專利名稱：基于HepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種基于HepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，尤其涉及一種高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株(HepG2.HSWT)及其制備方法。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域公知，HBV細(xì)胞模型是篩選抗藥物、研究其生物學(xué)特點(diǎn)及其與細(xì)胞間相互作用的必要工具。尤其在研究有關(guān)肝疾病的發(fā)病機(jī)制、免疫機(jī)制、抗病毒藥物的篩選中具有重要作用；其中，Hep2. 2. 15細(xì)胞是HBV細(xì)胞模型開(kāi)發(fā)研究的里程碑，有研究顯示，其用含2個(gè)HBV頭對(duì)尾二聚體的pDolt-HBV-Ι重組載體轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得一個(gè)產(chǎn)高水平HBsAg和HBeAg的細(xì)胞克隆，其胞內(nèi)外均能檢測(cè)到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒顆粒。迄今，Hep2. 2. 15仍是相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的HBV細(xì)胞模型。
然而，HepG2. 2. 15在HBV研究方面仍存在下述缺陷(1)H印G2.2. 15HBV蛋白如HBsAg, HBeAg表達(dá)水平相對(duì)較低，不利于相關(guān)病毒蛋白的研究，且與HBV-DNA —樣，其表達(dá)水平不穩(wěn)定，受培養(yǎng)環(huán)境等因素影響較多；(2)其整合的HBV基因型非B、C基因型，對(duì)于研究中國(guó)人群HBV發(fā)病或耐藥機(jī)制方面的研究存在相當(dāng)?shù)木窒扌?。鑒于中國(guó)是肝炎發(fā)病大國(guó)，Hep2. 2. 15顯然已經(jīng)不能完全滿足目前相關(guān)的研究，國(guó)內(nèi)目前的有關(guān)研究需要良好的HBV細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種基于!fepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，尤其涉及一種高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株(HepG2.HSWT)及其制備方法。本發(fā)明的細(xì)胞系有利于中國(guó)人群HBV發(fā)病或耐藥機(jī)制方面的深入研究，可進(jìn)一步用于篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學(xué)特點(diǎn)及其與細(xì)胞間相互作用的HBV細(xì)胞模型的建立。本發(fā)明的基于!fepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，能持續(xù)表達(dá)HBsAg及HBeAg，胞內(nèi)有HBV復(fù)制，并可產(chǎn)生HBV顆粒；與所述的的Hep2. 2. 15細(xì)胞相比，本發(fā)明的細(xì)胞系表達(dá)HBsAg及HBeAg明顯高于!fep2· 2. 15，細(xì)胞上清HBV顆粒水平與Ifep2· 2. 15基本持平。本發(fā)明尤其提供了一種高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株0fepG2. HSWT)，所述的細(xì)胞株H印G2. HSffT其整合的HBV基因型為B或C基因型；該細(xì)胞株對(duì)LAM及ADV均敏感；HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發(fā)明將HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，通過(guò)潮霉素篩選，然后檢測(cè)細(xì)胞中HBV復(fù)制、特異性抗原的表達(dá)及病毒顆粒的產(chǎn)生，并與H印2. 2. 15細(xì)胞株相比較，最終建成基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，獲得高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株HepG2. HSWT,已于2011年6月I日保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No. 4909，分類命名人肝癌細(xì)胞株H印G2. HSWT。
本發(fā)明中，所述的HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT，來(lái)源于福建醫(yī)科大學(xué)分子病毒
實(shí)驗(yàn)室;所述質(zhì)粒的載體骨架為pREPIO載體,該載體的優(yōu)勢(shì)在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于細(xì)胞篩選工作以及EBNA-I基因轉(zhuǎn)錄蛋白能夠上調(diào)含OriP復(fù)制原點(diǎn)的真核表達(dá)質(zhì)粒中基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；
所述HBV復(fù)制子為含CP啟動(dòng)子以及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體(B型，GeneBank登錄號(hào)AF100309)，插入切除RSV啟動(dòng)子的pREPIO，構(gòu)建成HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WTo本發(fā)明的細(xì)胞株具有以下生物學(xué)特性能持續(xù)表達(dá)HBsAg及HBeAg，胞內(nèi)有HBV復(fù)制，并可產(chǎn)生HBV顆粒；與目前廣泛使用的H印2. 2. 15相比，其表達(dá)HBsAg及HBeAg明顯高于Hep2. 2. 15，細(xì)胞上清HBV顆粒水平與Hep2. 2. 15基本持平，該細(xì)胞株整合的HBV基因型為B或C基因型；其對(duì)LAM及ADV均敏感；HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發(fā)明的高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株0fepG2. HSWT)通過(guò)下述方法和步驟制備(I)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞①細(xì)胞培養(yǎng)!fepG2細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液來(lái)源于Gibco公司，培養(yǎng)液中含10 %小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，0. 03%谷氨酰胺；②細(xì)胞轉(zhuǎn)染將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，吸去胰酶后，用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；按5X IO5細(xì)胞/孔的濃度接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，待細(xì)胞約80-90%融合成片時(shí)，換新鮮無(wú)抗生素的培養(yǎng)液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；按照每孔轉(zhuǎn)染2 μ g的量，將50 μ I OptiDMEM培養(yǎng)液與5 μ I Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)混合，同時(shí)將2 μ g質(zhì)粒DNA稀釋于50 μ I OptiDMEM培養(yǎng)液中，混勻后室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質(zhì)粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時(shí)后用PBS清洗2遍后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(2)潮霉素篩選細(xì)胞克?、俎D(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后擴(kuò)大培養(yǎng)至IOcm培養(yǎng)皿，并設(shè)空白對(duì)照(未轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞)；②待細(xì)胞貼壁后加入潮霉素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對(duì)照細(xì)胞全部死亡后觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況；⑤挑取細(xì)胞克隆至24孔培養(yǎng)板，以潮霉素濃度150ug/ml繼續(xù)培養(yǎng)；⑥待24孔培養(yǎng)板中細(xì)胞克隆密度至60-70%后測(cè)上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆傳至6孔培養(yǎng)板以潮霉素濃度150ug/ml繼續(xù)培養(yǎng)；(3)細(xì)胞克隆的有限稀釋步驟(2)中獲得的6株陽(yáng)性克隆中的I株細(xì)胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經(jīng)定量后上清HBsAg為30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持于104-105COpieS/ml ;細(xì)胞傳至10代左右，采用有限稀釋法獲取更純凈以及高水平表達(dá)蛋白細(xì)胞克??；將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以O(shè). 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后細(xì)胞密度稀釋為lOcell/ml，接種96孔培養(yǎng)板，每孔150ul培養(yǎng)基(含潮霉素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記只接種Icell的培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液一次；2_3周后待細(xì)胞密度約60%左右后傳至24孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)；待24孔中細(xì)胞密度至60-70%后測(cè)上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，將HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平較高的一株細(xì)胞克隆定義為pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型細(xì)胞株的生物學(xué)特征及表型耐藥分析①細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測(cè)
HBsAg 及 HBeAg 精確定量試劑盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA檢測(cè)采用上海科華生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)步驟按照試劑盒提供的說(shuō)明書中記載的步驟，real-time PCR擴(kuò)增儀采用ABI-7300，檢測(cè)結(jié)果如圖I所示；②細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制檢測(cè)細(xì)胞總DNA抽提，6孔板中細(xì)胞90%匯合度時(shí)加入400ul細(xì)胞裂解液，37°C過(guò)夜(細(xì)胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚進(jìn)行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE0 I. 3%凝膠電泳后20XSSC轉(zhuǎn)膜，southern-blot雜交；結(jié)果顯示HBV雜交信號(hào)提示胞內(nèi)HBV復(fù)制；③HBV野生型細(xì)胞株細(xì)胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細(xì)胞密度接種12孔板，細(xì)胞貼壁后加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設(shè) 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 個(gè)濃度梯度，阿德福韋設(shè) 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)復(fù)孔，隔天換液，第10天檢測(cè)細(xì)胞上清HBV-DNA水平，細(xì)胞抽提胞內(nèi)總DNA檢測(cè)胞內(nèi)HBV復(fù)制情況。檢測(cè)分析所述的高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株H印G2. HSffT,結(jié)果顯示，細(xì)胞上清HBV-DNA水平隨LAM以及ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測(cè)水平以下，表明對(duì)LAM及ADV均敏感(如圖2所示)；雜交結(jié)果顯示，HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發(fā)明建立了一種基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，尤其是高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株0fepG2. HSWT)，該細(xì)胞系HBsAg、HBeAg表達(dá)水平明顯高于H印G2. 2. 15，表達(dá)水平穩(wěn)定，受培養(yǎng)環(huán)境等因素影響少，且整合的HBV基因型為B或C基因型，有利于研究中國(guó)人群HBV發(fā)病或耐藥機(jī)制，可用于篩選抗HBV藥物。


圖I顯示了 pREP-HBV (WT) HBV細(xì)胞株上清HBsAg、HBeAg表達(dá)水平，HBsAg水平維持于20-40IU/ml之間，為H印2. 2. 15細(xì)胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之間，為H印2. 2. 15細(xì)胞4-8倍左右，HBV-DNA維持于IO4-IO5之間，略低于H印2. 2. 15細(xì)胞，隨傳代次數(shù)增加無(wú)明顯下降。
圖2顯示了 pREP-HBV (WT) HBV細(xì)胞株耐藥表型分析，細(xì)胞上清HBV-DNA水平隨LAM和ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測(cè)下限之下，表明對(duì)LAM及ADV均敏感。圖3顯示了 pREP-HBV(WT)HBV細(xì)胞株細(xì)胞上清HBV-DNA基因測(cè)序結(jié)果表明野生型，與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒相同。圖4為pREP-HBV(WT)細(xì)胞株鏡下細(xì)胞形態(tài)圖，其中，左圖為高倍鏡下(20X)細(xì)胞形態(tài)圖，右圖為低倍鏡下(IOX)細(xì)胞形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I建立H印G2. HSffT細(xì)胞株將HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，通過(guò)潮霉素篩選，然后檢測(cè)細(xì)胞中HBV復(fù)制、特異性抗原的表達(dá)及病毒顆粒的產(chǎn)生，并與Hep2. 2. 15細(xì)胞株相比較， 最終建成基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，獲得高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株HepG2. HSWT,已于2011年6月I日保藏,保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No. 4909，分類命名人肝癌細(xì)胞株H印G2. HSWT。所述的細(xì)胞株H印G2. HSffT通過(guò)下述方法和步驟制備(I)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染!fepG2細(xì)胞①細(xì)胞培養(yǎng)!fepG2細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液來(lái)源于Gibco公司，培養(yǎng)液中含10 %小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，O. 03%谷氨酰胺；②細(xì)胞轉(zhuǎn)染將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以O(shè). 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；按5X IO5細(xì)胞/孔的濃度接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，待細(xì)胞約80-90%融合成片時(shí)，換新鮮無(wú)抗生素的培養(yǎng)液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；按照每孔轉(zhuǎn)染2 μ g的量，將50 μ I OptiDMEM培養(yǎng)液與5 μ I Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)混合，同時(shí)將2 μ g質(zhì)粒DNA稀釋于50 μ I OptiDMEM培養(yǎng)液中，混勻后室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質(zhì)粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時(shí)后用PBS清洗2遍后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(2)潮霉素篩選細(xì)胞克隆①轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后擴(kuò)大培養(yǎng)至IOcm培養(yǎng)皿，并設(shè)空白對(duì)照(未轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞)；②待細(xì)胞貼壁后加入潮霉素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對(duì)照細(xì)胞全部死亡后觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況；⑤挑取細(xì)胞克隆至24孔培養(yǎng)板，以潮霉素濃度150ug/ml繼續(xù)培養(yǎng)；⑥待24孔培養(yǎng)板中細(xì)胞克隆密度至60-70%后測(cè)上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆傳至6孔培養(yǎng)板以潮霉素濃度150ug/ml繼續(xù)培養(yǎng)；(3)細(xì)胞克隆的有限稀釋
步驟(2)中獲得的6株陽(yáng)性克隆中的I株細(xì)胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經(jīng)定量后上清HBsAg為30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持于104-105COpieS/ml ;細(xì)胞傳至10代左右，采用有限稀釋法獲取更純凈以及高水平表達(dá)蛋白細(xì)胞克??；將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以O(shè). 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后細(xì)胞密度稀釋為lOcell/ml，接種96孔培養(yǎng)板，每孔150ul培養(yǎng)基(含潮霉素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記只接種Icell的培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液一次；2_3周后待細(xì)胞密度約60%左右后傳至24孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)；待24孔中細(xì)胞密度至60-70%后測(cè)上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，將HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平較高的一株細(xì)胞克隆定義為pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型細(xì)胞株的生物學(xué)特征及表型耐藥分析
①細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測(cè)

HBsAg 及 HBeAg 精確定量試劑盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA檢測(cè)采用上?？迫A生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)步驟按照試劑盒提供的說(shuō)明書中記載的步驟，real-time PCR擴(kuò)增儀采用ABI-7300，檢測(cè)結(jié)果如圖I所示；②細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制檢測(cè)細(xì)胞總DNA抽提，6孔板中細(xì)胞90%匯合度時(shí)加入400ul細(xì)胞裂解液，37°C過(guò)夜(細(xì)胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚進(jìn)行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE0 I. 3%凝膠電泳后20XSSC轉(zhuǎn)膜，southern-blot雜交；結(jié)果顯示HBV雜交信號(hào)提示胞內(nèi)HBV復(fù)制；③HBV野生型細(xì)胞株細(xì)胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細(xì)胞密度接種12孔板，細(xì)胞貼壁后加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設(shè) 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 個(gè)濃度梯度，阿德福韋設(shè) 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)復(fù)孔，隔天換液，第10天檢測(cè)細(xì)胞上清HBV-DNA水平，細(xì)胞抽提胞內(nèi)總DNA檢測(cè)胞內(nèi)HBV復(fù)制情況。實(shí)施例2測(cè)試H印G2. HSffT細(xì)胞株如圖I所示，pREP-HBV (WT) HBV細(xì)胞株上清HBsAg、HBeAg表達(dá)水平，HBsAg水平維持于20-40IU/ml之間，為H印2. 2. 15細(xì)胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之間，為H印2. 2. 15細(xì)胞4-8倍左右，HBV-DNA維持于IO4-IO5之間，略低于H印2. 2. 15細(xì)胞，隨傳代次數(shù)增加無(wú)明顯下降。如圖2所示，pREP_HBV(WT)HBV細(xì)胞株耐藥表型分析的結(jié)果表明，細(xì)胞上清HBV-DNA水平隨LAM和ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測(cè)下限之下，表明對(duì)LAM及ADV均敏感。如圖3所示，pREP-HBV(WT)HBV細(xì)胞株細(xì)胞上清HBV-DNA基因測(cè)序結(jié)果表明野生型，與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒相同。結(jié)果顯示，所述的高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株H印G2.HSWT，細(xì)胞上清HBV-DNA水平隨LAM以及ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測(cè)水平以下，表明對(duì)LAM及ADV均敏感；雜交結(jié)果顯示，HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。
權(quán)利要求
1.基于HepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株，保藏編號(hào)=CGMCC No. 4909，分類命名高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株H印G2. HSffT ;具有以下生物學(xué)特性 能持續(xù)表達(dá)HBsAg及HBeAg，胞內(nèi)有HBV復(fù)制，并產(chǎn)生HBV顆粒；與!fep2. 2. 15相比，其表達(dá)HBsAg及HBeAg高于!fep2· 2. 15，細(xì)胞上清HBV顆粒水平與Ifep2· 2. 15基本持平，其整合的HBV基因型為B或C基因型；其對(duì)LAM及ADV均敏感；HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。
2.按權(quán)利要求I所述的細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，將HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，通過(guò)潮霉素篩選，然后檢測(cè)細(xì)胞中HBV復(fù)制、特異性抗原的表達(dá)及病毒顆粒的產(chǎn)生，并與ifep2. 2. 15細(xì)胞株相比較，最終建成基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，獲得高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株H印G2. HSWT。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT的載體骨架為PREPlO載體。
4.按權(quán)利要求2方法，其特征在于，所述的HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT通過(guò)含cp啟動(dòng)子及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體，B型(GeneBank登錄號(hào)AF100309)的復(fù)制子插入切除RSV啟動(dòng)子的pREPIO，構(gòu)建成HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT。
5.權(quán)利要求I的基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系在篩選抗HBV藥物中的用途。
6.按權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的基于H印G2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系選自高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株H印G2. HSWT。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及一種基于HepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，尤其涉及一種高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株HepG2.HSWT及其制備方法。本發(fā)明將HBV真核表達(dá)質(zhì)粒pREP-HBV-WT轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，通過(guò)潮霉素篩選，檢測(cè)細(xì)胞中HBV復(fù)制、特異性抗原的表達(dá)及病毒顆粒的產(chǎn)生，獲得高表達(dá)野生型HBV病毒肝癌細(xì)胞株HepG2.HSWT；所述的細(xì)胞株其表達(dá)HBsAg、HBeAg水平明顯高于HepG2.2.15，表達(dá)水平穩(wěn)定，受培養(yǎng)環(huán)境等因素影響少，整合的HBV基因型為B或C基因型，所述的細(xì)胞對(duì)LAM及ADV均敏感，HBV胞內(nèi)復(fù)制水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發(fā)明的基于HepG2穩(wěn)定表達(dá)HBV野生株細(xì)胞系，可用于中國(guó)人群HBV發(fā)病或耐藥機(jī)制的研究和可用于篩選抗HBV藥物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102816737SQ20111015353
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者張繼明, 張軼俊 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院