專(zhuān)利名稱：辣椒CaWRKY40基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種辣椒CaWRKY40基因及其超表達(dá)載體的構(gòu)建及在基因工程中的應(yīng)用，更具體地涉及到了該辣椒超表達(dá)載體在茄科植物煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物在其生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中不可避免地遭受病蟲(chóng)、極端溫度、干旱等生物和非生物逆境脅迫，在逆境脅迫下被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆反應(yīng)是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中所形成的經(jīng)濟(jì)有效的抗逆機(jī)制，包括關(guān)閉其它抗逆途徑、適當(dāng)減少用于生長(zhǎng)和發(fā)育的物質(zhì)和能量、抗逆反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)使有限的物質(zhì)和能量在逆境脅迫期間盡可能地應(yīng)用到相關(guān)的抗逆反應(yīng)，并使抗逆反應(yīng)強(qiáng)度不至于太大以減少物質(zhì)和能量的浪費(fèi)和對(duì)自身的傷害，這種特定抗逆途徑的啟動(dòng)、另一些抗逆途徑及生長(zhǎng)的關(guān)閉都是通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。因此，信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的剖析是闡明植物抗逆分子機(jī)制的重要途徑。研究表明，Ca2+信使、植物激素(SA、JA、ABA、 乙烯、油菜素內(nèi)酯等)、蛋白磷酸化、激酶、轉(zhuǎn)錄因子等組成了應(yīng)答逆境的各種信號(hào)通路，它們彼此相互作用，構(gòu)成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，最終使細(xì)胞核內(nèi)的基因發(fā)生逆境、細(xì)胞、組織特異性的表達(dá)調(diào)整，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)并提高植物對(duì)逆境抗性。作為整合逆境信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)傳遞進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，其在植物抗逆分子機(jī)制的闡釋及抗逆基因工程中的作用近年來(lái)受到了人們的高度重視，研究表明，WRKY、ATAFU MYB, AP2/ERF、CAERFU AREB, DREB 等參與了植物對(duì)逆境脅迫誘導(dǎo)抗性的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植株中的超表達(dá)可顯著改善植物對(duì)特定逆境的抗性。因此，植物應(yīng)答逆境的轉(zhuǎn)錄因子的分離、功能鑒定及其在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用已經(jīng)成了當(dāng)前國(guó)際生物學(xué)界十分活躍的研究領(lǐng)域。辣椒是一種重要的蔬菜和工業(yè)原料作物，近年其播種面積居在蔬菜中僅次于大白菜居第二位，而其產(chǎn)值則居所有蔬菜之冠。辣椒生產(chǎn)是我國(guó)當(dāng)前種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收的重要選擇然而，辣椒又十分忌連作，是土傳病害較多、發(fā)病較為嚴(yán)重的茄科植物，且對(duì)高溫、高濕敏感(高志奎.辣椒優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)栽培原理與技術(shù)[M].北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002. 19 20.)，培育和推廣應(yīng)用抗病及抗逆的辣椒品種并采取相應(yīng)的栽培管理技術(shù)是解決辣椒病害及逆境危害的根本技術(shù)措施，揭示辣椒等茄科植物抗病及抗逆分子機(jī)制是有效開(kāi)展辣椒抗逆遺傳改良的重要基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)和功能鑒定則不僅有利于揭示辣椒等茄科植物抗病獲抗逆分子機(jī)制，還可為辣椒等作物抗逆遺傳改良提供有應(yīng)用價(jià)值的基因。WKRY是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)74個(gè)成員，水稻含有 100多個(gè)成員，這些WRKY蛋白均含有由1到2個(gè)保守的WRKY功能域，由WRKYGQK序列和調(diào)節(jié)WRKY蛋白與DNA結(jié)合特性的CX4-7 -CX23-28 -HX1_2-(H/C)類(lèi)鋅指域所構(gòu)成。根據(jù)所含WRKY保守域的數(shù)目，WRKY蛋白可分為3種類(lèi)型，它們均可識(shí)別和結(jié)合靶基因啟動(dòng)子上的 W盒(C/T)TGAC(T/C)并一定程度受到其側(cè)翼序列的影響，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。WRKY參與衰老、發(fā)育、休眠以及植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程，迄今大量關(guān)于WRKY功能的研究報(bào)道主要集中在植物對(duì)病原菌、昆蟲(chóng)等生物逆境以及干旱、鹽脅迫、高溫、重金屬脅迫、機(jī)械損傷、UV-B等非生物逆境脅迫應(yīng)答和抗性中的作用。例如，擬南芥WRKY70和WRKY72不僅參與了植物對(duì)病原菌的基礎(chǔ)抗性(PTI)，還參與了 R基因介導(dǎo)的基因?qū)驅(qū)Ｒ恍钥剐?ETI) 水稻0sWRKY03、OsffRKYl3, WRKY45、0sffRKY71等基因超表達(dá)可提高對(duì)病原菌抗性。WRKY家族蛋白調(diào)控生物性狀的機(jī)制十分復(fù)雜，部分成員表現(xiàn)出功能特異性和多樣性，對(duì)同一種性狀起正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)等不同的作用；部分成員中一個(gè)WRKY蛋白可調(diào)節(jié)另一個(gè)WRKY基因的表達(dá)，或若干個(gè)WRKY蛋白協(xié)同作用，構(gòu)成復(fù)雜的WRKY調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)而表現(xiàn)出一定的功能冗余； 部分成員在植物應(yīng)答不同生物逆境、非生物逆境甚至不同的生物逆境和非生物逆境的信號(hào) crosstalk中充當(dāng)重要的節(jié)點(diǎn)，表現(xiàn)出對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答和抗性。由于生物進(jìn)化環(huán)境和途徑的多樣性，不同植物的WRKY家族成員的功能和作用機(jī)制、WRKY信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及在多種應(yīng)答不同逆境的信號(hào)crosstalk中的作用機(jī)制可能都有其特異性。然而，迄今大量有關(guān)WRKY 結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制的研究多數(shù)集中在水稻、擬南芥等少數(shù)模式植物中的部分成員，對(duì)于大多數(shù)植物中WRKY家族的復(fù)雜作用機(jī)制還有待深入研究。本發(fā)明從辣椒UV-B處理下的cDNA文庫(kù)中分離獲得一個(gè)WRKY家族成員的全長(zhǎng) cDNA WaWRKY40),其表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，可與W盒結(jié)合，表現(xiàn)出WRKY蛋白的典型特征。該基因的表達(dá)受到青枯病菌侵染脅迫的誘導(dǎo)(見(jiàn)附圖10)。其在煙草中超表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病的抗性，表明6 / ^ 在植物應(yīng)答青枯病菌信號(hào)傳遞中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)現(xiàn)提供了一種辣椒6 / ^ 基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，將大力促進(jìn)煙草抗青枯病基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。本發(fā)明的辣CaWRKY40基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構(gòu)建方法如下
將辣椒CaWRKY40基因與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合，構(gòu)建成CaWRKY40的超表達(dá)載體。所述的CaMV35S啟動(dòng)子核心序列為CGACCGCAAG
ACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。所述辣椒 CaWRKY40 基因是從 UV-B 輻射辣椒葉片的cDNA文庫(kù)中分離獲得的CaWRKY40基因。構(gòu)建的超表達(dá)載體在茄科植物煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。將所述超表達(dá)載 W^itAgrobacterium tumefaciens EHA105農(nóng)桿菌，采用葉盤(pán)遺傳轉(zhuǎn)化法侵染煙草得到轉(zhuǎn)基因煙草，結(jié)果證明提高了該轉(zhuǎn)基因?qū)煵莸目骨嗫莶⌒浴１景l(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明的辣椒6 / ^ 基因在煙草中的超表達(dá)與野生型煙草相比顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗青枯病能力，該基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為CaWRKY40蛋白保守域分析； 圖2為CaWRKY40推定蛋白的疏水輪廓；
圖3為CaWRKY40在洋蔥表皮上的亞細(xì)胞定位；圖4為pBT 10-GUS質(zhì)粒圖譜； 圖5為CaWRKY40與W盒的瞬間表達(dá)分析； 圖6為CaWRKY40在青枯病侵染下的表達(dá)情況； 圖7為CaWRKY40在轉(zhuǎn)基因煙草中超表達(dá)對(duì)青枯病侵染的抗性。
具體實(shí)施例方式1載體構(gòu)建過(guò)程 1. 1材料
辣椒品種為江西省蓮花縣的地方辣椒品種120#，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；烤煙品種品種由福建農(nóng)林大學(xué)病毒所惠贈(zèng)；UV-B處理的辣椒葉片的cDNA文庫(kù) (UV-B紫外線處理將植株置于離紫外燈(UV-B)下25cm處照射2h.6hU2h.24h和48h， 所有不同處理時(shí)間段處理的植物用液氮進(jìn)行速凍處理后放入一 80°C冰箱保存)為福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(根據(jù)^witrogen公司試劑盒上的說(shuō)明操作)，滴度高達(dá) IXlO7 ； CloneMiner cDNA Library Construction Kit 和 Gateway 載體構(gòu)建試劑盒均購(gòu)自美國(guó)^witrogen公司。B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，PCR相關(guān)dNTP、Taq酶、PCR buffer購(gòu)自大連TaKaRa公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄及 Real-Time PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素等為Sigma公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。1.2 方法
1. 2. 1辣椒CaWRKY40候選基因的分離
以擬南芥的WRKY蛋白的氨基酸序列為探針，搜索獲得辣椒相關(guān)EST，通過(guò)對(duì)辣椒EST進(jìn)行拼接，根據(jù)共有序列來(lái)設(shè)計(jì)、合成特異性引物，引物序列為Pl 5，-GCTCAAGTGATGAAGAGTC-3，；P2 :5，-AATGGTTGGTCCTGAAGG-3，。然后采用基于 PCR 技術(shù)的 96孔板法從cDNA文庫(kù)中篩選cDNA陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果表明，該cDNA陽(yáng)性克隆的長(zhǎng)度為 1431bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1086bp，推測(cè)編碼一個(gè)含361氨基酸(aa)、分子量39. 6 kDa、等電點(diǎn)(pi) 8. 12的蛋白質(zhì)，第168到234氨基酸序列之間是WRKY的保守區(qū)域(見(jiàn)圖1)，C端有一個(gè)C^2鋅指結(jié)構(gòu)，將該cDNA陽(yáng)性克隆命名為CaWRKY40基因。在NCBI網(wǎng)站對(duì)CaWRKY40基因的氨基酸進(jìn)行Bla^p同源序列搜索，可以發(fā)現(xiàn)該基因與其它不同植物已經(jīng)報(bào)道的WRKY基因的氨基酸序列有很大的同源性，與煙草、Nicotiana tabacum)WIZZ 的同源性最高 80%,與西芹 iPetroselinum crispum) transcription factor WRKY4 (gb | AAG35658. 11AF204925J 的同源性為 52%，與葡萄 iyitis aestivalis)\>\itatiYe WRKY4 transcription factor(AAR37421. 1)的同源性為 5396，與大豆〈Glycine WRKY27 (ABC26917. 1)的同源性為 48%，與矮橡樹(shù){Larrea tridentata) WRKY transcription factor 21 (AAW30662. 1)的同源性為 47%。與 CaWRKY40 失系級(jí)近的WRKY蛋白的比對(duì)分析結(jié)果，可以看出保守性主要體現(xiàn)在WRKY結(jié)構(gòu)域。疏水性分析發(fā)現(xiàn) CaWRKY40的C端的少部分區(qū)域和中間大部分區(qū)域的疏水性較強(qiáng)，小部分區(qū)域的親水性較強(qiáng) (圖 2)。1.2.2辣椒CaWRKY40基因超表達(dá)載體構(gòu)建
本發(fā)明應(yīng)用gateway技術(shù)(Walhout et al.，2000)構(gòu)建雙子葉植物轉(zhuǎn)基因用超表達(dá)載體。 首先根據(jù)gateway載體構(gòu)建技術(shù)設(shè)計(jì)并合成內(nèi)側(cè)特異引物WRKY40F 5-AAAAAGCAGGCTTATGGAATTTACCAGTTTGGTTGA-3 ；WRKY40R5-AGAAAGCTGGGTCT
TACCATCTGCCCGTCTGA-3(第一輪)和外側(cè)接頭引物aiiBl 5，_G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T -3，；aiiB2 5，-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT -3，(第二輪)。然后根據(jù)添加aiiB接頭的兩輪PCR擴(kuò)增程序，在6 / ^ 基因兩側(cè)添加attB接頭， 兩輪PCR擴(kuò)增程序程序如下
第一輪為了充分得到添加^iB接頭的PCR產(chǎn)物，在50μ1 PCR反應(yīng)體系中內(nèi)側(cè)特異引物每種最多只能添加10 pmoles，擴(kuò)增參數(shù)為 預(yù)變性 2min 95° C 1 cycle 變性 15 s 94° C 退火 30s 55° C 延伸 1 min 68° C 10 cycles 第二輪轉(zhuǎn)移第一輪PCR產(chǎn)物10 μ 1至含有40pmoles aiiBl和aiiB2外側(cè)接頭引物的40ylPCR混合液中，連續(xù)使用先低溫度退火再高溫特異退火的兩套擴(kuò)增參數(shù)為
預(yù)變性Imin95°C1 cycle變性15 s94°C退火30 s45°C延伸1 min68°C5 cycles變性15 s94°C退火30 s55°C延伸1 min68°C15—20 cycles
瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶質(zhì)量并膠回收純化aiiB-PCR產(chǎn)物。然后通過(guò)BP反應(yīng)體系將目的基因(純化的WiB-PCR產(chǎn)物)克隆到入門(mén)載體 PD0NR207上形成入門(mén)克隆，pD0NR207-R0P,測(cè)序檢測(cè)目的基因序列無(wú)誤后，再通過(guò)LR反應(yīng)體系將目的基因克隆轉(zhuǎn)移到超表達(dá)載體PMDC32，這樣也就將目的基因克隆于Ti質(zhì)粒的 CaMV35S啟動(dòng)子下游，形成含目的基因的超表達(dá)載體，可實(shí)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的超表達(dá)， 最后參照分子克隆指南將含目的基因的超表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，以備用于煙草遺傳轉(zhuǎn)化。BP反應(yīng)體系
PCR products100 ng
30-50 ng 1 μ 1 0. 3 μ 1 5 μ 1
25°C溫浴過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。LR反應(yīng)體系
Entry clone50-100 ng
Destination vector100 ng
Vector (pD0NR207) 5X Buffer BP enzyme mix Add water to totalLR Enzyme mix0. 5 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C溫浴過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。1.2.3辣椒CaWRKY40基因亞細(xì)胞定位
首選合成兩端含有合適酶切位點(diǎn)的CaWRKY40基因的全長(zhǎng)引物，，用EcoRI/ BamHI和 Smal/BamHI這兩對(duì)限制性內(nèi)切酶酶切載體pEGAD，回收大片段連接。同時(shí)以連接在T載體上經(jīng)過(guò)測(cè)序的質(zhì)粒為模板，用引物(WRKWO-GFPF 5-CGGAATTCATGATGGAATTTACCAGTTTGGTT GA-3 EcoRI, WRKY40-GFPR:5-CGGGATCCTTACCATCTGCCCGTCTGA-3 BamHI)擴(kuò)增 6 MXT勸的完整編碼序列，同樣用EcoRI/ BamHI和Smal/BamHI雙酶切后插入到酶切回收的pEGAD載體上，構(gòu)建成融合載體并通過(guò)PCR和酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證。鑒定成功的重組質(zhì)粒用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，導(dǎo)入洋蔥表皮后，將平板放入組培室避光培養(yǎng)M-36 h，使質(zhì)粒編碼的GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)充分表達(dá)。然后將洋蔥表皮置于雙蒸水中浸泡，再用0.45 mol/L甘露醇(用雙蒸水配制)處理1. 5 h，直至細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，隨后在德國(guó)產(chǎn)01 impus熒光顯微鏡上進(jìn)行觀察，觀察條件為藍(lán)色激發(fā)光，并進(jìn)行圖象采集。從結(jié)果中可看出融合蛋白定位于細(xì)胞核中，從熒光顯微鏡下觀察到綠光(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明這個(gè)基因與預(yù)測(cè)的結(jié)果相符，初步說(shuō)明他們具有轉(zhuǎn)錄因子的特征。1. 2. 4 CaWRKY40基因與W盒結(jié)合特性分析
植物中的WRKY蛋白被證實(shí)能與擁有核心序列TGAC或其互補(bǔ)序列GTCA的W盒元件結(jié)合 (Rushton et ah 1996) 0 WRKY蛋白與W盒元件結(jié)合己被許多體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。瞬間表達(dá)分析是是一種較為簡(jiǎn)便的方法，外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)之后，作為一種基因組外的遺傳物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)(降解之前)產(chǎn)生瞬間表達(dá)，并在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)積累表達(dá)產(chǎn)物。 我們?cè)趹?yīng)用Gateway載體構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建報(bào)告載體和效應(yīng)載體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用瞬間表達(dá)分析技術(shù)對(duì)已分離的辣椒WRKY基因進(jìn)行功能的初步鑒定，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。委托上海博亞生物技術(shù)公司合成下列順式作用元件(斜體部分為核心序列)單鏈， 兩端帶有BamHI和)(baI酶切位點(diǎn)粘性末端，使正反鏈退火合成的雙鏈兩側(cè)分別帶有BamHI 和)(bal兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)粘性末端。正義鏈5-GATCCTTATTCAGCCATCAAAAGT7i^O:AATA ATTTATTCAGCCATCAAAAGT7^CCAATAATT-3 ；反義鏈3-GAATAAGTCGGTAGTTTTCMC7^GT
TATTAAATAAGTCGGTAGTTTTCM^GTTATTAAGATC-5,
將等量的單鏈寡核苷酸溶解在50mM的NaCl溶液中，置于70°C 5min后，自然冷卻到室溫(30min)即可將單鏈合成雙鏈DNA。提取ρΒΤΙΟ-GUS質(zhì)粒(圖4)，并用BamHI和)(baI兩個(gè)限制性酶進(jìn)行酶切，將酶切回收的大片段與2W盒順式作用元件的核苷酸雙鏈DNA用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物即PBT10-2W-GUS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5ci，根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物A1A2 正義鏈 5' AGCGAGGAAGCGGAAGAGC3 ‘，反義鏈5' GGACACCCGTAAGTCAGAC3 ‘，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度約為 300bp，篩選陽(yáng)性單克隆并經(jīng)此引物PCR以及測(cè)序鑒定。1.2.5效應(yīng)載體的構(gòu)建(見(jiàn)1.2. 2) 1. 2. 6 瞬間表達(dá)
質(zhì)粒構(gòu)建完成后用基因槍(Bio-Rad PDS-1000/He)轟擊洋蔥鱗片內(nèi)表皮細(xì)胞，驗(yàn)證質(zhì)粒的功能，設(shè)置PBT10-2W-GUS單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為陰性對(duì)照。過(guò)程包括(1)樣品制備將Iug/ ul 質(zhì)粒 DNA 各 1 μ 1 與 25 μ 1 鎢粉(1. 6 μ m，60mg/ml)、25 μ 1 2. 5mol/L CaCl2 禾口 10 μ 1 0. lmol/L亞精胺在振蕩器上混勻，經(jīng)70%和無(wú)水乙醇充分脫水洗滌以后，懸浮于50 μ 1無(wú)水乙醇，取10μ 1滴加在載物膜上。( 轉(zhuǎn)化條件為樣品室真空度27Pa，壓力llOOpsi，樣品距載物膜距離為25cm。轟擊后于黑暗濕潤(rùn)的環(huán)境下，室溫培養(yǎng)Mh。X-Gluc染色后在顯微鏡下觀察并拍照。采用瞬間表達(dá)實(shí)驗(yàn)的方法證實(shí)了 6 / ^ 陽(yáng)性克隆可與順式元件結(jié)合(見(jiàn)圖5)， 激活它所驅(qū)動(dòng)的⑶S在洋蔥上表皮中表達(dá)，說(shuō)明該基因是一個(gè)辣椒WRKY蛋白的編碼基因。2煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得與抗青枯病分析 2. 1煙草遺傳轉(zhuǎn)化及Tl代轉(zhuǎn)基因種子的收獲
采用葉盤(pán)遺傳轉(zhuǎn)化法(徐剛標(biāo)等，2007 ；植物基因工程(第二版))，利用1.2.2中所構(gòu)建的含目的基因的超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，侵染2個(gè)月的無(wú)菌野生型煙草1(3 小苗的葉盤(pán) (0. 5cmX0. 5cm)。在含卡那霉素(100 mg/L)的MS培養(yǎng)基上篩選抗性小苗，并對(duì)抗性小苗的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定卡那霉素篩選的可靠性。獲得15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。所有的株系均用套袋自交收獲Tl代轉(zhuǎn)基因種子。利用T2代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草表型分析與功能鑒定。參與植物抗青枯病菌的調(diào)控
本發(fā)明分析了 CaWRKY40在植物對(duì)青枯菌侵染脅迫中的可能作用，將收獲的T2代轉(zhuǎn)基因種子及野生型成熟種子分別種子無(wú)菌水浸泡Mh，75%酒精30s，10%過(guò)氧化氫 IOmin,無(wú)菌水清洗5-6次，播種MS培養(yǎng)上，十五天后，移栽于育苗盤(pán)，一個(gè)月后選取大小一致的苗移栽于小花盆中培養(yǎng)9周后，對(duì)煙草種子進(jìn)行青枯菌(取自福清地方辣椒青枯病菌， 現(xiàn)保存于福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)灌根處理，處理30后野生型煙草出現(xiàn)整株萎蔫甚至死亡，而6 / ^ 超表達(dá)煙草植株則正常生長(zhǎng)(圖6)，這說(shuō)明辣椒6 / ^ 超表達(dá)煙草植株相對(duì)于野生型對(duì)照表現(xiàn)出對(duì)青枯病菌侵染的明顯抗性。以上試驗(yàn)至少重復(fù)三次， 均有同一趨勢(shì)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 / ^ 轉(zhuǎn)基因煙草突變體對(duì)青枯病菌明顯強(qiáng)于野生型對(duì)照(圖7，青枯菌灌根后30d)，說(shuō)明CaWRKY40參與了植物對(duì)青枯病菌的抗性調(diào)節(jié)。3 結(jié)果
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)辣椒6 / ^ 可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病菌侵染的抗性，該基因在植物抗青枯病基因工程上具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1. 一個(gè)辣椒基因，其特征在于所述辣椒基因命名為fer^r勸基因，從UV - B處理的辣椒葉片的cDNA文庫(kù)分離獲得，該基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利1要求所述基因的超表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于將辣椒 CaWRKY40基因與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合，構(gòu)建成CaWRKY40的超表達(dá)載體。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的基因或由權(quán)利要求2所述的方法構(gòu)建的超表達(dá)載體在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種辣椒CaWRKY40基因在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，所述辣椒基因命名為CaWRKY40基因，從UV–B處理的辣椒葉片的cDNA文庫(kù)分離獲得，該基因至少含有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述的基因或由其構(gòu)建的超表達(dá)載體在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明的辣椒CaWRKY40基因在煙草中的超表達(dá)與野生型煙草相比顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗青枯病能力，該基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102260684SQ20111017704
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者何水林, 黨峰峰, 劉志欽, 官德義, 王育娜 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)