFN-P
和mock，分裝并于一7(TC保存?zhèn)溆谩?1.6抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量檢測的操作步驟見參考文獻[15]，具體如下DF-1細胞于％ 孔細胞板中生長至密度為90%，棄上清，每孔加IO倍梯度稀釋IFN樣品10(^1，每個 稀釋倍數(shù)設3個平行對照孔，37。C及5XC02培養(yǎng)條件下處理24h后，棄上清，用含 2%FBS的DMEM稀釋VSV+GFP，按每孔300 PFU (100^1)加入病毒稀釋液，同時 設未經(jīng)轉染上清處理，只加病毒液的病毒對照(Virus Control, VC) L。不加干擾素 和病毒的孔，作為空白孔(Blank Control ， BC)。接毒后至VC孔的CPE( cytopathic effect) 約為100%時，熒光倒置顯微鏡下觀察GFP表達及病毒感染復制情況。最后所有孔每 孔加入50|il細胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，于搖床上裂解15min釋放細胞內(nèi)的GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏 感性設置為70，激發(fā)光485 nm，吸收光528 nm)檢測每孔綠色熒光蛋白的相對表達 水平。判定以BC孔校0，以VC孔為參照，每mL中，以表達綠色熒光數(shù)減少為 VC孔50X的平均最高稀釋度為一個抗病毒活性抑制單位(Antiviral Unit, AU)，計算 具體如下。
基于VSV*GFP檢測方法是計算半數(shù)病毒復制抑制的稀釋倍數(shù)，方法如下若綠
色熒光蛋白相對熒光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用F表示，以BC孔校0，
則50%病毒復制抑制的熒光值(F50) 二F (VC) /2，按下面公式計算IFN的抗病毒活
性單位logu)[每mL中IFN抗病毒活性單位(AU) ]-[F50—F(小于F50孔)]/[F(高于
F50孔)一F(小于F50孔)]+logK)[小于F50孔的稀釋倍數(shù)]。 1.7螢光素酶活性檢測
DF-1細胞于24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜至密度約為60% ，用Fugene 6共轉染轉染
pMxp-luc和pRL-TK (商購自Promega公司)，二者的比例為l嗎l嗎，其中pRL-TK
質(zhì)粒表達海腎螢光素酶，作為轉染效率的內(nèi)參。轉染后24小時用IO倍梯度稀釋的上
述轉染細胞上清ChIFN-a、 ChIFN-p和mock處理DF-1，每稀釋梯度設3個平行孔，
同時設未經(jīng)轉染上清處理但同樣轉染的空白對照(Blank Control, BC)。 6小時后參照
雙螢光素酶檢測試劑說明書檢測DF-1內(nèi)兩種螢光素酶的表達水平。
2結果
2.1 ChlFN-a/p的克隆及其表達產(chǎn)物抗病毒活性檢測
以CWFN-a和ChIFN-p的ORF特異引物進行RT—PCR，分別從CEFs擴增出588bp 和612bp的產(chǎn)物(圖1的B和C)與預期結果相符，經(jīng)測序鑒定證實獲得了 ChIFN-a 和ChIFN-(3完整基因。再分別將ChIFN-cx和ChIFN-卩完整ORF克隆至高效真核表達質(zhì)粒pCAGGS"6"]中，構建成pCA-CMFN-a、 pCA-ChIFN-(3。分別以pCA-ChIFN-a、 pCA-ChIFN-(3或pCAGGS轉染BHK-21細胞，于轉染后4 h后換液，再48小時收獲 細胞培養(yǎng)上清，分別命名為ChIFN-a、 ChIFN-p和mock，其抗病毒活性采用VSV*GFP 于DF-1細胞進行抗病毒活性滴定(圖2)。結果，細胞轉染收獲上清ChIFN-a和CWFN-f3 的抗病毒活性分別約為1025Q (316)、 104'45 ( 2.8X 104) AU/ml， mock的10倍稀釋度 未檢測到抗病毒活性；VSV+GFP系統(tǒng)對CMFN-a和ChIFN-p檢測下限分別為103(0.32 AU/ml)禾D 105 (0.28AU/ml)稀釋倍數(shù)。
2.2 Mxp啟動luc轉錄表達質(zhì)粒pMxp-luc的構建及其對ChlFN-a/p刺激的激活反應
從CEFs基因組擴增的雞Mxp啟動子PCR產(chǎn)物片段約470bp (圖1的A)，與預期 結果相符，序列測定結果與已報導的序列[13]有6個堿基的差異，但其中IFN應答的關 鍵基因序列(ISRE)為5'-AGT TTC GTT TCT，完全一致。進一步先以Mxp替換 pIRES2-eGFP的CMV啟動子，再用螢光素酶報告基因替換IRES-eGFP，構建成 pMxp-luc，使螢光素酶在Mxp的控制下表達(圖3)。
pMxp-luc轉染CEFs細胞中，經(jīng)ChIFN-a和ChIFN-p處理后，Mxp被有效激活， luc獲得表達(圖4的A); ChIFN-a檢測下限為104倍(3.6X l(T2 AU/ml)稀釋，CMFN-p 的檢測下限高達107倍(2.8X10—3 AU/ml)稀釋度，分別是上述VSV*GFP檢測下限的 10倍和100倍，檢測的敏感性與抗病毒定量檢測相比顯著提高(圖4的B)。從圖7 (B)還可以估計ChIFN-a的檢測線性范圍為0.32 30 AU/ml， ChIFN-(3檢測的線性范 圍約為0.28 28 AU/ml。
3討論和結論
IFN-a/卩主要作用于I型IFN受體，激活JAK1和TYK2,促使STAT蛋白的酪氨 酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9復合物，即IFN刺激基因因子3 (IFN-stimulated gene factor 3， ISGF3)， ISGF3轉運到核內(nèi)結合到ISRE，轉錄表達各種抗病毒蛋白[18]。 因此ISRE是I型IFN發(fā)揮生物學功能的關鍵。本研究中CMFN-a和ChlFN-(3作用于 pMxp-luc的ISRE轉錄表達螢光素酶，螢光素酶的表達量與IFN的抗病毒活性成良好 的線性相關。
病毒復制抑制試驗是目前檢測干擾素的生物學活性的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)方法抗病毒 活性的判定標準主要有三種方法，病毒復制抑制(Virus yield-Reduction Assay, VYRA)、 噬斑減少分析(Plaque Reduction Assay, PRA)、細胞病變抑制(Cytopathic Effect Reduction Assay, CPERA)等方法。但三種方法都存在誤差較大、重復性差、精確度 低和、耗時長和安全性差等缺點[5'19]。
本研究建立的Mxp-luc檢測系統(tǒng)顯示出諸多方面的優(yōu)越性點，整個過程完全避免 VSV等活病毒的使用，沒有生物安全的顧慮；檢測程序簡化，時間大大縮短，在IFN處理細胞后約6個小時即可完成檢測，因此檢測速度快；螢光素酶的表達可以通過儀 器檢測精確量化，不僅提高了 IFN定量的準確性，而且便于大量樣品的高通量操作；
比ELISA方法相比，Mxp-luc系統(tǒng)檢測的是IFN的激活M鄰的能力，不存在假陽性； 本實驗中Mxp-luc檢測ChIFN-a和ChIFN-p的敏感性分別為VSV*GFP檢測敏感性的 10倍和100倍，顯示了其在檢測敏感性上的優(yōu)越性；Mxp-luc檢測系統(tǒng)具有IFN刺激 反應專一性，其它細胞因子如白細胞介素(interleukin)，腫瘤壞死因子(Tumor necrosisfactor )、 白細胞一巨嗜細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)等均對其不產(chǎn)生干擾[1|'12]。
由于本研究是基于轉染的方法，因此步驟繁瑣，背景也較高，但是如果把Mxp-luc 框架穩(wěn)定轉染至細胞中，建立穩(wěn)定檢測細胞系，那么將顯著減少操作步驟，從準備細 胞到完成檢測只需要15小時左右，相比較于抗病毒檢測的40-48小時，大大節(jié)約了檢 測時間；同時檢測結果會更穩(wěn)定可靠。
結論，本研究克隆了雞Mxp啟動子，建立了基于Mxp啟動熒光素酶基因轉錄表 達質(zhì)粒pMxp-luc的IFN生物活性檢測系統(tǒng)，用于檢測包括雞在內(nèi)的動物的I型干擾素 的生物學活性。
實施例2.報告基因分析定量檢測豬、牛I型擾素生物學活性 1材料與方法
1.1質(zhì)粒、細胞株和毒株
同實施例1 1.2試劑與儀器
同實施例1
1.3豬和牛IFN-a/p的基因克隆及真核表達質(zhì)粒的構建
從GenBank獲取豬和牛IFN-a的序列(豬IFN-a的Genbank Accession No. X57194; 牛IFN-a的Genbank Accession No. Z46508),設計引物。BoIFN-a (牛IFN-a)的上游引 物為5'-GGCCACCATGGCCCCAGCCTGGTCC;下游引物為5'-CCAGGTGTG TGG TCA GTC CTT TC。PoIFN-a (豬IFN-a)的上游引物為5'-CTG AAT TCG CCA CCA TGGCCCCAACCTC，引入五coi I酶切位點；下游引物為5'-GGC TCG AGT CAC TCCTTCTTCCTG，引入J^oI酶切位點。上游引物中都在起始密碼子ATG前引入了 利于真核表達的Kozak序列。
PK15 (ATCC No. CCL-33)和MDBK細胞密度為90%左右時，按MOI為1.0接 種新城疫LaSota株病毒(CCVCNO.AV1615),感染后8個小時，收細胞并提取總RNA 做RT-PCR擴增BoIFN-a和PoIFN-a ORF基因。PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體獲得 質(zhì)粒pMD18-BoIFN-a和pMD18-PoIFN-a，并測序鑒定后，用雙酶(對應于各個引物設計的酶切位點)切下IFN-a片斷，并克隆到同樣雙酶切割的質(zhì)粒pCAGGS上，分別 獲得真核表達質(zhì)粒pCA-BoIFN-a和pCA-PoIFN-a。
從GenBank獲取BoIFN-p (牛IFN-(3)的0RF序歹ll(GenBank Accession No. E00139), 設計引物。上游引物為5，-TGCCACCATGACCTACCGGTGCCTC，下游引物為5'-ACA GGT GGG AGA TGT TCA GTC AC，上游引物在起始密碼子ATG前加入了利于 真核表達的Kozak序列。
傳代牛腎細胞系(MDBK) (ATCCNo.CCL-22)細胞生長至密度為90%左右時， 按感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為1.0接種新城疫LaSota株病毒(CCVC NO.AV1615)。 8h后收細胞，用Trizol (Invitrogen公司)提取總RNA，進行RT-PCR。 擴增的BoIFN-|3 PCR產(chǎn)物克隆到pMDl8-T載體獲得質(zhì)粒pMDl 8-BoIFN-{3，通過測序 鑒定。
從質(zhì)粒pMD18-BoIFN-p以IAY5" I雙酶切下BoIFN-)3的ORF片斷，克隆至以 屈o I/W/je I雙酶切的質(zhì)粒pCAGGS，獲得瞬時真核表達質(zhì)粒pCA-BoIFN-(3。
從質(zhì)粒pMD8-BoIFN-|B以SaI/Xba I雙酶切下BoIFN-(3的ORF片斷，以T4 DNA 聚合酶平滑化末端后克隆至SmaI酶切的穩(wěn)定真核表達質(zhì)粒pCI-neo (在本文中也稱為 pCN) (Promega公司)，獲得穩(wěn)定真核表達質(zhì)粒pCN-BoIFN-(3。
從GenBank獲取PoIFN-卩(豬IFN-卩)的ORF序歹U(Genbank Accession No. S41178), 設計引物。上游引物為5，-TGCCACCATGGCTAACAAGTGCATC,下游引物為5，-AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上游引物在起始密碼子ATG前加入了利于 真核表達的Kozak序列。
PK15細胞生長至密度為90%左右時，按感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI) 為1.0接種新城疫LaSota株病毒。8h后收細胞，用Trizol提取總RNA，以上述引物進 行RT-PCR 。擴增的PoIFN-P PCR產(chǎn)物亞克隆到PMDl 8-T載體獲得質(zhì)粒 pMD18-PoIFN-(3，測序鑒定。
從質(zhì)粒pMD18-BoIFN-(3以￡coi I/Sal I雙酶切下BoIFN-(3的ORF片斷，分別亞克
隆至以I/iVfe I雙酶切的質(zhì)粒pCAGGS，或亞克隆至以T4 DNA聚合酶平滑化末端
后克隆至Sma I酶切的質(zhì)粒pCN，獲得瞬時真核表達質(zhì)粒pCA-PoIFN-(3和穩(wěn)定真核表
達質(zhì)粒pCN-PoIFN-(3。 1.4重組IFN
瞬時轉染
以pCA-BoIFN-a、 pCA-PoIFN-a和pCAGGS,按照Fugene 6按操作說明書轉染至 BHK-21細胞，于轉染后16 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)48h收獲細胞培養(yǎng)上清，分別命名為 BoIFN-apcA、 PoIFN-apCA禾卩mockpCA。
穩(wěn)定轉染
源自CHO細胞的BoIFN-Pcho和PoIFN-Pcho的制備參照轉染試劑Fugene 6操作說明書轉染pCN-BoIFN-p或pCN-PoIFN-p至CHO-K1 細胞。轉染后24小時，按1:8的比例進行細胞傳代，用含有800fig/mlG418的壓力篩 選培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)細胞，10 14天后，用克隆環(huán)圈住具有新霉素抗性的細胞克隆集落， 胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔細胞培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)。篩選出的不同細胞克 隆按照0.5xl(^個細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中生長至密度為100%后24小時，收取 細胞培養(yǎng)上清，分別如上用VSV*GFP進行抗病毒活性滴定，選擇表達水平最高的克 隆按限稀釋法再進行單細胞克隆，按上述步驟篩選表達量最高的克隆后，擴增并按常 規(guī)方法凍存細胞，分別命名為CHO-BoIFN-p和CHO-PoIFN-p，含有重組BoIFN-p和 重組PoIFN-P的細胞培養(yǎng)上清分別命名為BoIFN-I5cho和PoIFN-pCHO。本發(fā)明的陽性 CHO細胞克隆(CHO-BoIFN-卩，中國倉鼠卵巢細胞(C7z/"e;ye//a附加r CKw^ Ce〃))于 2008年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC， 中國，北京)，保藏號為CGMCC No. 2415 。本發(fā)明的陽性CHO細胞克隆(CHO-PoIFN-p， 中國倉鼠卵巢細胞(C/i/wwi/flwWerCKw^Ce//))于2008年3月25日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,中國，北京)，保藏號為CGMCC No. 2412。
以上收獲的重組干擾素都分裝后于—70'C保存。 1.5抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性滴定步驟基本同實施例1，不同的地方是干擾素樣品先稀釋1000 倍，然后再4倍梯度稀釋。 1.6 Mxp的克隆與檢測質(zhì)粒的構建
同實施例1。
1.7穩(wěn)定轉染整合Mxp-Luc的MDBK細胞系的建立
方法參考文獻4],主要步驟如下:參照轉染試劑Fugene 6操作說明書轉染pMxp-Luc 至MDBK細胞。轉染后24小時，按1:10的比例進行細胞傳代，用含有600 pg/ml G418 的壓力篩選培養(yǎng)液篩選具有新霉素抗性的細胞克隆。篩選出的細胞克隆擴增培養(yǎng)后， 接種到24孔板中生長至密度為100%時，用含有5%FBS的DMEM 100倍稀釋的 BoIFN-卩oro處理6小時后，用高亮螢光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達，設未用IFN 處理的對照孔，選擇表達水平最高的克隆再進行一次單細胞克隆篩，并按上述步驟篩 選誘導表達水平最高的克隆，擴增培養(yǎng)并凍存，作為檢測I型干擾素的細胞系，命名 為MDBK-Mxp-Luc。本發(fā)明的陽性MDBK細胞克隆(MDBK-Mxp-Luc，馬-達氏牛腎 細胞(MW/"-Da^y 6ov/"e ^frieyce〃))于2008年3月25日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2416。 1.8 Mxp-Luc分析方法
基于轉染的方法參照Fugene 6按操作說明書共轉染pMxp-Luc和pRL-TK至24 孔細胞板中的MDBK細胞，二者的比例為l:l，轉染后24小時，加入以含有5XFBS 的DMEM100倍稀釋的IFN樣品，每個樣品設3個平行孔，細胞于37'C及5%C02培 養(yǎng)6小時后參照雙螢光素酶檢測系統(tǒng)說明書檢測MDBK內(nèi)兩種螢光素酶的表達。
基于MDBK-Mxp-Luc細胞系的方法使細胞于24孔板中過夜生長至密度約100%時，分別加入以含5XFBS的DMEM10倍梯度稀釋的IFN樣品40(Hi1，于37'C及5 %。02培養(yǎng)5小時后，參照高亮螢光素酶檢測系統(tǒng)說明書檢測細胞內(nèi)螢光素酶的表達。 每個稀釋度都設2個平行孔，設未用IFN處理的空白孔(Blank Control, BC)。
2結果
2.1抗病毒活性滴定
轉染收獲的細胞上清BoIFN-apCA、 PoIFN-apCA; CHO-BoIFN-p、 CHO-PoIFN-(3穩(wěn)
定細胞系的細胞培養(yǎng)上清BoIFN-pcHo、 PoIFN-PcHo都先稀釋1,000倍后，再4倍梯度
稀釋，采用VSV+GFP于MDBK細胞進行抗病毒活性滴定。結果如圖5， BoIFN-apCA、
BoIFN-Pcho、 PoIFN-apCA、禾卩PoIFN-(3CHO的抗病毒活性分別約為207,058、 102,316、
154,452、和366,745 AU/ml。
2.2 Mxp基因的克隆和檢測質(zhì)粒的構建
見實施例1。
2.3穩(wěn)定整合Mxp-Lnc的MDBK細胞克隆的篩選和鑒定
為了獲得穩(wěn)定整合Mxp-Luc的MDBK細胞克隆，在600pg/ml G418的壓力篩選下 共進行了兩次單細胞克隆，確保整合的穩(wěn)定性。同時對每次篩選出的克隆用BoIFN-PcHo 處理后，檢測熒光素酶的表達，以從眾多G418陽性克隆中選出一株敏感的細胞克隆， 命名為MDBK-Mxp-Luc (CGMCC No. 2416)，并用含有400嗎/ml G418和5%FBS的 DMEM培養(yǎng)傳代。
2.4 Mxp-Luc對豬、牛IFN-a/|J生物學活性的檢測
為了驗證Mxp是否可以被豬、牛的IFN激活，把pMxp-Luc和pRL-TK共轉染至 MDBK細胞后24小時，分別加入100倍稀釋的BoIFN-Pcho和PoIFN-pCHO處理細胞6 個小時，參照雙螢光素酶檢測系統(tǒng)說明書檢測MDBK內(nèi)兩種螢光素酶的表達，其中海 參螢光素酶的表達作為轉染效率的內(nèi)參(圖6)，結果表明Mxp能夠分別被BoIFN-PcHo 和PoIFN-Paro激活，表達量是空白對照的20倍到25倍。同時雖然本實驗中MDBK 的轉染效率不到1% (數(shù)據(jù)未顯示)，但螢光素酶的微量表達仍然能夠被檢測到，顯示 了其極高的敏感性。
為了確定干擾素處理MDBK-Mxp-Luc細胞的時間，分別于加入100倍稀釋的 BoIFN-apCA、 BoIFN-Pcho、 PoIFN-apCA和PoIFN-pcH。樣品后的2、 4、 5、 6、 8、 10和 12小時檢測IFN刺激Mxp表達的螢光素酶，每個時間點都做3個平行孔，設未用IFN 處理的空白孔(Blank Control, BC)。結果，BoIFN-a、BoIFN-pCHO、PoIFN-a和PoIFN-(3CHO 在刺激Mxp表達螢光素酶上都相似，于5 — 6小時左右達到峰值(圖7)，因此選擇5 小時作為此后檢測中IFN樣品處理細胞的時間。
以MDBK-Mxp-Luc檢測10倍梯度稀釋的BoIFN-apCA、 BoIFN-pCHO、 PoIFN-apCA、 和PoIFN-|3CHO，于刺激5個小時后檢測螢光素酶的表達，結果(圖8)顯示MDBK-Mxp-Luc對所有IFN樣品的檢測范圍在約0.1和100 AU/ml之間，并且在0.5 和100 AU/ml活性范圍內(nèi)，螢光素酶的表達量和IFN活性近似線性關系。 MDBK-Mxp-Luc系統(tǒng)檢測IFN活性的下限(表1)禾卩AVA (VSV*GFP)比較，除了 PoIFN-卩cho， MDBK-Mxp-Luc檢測方法要比抗病毒活性定量檢測方法的敏感性要略高。 IO倍稀釋的轉染對照上清、陰性CHO培養(yǎng)液，幾乎對Mxp沒有激活，而IO倍稀釋 的野生型桿裝病毒感染的上清，對Mxp有較高激活，可能是由于桿裝病毒一過性感染 的結果，IOO倍稀釋的就幾乎沒有激活。
由于沒有豬和牛IFN標準品(WHO),所以為了檢驗MDBK-Mxp-Luc檢測方法的 重復性，本研究通過計算BoIFN-Pcho和PoIFN-Pcho比值的變異系數(shù)來實現(xiàn)。把 BoIFN-(3cHo分別進行IOO倍(A)和100,000倍(B)稀釋，把PoIFN-pCHO進行1,000 倍(C)禾n 1000,000倍(D)稀釋。其中樣A和C的活性較高(60~100AU/ml)，為 MDBK-Mxp-Luc檢測線性范圍的上限；樣B禾卩D的活性較低(0.6 1.0AU/ml)，為 MDBK-Mxp-Luc檢測線性范圍的下限。分別以MDBK-Mxp-Luc在同一批次內(nèi)和不同 批次間檢測樣A、 B、 C和D各10次，檢測并計算螢光素酶表達量比值(RLUAyc和 RLUB/D)的變異系數(shù)，由表2可知，在同一批次，MDBK-Mxp-Luc檢測高活性 BoIFN-)3cho和PoIFN-(3cho的比惶(RLUa;c)為1.13±0.063，變異系數(shù)為0.056;檢測 低活性(RLUB/D)為1.15±0.044，變異系數(shù)為0.038。對于不同批次間的檢測，相應的 RLUA/c為1.10±0.100，變異系數(shù)為0.092; RLUB/o為1.12±0.094，變異系數(shù)為0.084。
表1 MDBK-Mxp-Luc和AVA檢測敏感性的比較
BoIFN-aBoIFN-P面PoIFN-aPoIFN長Ho
AVA (VSV*GFP)107_a106—106—106+
MDBK-Mxp-Luc107+b106+106+106+
分別用MDBK-Mxp-Luc和AVA (使用VSV*GFP)方法分析BoIFN-a, BoIFN-pCHO, PoIFN-a和PoIFN-Paro的生物學活性。結果表明，前者比后者敏感性略高。圖中數(shù)值 表示干擾素樣品的稀釋倍數(shù)。
a表示此稀釋度干擾素的生物學活性"不能夠"被檢測出。 b表示此稀釋度干擾素的生物學活性"能夠"被檢測出。
表2 MDBK-Mxp-Luc檢測的重復性
RLUa/c (IFN的高生物活性， 600~1020AU/ml)RLUB/D (IFN的低生物活性， 0.6~1.0AU/ml)
平均值標準偏差變異系數(shù)平均值標準偏差變異系數(shù)
測定間1.13 0.063 5.6%1.150.044 3.8G/o
(Intraas say) 測定間1.10 0.100 9,2%1.120.094 8.4%
BoIFN-卩oro分別以10倍(A)和100,000倍(B)稀釋，PoIFN-pCHO分別以1,000倍(C)和1000,000倍(D)稀釋。那么，A和C樣的抗病毒活性較高(600~1020AU/ml)， B和D 樣的抗病毒活性較低(0.6~1.0AU/ml)。用MDBK-Mxp-Luc分別同一批次內(nèi)和批次間 對A、 B、 C和D樣檢測10次，計算A和C、 B和D的比值，分別用RLU(相對熒光 單位)A/C和RLUB/D表示，然后分別計算上述比值的平均值、標準差和變異系數(shù)。
3討論
IFN-a/|3主要作用于I型IFN受體，激活JAK1和TYK2，促使STAT蛋白的酪氨 酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9復合物，即IFN刺激基因因子3 (IFN-stimulated gene factor 3， ISGF3)， ISGF3轉運到核內(nèi)結合到含有ISRE的DNA調(diào)節(jié)序列，刺激 超過100種IFN刺激基因(ISGs)的轉錄，誘導出"抗病毒狀態(tài)"。因此ISRE是I型IFN 誘導出抗病毒狀態(tài)的關鍵。哺乳動物IFN-a/p效應基因內(nèi)有序列為 5'-A7GGTTTCNo-2)TTTCC/T-3'的 ISRE 基序，而雞 Mxp 內(nèi)的序列 5'-AGTTTCGTTTCT-3'符合上述序列的特征。因此，雞Mxp不但適用于雞I型IFN的 檢測，也適用于哺乳動物I型IFN生物活性的檢測，本文證實雞Mxp能夠用于牛、豬 IFN-a/卩的生物學活性檢測。
本研究建立的MDBK-Mxp-Luc檢測系統(tǒng)顯示出諸多方面的優(yōu)越性整個過程完全 避免VSV等活病毒的使用，沒有生物安全的顧慮；螢光素酶的表達可以通過儀器檢測 精確量化，不僅提高了 IFN定量的準確性，而且便于高通量操作，變異系數(shù)小于10%， 大大優(yōu)于抗病毒檢測的重復性(15% — 59%)。此外，在約0.1 100AU/ml之間，干擾 素活性與螢光素酶的表達成正相關，在約0.5 100AU/ml之間，成線性相關，在線性 范圍內(nèi)只需要一個稀釋度就能夠得出檢測結果，減少了工作量。
再與ELISA方法相比，MDBK-Mxp-Luc系統(tǒng)檢測的是IFN激活Mxp的能力，不 存在假陽性；本試驗對不同來源的牛、豬IFN-ot/p的檢測表明，總體來講 MDBK-Mxp-Luc檢測方法比抗病毒活性定量分析(VSV*GFP)的敏感性略高，具有 一定優(yōu)越性。
除以上優(yōu)點外，與報道的報告基因檢測系統(tǒng)相比較，I型干擾素剌激Mx啟動子的 時間與螢光素酶的表達量的關系明顯不同。已有的報道使用人、鼠、魚的Mx啟動子 和氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、 Luc和人生長激素(hGH)等報告基因，在vero、 MDBK 或CHSE等細胞上檢測人、鼠、魚或牛的I型干擾素，干擾素處理后48h，報告基因的 表達仍然在增加， 一般選擇24h或48h作為干擾素處理細胞的時間，整個檢測所需時 間最少22小時[3-7'2()'21]。對于MDBK-Mxp-Luc分析系統(tǒng)，干擾素刺激5 6 h，螢光素 酶的表達就已達到最高峰，并且在12h降低了5倍，這與以往所有的報道都不相同。 整個檢測可在14個小時內(nèi)完成，是己報道的基于Mx啟動子和報告基因檢測方法中最 快的，相比較于抗病毒活性檢測方法的40-48小時，更是大大節(jié)約了檢測時間。本方 法中雞Mx啟動子和其它啟動子刺激時間差異的根本原因是什么？可能是由于本研究克隆的雞Mxp啟動子堿基序列特殊性，或啟動子結構上的不同，也可能是由于其它未 知原因，但無論如何，對這些未知的探索將會增進我們對干擾系統(tǒng)進化及誘導機制的 了解。
在一些病毒感染的過程中，病毒表達的某些蛋白(如牛呼吸道合胞病毒和流感的 NS蛋白、尼帕病毒和新城疫病毒的V蛋白等)通過阻斷I型IFN的信號轉導通路來 抵御宿主的進攻，而ISRE在I型IFN抑制病毒感染復制中是一個重要的樞紐，因此 MDBK-Mxp-Luc細胞系還作為研究病毒感染與牛I型IFN系統(tǒng)相互作用的分子機制的 有力工具。
結論，本研究建立了敏感、準確、快速、簡便和安全的豬、牛I型干擾素報告基 因分析方法，可用來替代費時費力的傳統(tǒng)AVA方法。
參考文獻 Meager A. Biological assays for interferons [J]. J Immunol Methods, 2002, 261(l-2):21-36 Karayianni-Vasconcelos G, Mucha V, Kontsek P. Increased sensitivity of an enzyme immunoassay for human interferon alpha 1 using a mixture of three monoclonal antibodies [J]. J Immunoassay, 1994, 15(3):251-261 Bollati-Fogolin M, Muller W. Virus free, cell-based assay for the quantification of murine type I
interferons [J]. J Immunol Methods, 2005, 306(1-2):169-175 [4] Canosi U, Mascia M, Gazza L, et al. A highly precise reporter gene bioassay for type I interferon [J]. J
Immunol Methods, 1996, 199(l):69-76 [5] Francois C, Bernard I， Castelain S, et al. Quantification of different human alpha interferon subtypes
and pegylated interferon activities by measuring MxA promoter activation [J]. Antimicrob Agents
Chemother, 2005, 49(9):3770-3775 [6] Johansen A, Collet B, Sandaker E, et al. Quantification of Atlantic salmon type-I interferon using an
Mxl promoter reporter gene assay [J]. Fish Shellfish Immunol, 2004, 16(2): 173-184 [7] Lleonart R, Naf D， Browning H, et al. A novel, quantitative bioassay for type I interferon using a
recombinant indicator cell line [J〗.Biotechnology (N Y), l卿，8(12):1263-1267 [8] Schwarz H, Harlin O, Ohnemus A, et al. Synthesis of IFN-beta by virus-infected chicken embryo cells
demonstrated with specific antisera and a new bioassay [J]. J Interferon Cytokine Res, 2004,
24(3):179-184 Asano A， Ko J H, Morozumi T, et al. Polymorphisms and the antiviral property of porcine Mxl
protein [J]. J VetMed Sci, 2002, 64(12):1085-1089 [10] Kolb E, Laine E, Strehler D, et al. Resistance to influenza virus infection of Mx transgenic mice
expressing Mx protein under the control of two constitutive promoters [J]. J Virol, 1992,
66(3):1709-1716 Staeheli P, Horisberger M A, Haller O. Mx-dependerit resistance to influenza viruses is induced by mouse interferons alpha and beta but not gamma [J]. Virology, 1984, 132(2):456-461 Files J G， Gray J L, Do L T, et al. A novel sensitive and selective bioassay for human type I interferons. J Interferon Cytokine Res, 1998, 18(12):1019-1024 [13] Simon A, Fah J, Haller O, et al. Interferon-regulated Mx genes are not responsive to interleukin-1,
tumor necrosis factor, and other cytokines [J]. J Virol, 1991, 65(2):968-971 [14] Alam J, Cook J L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription [J]. Anal2):245-254 [15] Li Z, Jiang Y, Jiao P, et al. The NSJ gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses. J Virol, 2006, 80(22):11115-11123 [16] Niwa H, Yamamura K， Miyazaki J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel
eukaryotic vector [J]. Gene, 1991, 108(2):193-199 [17] Takada A, Robison C, Goto H, et al. A system for flinctional analysis of Ebola virus glycoprotein [J].
Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(26): 14764-14769 [18] Garcia-Sastre A, Biron C A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente [J].
Science, 2006, 312(5775):879-882 [19] Ferreira P C, Peixoto M L, Silva M A, et al. Assay of human interferon in Vero cells by several
methods [J]. J Clin Microbiol, 1979, 9(4):471-475 [20] Fray M D, Mann G E, Charleston B. Validation of an Mx/CAT reporter gene assay for the
quantification of bovine type-I interferon〖J]. J Immunol Methods, 2001, 249(l-2):235-244 [21〗 Schumacher B, Bernasconi D, Schultz U， et al. The chicken Mx promoter contains an ISRE motif and
confers interferon inducibility to a reporter gene in chick and monkey cells [J]. Virology, 1994,
203(1):144-148序列表
<110〉中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
〈120〉檢測I型干擾素生物學活性的細胞系及其應用
〈130〉 IB083070
<160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.1
<210〉 1
〈211〉 460
〈212〉 薩
〈213〉 雞
〈400〉 1
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3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 550權利要求
1.一種檢測動物I型干擾素的生物學活性的方法，該方法包括以下步驟1)構建表達熒光素酶的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含Mx啟動子和與該啟動子可操作地連接的編碼熒光素酶的基因；2)將步驟1)中構建的重組質(zhì)粒轉染所述動物細胞；3)用待測的動物I型干擾素樣品處理在步驟2)中獲得的轉染細胞，比較在處理前后所述細胞的熒光素酶基因的表達水平。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述Mx啟動子包含I型干擾素應答的關鍵 基因序列(ISRE) 5'-AGTTTCGTTTCT，優(yōu)選是雞Mx啟動子。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中所述動物是禽類如雞、或哺乳動物如豬 或牛。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中所述I型干擾素是(x或P干擾素。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中在步驟l)中的雞Mx啟動子的序列如 SEQ ID NO: 1所示。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中在步驟l)中的重組質(zhì)粒為pMxp-luc，其核 苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中在步驟2)中的所述轉染是穩(wěn)定轉染或 瞬時轉染。
8. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中在步驟3)中的動物I型干擾素樣品是 重組表達所述動物I型干擾素的細胞系的培養(yǎng)上清液或相應I型干擾素重組質(zhì)粒轉染 哺乳動物細胞的培養(yǎng)上清液，優(yōu)選處理轉染細胞5至6小時，優(yōu)選所述細胞系是BHK-21 細胞或CHO細胞。
9. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中在步驟2)中獲得的動物細胞是 MDBK-Mxp-Luc細胞系，其保藏編號為CGMCC 2416。
10. MDBK-Mxp-Luc細胞系，其保藏編號為CGMCC 2416。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測動物I型干擾素的生物學活性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種基于Mx啟動子和螢光素酶報告基因定量檢測動物如雞、牛和豬的I型干擾素生物學活性的方法。與所有已報道的基于Mx啟動子—報告基因檢測方法中相比，該檢測方法所需時間最短，可大幅度節(jié)約檢測時間；與傳統(tǒng)抗病毒定量檢測方法相比，具有快速簡便、準確敏感、便于高通量檢測等顯著優(yōu)勢，在禽類乃至哺乳動物干擾素生物學基礎和應用研究及產(chǎn)業(yè)化過程中具有重要應用價值。
文檔編號C12Q1/66GK101603076SQ200810109949
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月11日 優(yōu)先權日2008年6月11日
發(fā)明者步志高, 陳偉業(yè) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所