一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬于淡水生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。它的步驟如下：配制細(xì)胞培養(yǎng)液；選取體重30?40克的雌福壽螺在無菌水中飼養(yǎng)；對雌福壽螺進(jìn)行表面消毒；解剖福壽螺取卵巢組織；將卵巢組織用PBS清洗液清洗并剪碎；將處理后的卵巢組織接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；培養(yǎng)瓶置于5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi),28℃恒溫培養(yǎng)；過夜后，再加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液，將組織浸沒；每隔5天吸出和換入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶。本發(fā)明能在較短時(shí)間內(nèi)快速、可重復(fù)地建立福壽螺卵巢組織細(xì)胞系，所需要的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備簡單，可操作性強(qiáng)。本發(fā)明是對水生無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)的重要補(bǔ)充，也為水生無脊椎動物的免疫機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。
【專利說明】
一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于淡水生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自從上世紀(jì)初Harrison和Carrel創(chuàng)立動物組織和細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法以來，細(xì)胞 培養(yǎng)技術(shù)得到了長足的發(fā)展，在基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究中都起到了不可替代的重要作 用。然而，到目前為止，對于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)本身的研究主要集中于脊椎動物(特別是哺乳動 物)和昆蟲，對于水生無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)注卻相對較少。在公開刊物發(fā)表的有關(guān)細(xì)胞 培養(yǎng)問題的論文中，絕大多數(shù)是脊椎動物和昆蟲的.
[0003] 從20世紀(jì)60年代開始，研究者開始關(guān)注水生無脊椎動物的細(xì)胞培養(yǎng)問題，水生無 脊椎動物的多種組織和細(xì)胞被嘗試進(jìn)行體外培養(yǎng)，包括上皮細(xì)胞，血細(xì)胞，消化腺，幼體和 胚胎組織等。在20世紀(jì)70年代便建立了水生無脊椎動物雙臍螺胚胎（Biomphalaria glabrataembryonie，BGE)細(xì)胞系（Hansen, 1976) JGE細(xì)胞系是Hansen為了研究血吸蟲胞瑣 感染細(xì)胞機(jī)制于1976年從淡水雙臍螺胚胎建立的，后由Bayne等完善了凍存方法并提交給 ATCC(CRL-1494)〇
[0004] 盡管在水生無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)的早期便獲得如此可喜的成就，但幾十年過去后 相對于上個(gè)世紀(jì)70年代沒有大的進(jìn)展，到目前為止，除了BGE細(xì)胞系，還沒有成功建系的報(bào) 道，大部分細(xì)胞培養(yǎng)通常在體外只能存活比較短的時(shí)間，雖然有些報(bào)道細(xì)胞可存活數(shù)月但 只能分裂幾代便不再分裂，整個(gè)培養(yǎng)最后也因微生物污染而告終。
[0005] 福壽螺又名大瓶螺、蘋果螺，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。1980年前后，因其蛋白 質(zhì)含量豐富，營養(yǎng)成分高且繁殖能力強(qiáng)，而被作為一種水生經(jīng)濟(jì)動物被引入臺灣、菲律賓和 日本，并迅速擴(kuò)散到東亞和東南亞其余國家(Halwart，1994)。后來由于市場化失敗，福壽螺 遭棄養(yǎng)并迅速擴(kuò)散結(jié)果暴發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重危害作物生產(chǎn)(Naylor，1996)。2000年，世界自然保 護(hù)耳關(guān)盟（World Conservation Union ； International Union for Conservation of Nature and Natural Resources ;IUCN)外來入侵物種專家委員會將福壽螺列為世界100種 惡性外來入侵物種之一(Lowe et al.，2000)，也是其中唯一的一種淡水螺。在我國大陸，福 壽螺于1981年引入到廣東養(yǎng)殖，1984年后在廣東、廣西、福建等地開始廣泛養(yǎng)殖，隨后推廣 到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成為長江以南大部分省區(qū)的嚴(yán)重農(nóng)業(yè)害蟲（俞曉平 等，2001)。2003年，國家環(huán)?？偩趾椭袊茖W(xué)院（2003)將福壽螺列入了首批入侵中國的16 種外來物種的"黑名單"
[0006] 在福壽螺的防治過程中，除農(nóng)業(yè)防治和物理防治外，新型生物農(nóng)藥的篩選和鑒定 日益成為研究重點(diǎn)。生物農(nóng)藥的活動生物測定需要大量發(fā)育一致的福壽螺，對飼養(yǎng)場地有 嚴(yán)格的要求，工作量大，而若有離體培養(yǎng)的福壽螺細(xì)胞，則可以在離體條件下研究生物農(nóng)藥 對二福壽螺的作用，從而有助于在細(xì)胞水平研究殺蟲劑對福壽螺的作用機(jī)制，有助于當(dāng)前 殺蟲劑的改進(jìn)和新殺蟲劑的發(fā)明。因此，通過本發(fā)明，建立福壽螺細(xì)胞系，不僅能增加我國 無脊椎動物細(xì)胞系的數(shù)量及種類，還能為日后該類生物細(xì)胞系的建立提供借鑒經(jīng)驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法，為福壽螺生理生化研 究、毒理學(xué)研究以及入侵生物學(xué)研究等提供技術(shù)支持和保障。
[0008] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案完成：
[0009] -種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法，依次進(jìn)行以下步驟：
[0010] (1)配制細(xì)胞原代培養(yǎng)液和細(xì)胞傳代培養(yǎng)液；
[0011] (2)選取體重30-40克福壽螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時(shí)；
[0012] (3)在無菌條件下，將雌福壽螺浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進(jìn)行表面消毒ΙΟ- ? 5 分鐘；
[0013] (4)用無菌蒸餾水清洗福壽螺3-5次；
[0014] (5)用無菌濾紙吸干福壽螺表面水分；
[0015] (6)將福壽螺置于75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
[0016] (7)用解剖剪刀剪取福壽螺卵巢組織，放入盛有HBSS清洗液的六孔培養(yǎng)板里面清 洗3-5次，最后一次清洗時(shí)，用無菌剪刀將壽螺卵巢組織剪成Imm3的小組織塊；
[0017] (8)將經(jīng)過(7)處理后的組織接種于含有卜1.5mL細(xì)胞原代培養(yǎng)液的T-25cm2細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中；
[0018] (9)將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28°C恒溫培養(yǎng)；
[0019] (10)過夜后，再加入2mL-3.OmL細(xì)胞傳代培養(yǎng)液，使組織浸沒在培養(yǎng)液中，每隔5-7 天吸出和換入60-70 %量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶；
[0020] (11)將培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，取2-3mL細(xì)胞懸液放入含有1-2ml細(xì)胞傳代培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中，每隔5-7天吸出和換入50%量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展 并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶；
[0021 ]保持整個(gè)操作過程都在無菌條件下進(jìn)行。上述方法還可以采用以下優(yōu)選方式，且 在不沖突的情況下，技術(shù)特征均可進(jìn)行相應(yīng)組合。
[0022]所述的細(xì)胞原代培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基與青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B和動物血 清的及飽和苯基硫脲的混合物，pH值為7.0-7.4。
[0023]所述的細(xì)胞傳代培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基與動物血清的混合物，pH值為7.0-7.4。
[0024]所述的動物血清為胎牛血清。
[0025] 所述的HBSS清洗液為HBSS溶液和青霉素，鏈霉素以及兩性霉素 B的混合液。
[0026]所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素含量為0.2μg/ml，兩性霉素 B含量為0.5yg/ ml〇
[0027] 所述的細(xì)胞原代培養(yǎng)液和細(xì)胞傳代培養(yǎng)液中，動物血清含量為10-20% (體積比）。
[0028] 所述的飽和苯基硫脲為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中配制而成。
[0029] 本發(fā)明的有益效果是：
[0030] 采用上述方案，對福壽螺卵巢組織細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，取得了較好 的培養(yǎng)效果。本發(fā)明快速、有效、重復(fù)性強(qiáng)，是對淡水無脊椎生物細(xì)胞培養(yǎng)的重要補(bǔ)充。福壽 螺為重要的外來入侵生物，本發(fā)明有助于在離體條件下研究福壽螺，為其防治途徑的研究 和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供幫助。
[0031] 本發(fā)明中福壽螺卵巢組織細(xì)胞系的生物學(xué)特征觀察和測定
[0032] 1.經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，該細(xì)胞系大部分貼壁生長，細(xì)胞的形狀大部分圓形，少部分多邊 形，短梭形細(xì)胞(圖1，圖2)。
[0033] 2.以2xl05細(xì)胞/mL的濃度接種到T-25cm2培養(yǎng)瓶中，27°C無光照培養(yǎng)，每天取一瓶 測定細(xì)胞濃度，繪制生長曲線（圖3)，并按照公式T = tlg2/[lg(N/N0)]計(jì)算群體倍增時(shí)間， 經(jīng)過計(jì)算第五代的細(xì)胞群體倍增時(shí)間為74小時(shí)。其中
[0034] τ =在對數(shù)期平均增長一倍所需的時(shí)間
[0035] t =接種到測定細(xì)胞數(shù)的時(shí)間
[0036] No =接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)
[0037] N=時(shí)刻t所測定的細(xì)胞總數(shù)
[0038] 3.用醛縮酶引物，利用DAF-PCR的方法鑒定了本發(fā)明建立的細(xì)胞系的確來源于福 壽螺的卵巢組織，而非其他細(xì)胞系的污染（圖4)。由細(xì)胞系提供的DNA條帶與福壽螺卵巢組 織DNA擴(kuò)增后的帶型相同，而與對照細(xì)胞系sf9和s2帶型明顯不同。
【附圖說明】
[0039] 圖1培養(yǎng)15天后卵巢組織細(xì)胞的培養(yǎng)形態(tài)；
[0040] 圖2培養(yǎng)40天后卵巢組織細(xì)胞的培養(yǎng)形態(tài)；
[0041] 圖3第5代卵巢組織細(xì)胞的生長曲線圖。
[0042]圖4細(xì)胞系的DAF-PCR鑒定圖譜，其中編號分別代表含義如下：I-DNA Maker; 2-本 發(fā)明所建細(xì)胞系;3-福壽螺軟組織;4-SF9; 5-S2。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：
[0044] 實(shí)施例1
[0045]細(xì)胞原代培養(yǎng)液的配制(配制500mL): 成分 數(shù)量 RPMI1640 培養(yǎng)坫 400mL
[0046] 胎牛血清 50.0mL 苯基硫脲飽和溶液 5CX0mL 青霉素 5 ml 鏈霉素 50mg
[0047] 兩性霉素 B 1.25mg
[0048] 在無菌操作臺內(nèi)，將上述成分混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049] 細(xì)胞傳代培養(yǎng)液的配制(配制500mL):
[0050]成分 數(shù)量
[0051 ] RPMI1640培養(yǎng)基 450mL
[0052] 胎牛血清 50 .OmL
[0053] 在無菌操作臺內(nèi)，將上述成分混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 實(shí)施例2福壽螺卵巢組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) [0055] 經(jīng)過下列步驟：
[0056] (1)配制細(xì)胞原代培養(yǎng)液；
[0057] (2)選取體重30克雌性福壽螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時(shí)；
[0058] (3)將雌福壽螺浸沒在70%乙醇溶液中，進(jìn)行表面消毒10分鐘；
[0059] (4)用無菌蒸餾水清洗福壽螺3次；
[0060] (5)用無菌濾紙吸干螺表面水分；
[0061 ] (6)將螺置于75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
[0062] (7)用解剖剪刀剪取卵巢組織，放入盛有HBSS清洗液的六孔培養(yǎng)板里面清洗3次， 最后一次時(shí)，用無菌剪刀剪成Imm3的小組織塊；
[0063] (8)將(7)處理的后的組織接種于含有ImL細(xì)胞培養(yǎng)液的T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；
[0064] (9)將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28°C恒溫培養(yǎng)；
[0065] (10)過夜后，再加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織浸沒在培養(yǎng)液中，每隔5天吸出和換入 60 %量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶；
[0066] (11)將（10)貼壁細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，取2細(xì)胞懸液放入含有Iml細(xì)胞傳代 培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中，每隔5天吸出和換入50%量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充 滿培養(yǎng)瓶；
[0067] 實(shí)施例3福壽螺卵巢組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) [0068] 經(jīng)過下列步驟：
[0069] (1)配制細(xì)胞原代培養(yǎng)液；
[0070] (2)選取體重40克福壽螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時(shí)；
[0071] (3)將雌福壽螺浸沒在75%乙醇溶液中，進(jìn)行表面消毒15分鐘；
[0072] (4)用無菌蒸餾水清洗福壽螺5次；
[0073] (5)用無菌濾紙吸干螺表面水分；
[0074] (6)將螺置于75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
[0075] (7)用解剖剪刀剪取卵巢組織，放入盛有HBSS清洗液的六孔培養(yǎng)板里面清洗5次， 最后一次時(shí)，用無菌剪刀剪成Imm3的小組織塊；
[0076] (8)將(7)處理的后的組織接種于含有1.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液的T-25cm2
[0077] (9)將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28°C恒溫培養(yǎng)；
[0078] (10)過夜后，再加入3.OmL細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織浸沒在培養(yǎng)液中，每隔7天吸出和換 入70 %量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶；
[0079] (11)將（10)貼壁細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，取3mL細(xì)胞懸液放入含有2ml細(xì)胞傳 代培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中，每隔7天吸出和換入50%量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞 充滿培養(yǎng)瓶；
[0080]實(shí)施例4細(xì)胞系的生物學(xué)特性觀察和測定
[00811 (1)形態(tài)特征:經(jīng)顯微鏡觀察，該細(xì)胞系貼壁生長，主要有三種細(xì)胞形狀:大部分圓 形，少部分多邊形和短梭形（圖I，圖2)圓形細(xì)胞占82%，平均直徑15μπι;多邊形細(xì)胞長約30μ m，寬平均約18μηι;
[0082] (2)細(xì)胞的生長:生長曲線呈典型的"S"，群體倍增時(shí)間為74小時(shí)（圖3)。
[0083] (3) DAF-PCR鑒定：用醛縮酶設(shè)計(jì)引物，利用DAF-PCR的方法鑒定了本發(fā)明建立的細(xì) 胞系的確來源于福壽螺卵巢組織細(xì)胞，而非其他細(xì)胞系的污染（圖4)。由細(xì)胞系提供的DNA 條帶與福壽螺卵巢組織擴(kuò)增后的帶型相同，而與對照細(xì)胞系sf9和s2帶型明顯不同。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種福壽螺卵巢細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法依次進(jìn)行以下步驟： (1) 配制細(xì)胞原代培養(yǎng)液和細(xì)胞傳代培養(yǎng)液； (2) 選取體重30-40克福壽螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時(shí)； (3) 在無菌條件下，將雌福壽螺浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進(jìn)行表面消毒10-15分 鐘； (4) 用無菌蒸餾水清洗福壽螺3-5次； (5) 用無菌濾紙吸干福壽螺表面水分； (6) 將福壽螺置于75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺； (7) 用解剖剪刀剪取福壽螺卵巢組織，放入盛有HBSS清洗液的六孔培養(yǎng)板里面清洗3-5 次，最后一次清洗時(shí)，用無菌剪刀將壽螺卵巢組織剪成1_ 3的小組織塊； (8) 將經(jīng)過(7)處理后的組織接種于含有1 -1.5mL細(xì)胞原代培養(yǎng)液的T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶 中； (9) 將培養(yǎng)瓶置于5 %的C02培養(yǎng)箱內(nèi)，28 °C恒溫培養(yǎng)； (10) 過夜后，再加入2mL-3. OmL細(xì)胞傳代培養(yǎng)液，使組織浸沒在培養(yǎng)液中，每隔5-7天吸 出和換入60-70 %量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶； (11) 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，取2_3mL細(xì)胞懸液放入含有l(wèi)-2ml 細(xì)胞傳代培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中，每隔5-7天吸出和換入50 %量的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至擴(kuò)展并增 殖的細(xì)胞充滿培養(yǎng)瓶； 保持整個(gè)操作過程都在無菌條件下進(jìn)行。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞原代培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基 與青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B和動物血清的及飽和苯基硫脲的混合物，pH值為7.0-7.4。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞傳代培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基 與動物血清的混合物，pH值為7.0-7.4。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的動物血清為胎牛血清。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HBSS清洗液為HBSS溶液和青霉素， 鏈霉素以及兩性霉素 B的混合液。6. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素 含量為0.2μg/ml，兩性霉素 B含量為0.5μg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞原代培養(yǎng)液和細(xì)胞傳代培 養(yǎng)液中，動物血清含量為10-20% (體積比）。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的飽和苯基硫脲為高壓滅菌的苯基硫 脲固體過量加入到無菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配制而成。
【文檔編號】C12N5/07GK105861417SQ201610395636
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】劉光富, 張鵬軍, 楊倩倩, 許益鵬, 申屠旭萍
【申請人】中國計(jì)量大學(xué)