專利名稱：一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗煙草青枯病的菌劑，具體地說是一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，屬于生物菌劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草青枯病是一種細(xì)菌病害，在各煙區(qū)普遍發(fā)生，常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。該病病源青枯雷爾氏菌和青枯假單胞桿菌，能侵染30余科的200多種植物。對(duì)煙草、 番茄、花生及馬鈴薯侵害更明顯。常與黑脛病等根莖病害混合發(fā)生，危害更嚴(yán)重。枯草芽孢桿菌(feciBm subtiHs)廣泛存在于自然界中，該菌作為植物病害生物防治細(xì)菌之一，由于該菌能產(chǎn)生耐熱的芽孢，即易于生產(chǎn)、菌劑的加工，又易于存活、定植和繁殖。批量生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本也較低，施用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，而且其菌劑的穩(wěn)定性與化學(xué)農(nóng)藥的相容性、以及與不同植物不同年份防治效果的一致性方面均優(yōu)于不產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌和真菌，是一種較理想的生防微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供了一種對(duì)煙草青枯病害具有高效、無毒、安全以及對(duì)環(huán)境無污染的微生物枯草芽孢菌劑的制備方法。在芽孢桿菌發(fā)酵后期，通過合理調(diào)節(jié)發(fā)酵生產(chǎn)參數(shù)的控制、添加調(diào)配功能性的有機(jī)氮源，促使芽孢桿菌在后期代謝性生長(zhǎng)，產(chǎn)生堿性蛋白的代謝，再通過調(diào)整發(fā)酵工藝控制參數(shù)，促使菌體形成芽孢，當(dāng)菌體芽孢形成率達(dá)到陽 65%以上時(shí)，不再做發(fā)酵液pH的調(diào)整，讓其自然變化，當(dāng)發(fā)酵液菌體形成芽孢率在85%以上，最終發(fā)酵液pH值自然提高至 7. 7 8.0時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟
1、菌種活化對(duì)保藏的枯草芽孢桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化所用的培養(yǎng)基配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；用于枯草芽孢桿菌的活化及活菌數(shù)的測(cè)定；
2、搖床擴(kuò)大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)。 初始PH值為7. 0 7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，至15 20%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml。3、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內(nèi)，初期通風(fēng)比1 0. 25，即一立方發(fā)酵液一分鐘通氣量為0.25立方， 后期通風(fēng)比1 1 ；同時(shí)，控制發(fā)酵液的PH值為6. 9 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為80 220 rpm ；至芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；
及時(shí)進(jìn)行對(duì)種子發(fā)酵液的檢查和對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)狀況的觀測(cè)；菌種接種后1 菌體生長(zhǎng)處于指數(shù)生長(zhǎng)中期；當(dāng)芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期，進(jìn)行無菌轉(zhuǎn)種接入發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml。4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進(jìn)行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)方法為對(duì)接入種子液的發(fā)酵罐，溫度觀 32°C，pH6.9 7. 3，通風(fēng)量1 0. 25 1. 1，攪拌轉(zhuǎn)速150 180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 35 0. 6%、總氮含量30 45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55 65%，進(jìn)入發(fā)酵后期；
發(fā)酵罐前期培養(yǎng)期間要及時(shí)檢查和觀測(cè)菌種生長(zhǎng)狀況，隨著菌種的增長(zhǎng)，菌體密度的增加，逐漸加大通風(fēng)量，增加溶氧，提高轉(zhuǎn)速，以配合菌種生長(zhǎng)的需氧量，同時(shí)，通過與發(fā)酵罐相連的無菌補(bǔ)液罐來維持發(fā)酵液PH值；
(2)發(fā)酵罐后期培養(yǎng)方法為不再調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機(jī)氮源調(diào)節(jié)發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期發(fā)酵結(jié)束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機(jī)氮源的制備方法為將花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉按照重量比為1 :1:1:1:1: 1的比例混合，調(diào)制成重量分?jǐn)?shù)為9% 16%的混合溶液，加入到反應(yīng)釜內(nèi)；然后在反應(yīng)釜內(nèi)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的 PH為6. 0，來進(jìn)行消化水解，同時(shí)保持溫度120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液； 向水解液中加入重量分?jǐn)?shù)為15%的玉米漿和重量比為1 :1:1:1: 1的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分?jǐn)?shù)16% 18%的有機(jī)氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質(zhì)量比為1 1 1。5、菌劑的制備
發(fā)酵結(jié)束后，降低發(fā)酵通風(fēng)比至1 0.08，維持發(fā)酵罐壓力0.02MPa，降低攪拌轉(zhuǎn)速至 20rpm，對(duì)發(fā)酵液降溫至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5 1/8。添加濃縮液體積量的 0. 07%調(diào)配緩沖保護(hù)劑(磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉混合而成的pH8. 0的溶液)，混合均勻后， 對(duì)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥處理，得到菌劑產(chǎn)品。所述的噴霧干燥方法為對(duì)干燥塔、旋風(fēng)分離器進(jìn)行30分鐘的120°C的熱風(fēng)滅菌， 然后降低熱風(fēng)溫度至80°C，依次開啟引風(fēng)機(jī)、鼓風(fēng)機(jī)、加熱器、進(jìn)料泵、閉風(fēng)器，調(diào)整物料流量至150 180Kg/h、通風(fēng)量至5000 8000m3/h，開啟隔膜泵泵入調(diào)配好的發(fā)酵液，進(jìn)行產(chǎn)品的噴霧干燥，得到成品菌劑，菌粉質(zhì)量指標(biāo)為水分小于3. 5%，每克菌數(shù)大于2000億，菌體芽孢形成率大于85% ；芽孢大量出現(xiàn)的時(shí)間均在發(fā)酵菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和以后的一段時(shí)間，在偏堿環(huán)境中有利于芽孢的形成。發(fā)酵過程分的四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期一延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、發(fā)酵前期和發(fā)酵后期；延遲期約為2 3h，發(fā)酵9小時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期，菌體生長(zhǎng)非常的迅速，菌體數(shù)量增長(zhǎng)很快，發(fā)酵13小時(shí)有10%的芽孢形成。在不調(diào)節(jié)pH值得情況下，在發(fā)酵的前11個(gè)小時(shí) PH值一直在下降，從7. 2下降至6. 0 ；發(fā)酵13小時(shí)后，菌種開始逐漸分泌堿性蛋白抗生素， PH開始逐漸上升，最終達(dá)到7. 7以上。在這過程中，通過后期補(bǔ)加有機(jī)氮源，使得菌體形成代謝性生長(zhǎng)，堿性蛋白抗生素提高了 30ng/ml以上，同時(shí)利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。與現(xiàn)有的方法相比本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)是除了得到形成芽孢的休眠菌體，還得到提高了 30ng/ml以上的堿性蛋白抗生素，同時(shí)，提高了菌體芽孢形成率達(dá)85%以上。本發(fā)明菌劑的使用方法和使用量如下
1、制成菌體濃度約2000萬個(gè)/ mL的菌液，約為一克菌粉配制成1升菌液。2、對(duì)田間發(fā)病煙草根部位、外表面均勻噴施抗菌菌液；或者煙苗移植過程中，對(duì)煙苗根部噴施，菌體濃度約2000萬個(gè)/ mL,噴施量5ml/株，這樣用量更少，效果更好。3、每畝煙草使用量650克左右。本發(fā)明菌劑的防病、治療效果如下 一、防治效果
1、煙苗移種根部處理
(1)對(duì)移種煙苗根部處理，生長(zhǎng)三周后，煙苗病發(fā)現(xiàn)象為0. 09%。(2)未作處理煙苗發(fā)病率7. 1%。2、移苗前，沒做噴施處理，移苗后，對(duì)田間煙草噴施處理和未作噴施處理對(duì)比 (1)對(duì)田間煙草噴做施處理，煙草發(fā)病率為0.36%。(2)未作處理煙苗發(fā)病率7. 1%。從以上結(jié)果可以看出對(duì)田間煙草噴未做噴施處理的發(fā)病率是做過噴施處理的20 倍左右，該菌劑防治效果良好。二、治療效果
發(fā)病煙草菌劑噴施處理對(duì)出現(xiàn)的發(fā)病病株，進(jìn)行菌體濃度約3000萬個(gè)/ mL的菌液對(duì)發(fā)病菌株的根部、病株表面噴施，噴施量每株50ml左右；空白對(duì)照對(duì)發(fā)病菌株僅僅噴施水。結(jié)果對(duì)于噴施水的煙葉，3天后，枯萎率達(dá)49%，6天后94%枯萎。經(jīng)菌液處理的病株，在3天后，91 %的病株發(fā)病狀況得到初步控制，6天后87%發(fā)病株得到好轉(zhuǎn)，隨后繼續(xù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了較好的治療效果。說明經(jīng)過本發(fā)明的菌液處理后，能有較好治療效果，減少煙農(nóng)的損失。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于在菌體發(fā)酵的這過程中，通過后期補(bǔ)加有機(jī)氮源，使得菌體形成代謝性生長(zhǎng)，提高堿性蛋白抗生素的產(chǎn)生，同時(shí)利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴(kuò)大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 0，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，至15%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內(nèi)，初期通風(fēng)比量1 0. 25，后期通風(fēng)比1 1 ；同時(shí)，控制發(fā)酵液的pH值為6. 9，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為SOrpm ；至芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進(jìn)行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對(duì)接入種子液的發(fā)酵罐，溫度^°C，pH6.9，通風(fēng)量1 0. 25，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 35%、總氮含量30ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55%，進(jìn)入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機(jī)氮源補(bǔ)充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結(jié)束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機(jī)氮源的制備方法為將等質(zhì)量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調(diào)制成重量分?jǐn)?shù)為9% 16%的混合溶液，加入到反應(yīng)釜內(nèi)；然后在反應(yīng)釜內(nèi)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進(jìn)行消化水解，同時(shí)保持溫度120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分?jǐn)?shù)為15%的玉米漿和等質(zhì)量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分?jǐn)?shù)16% 18%的有機(jī)氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質(zhì)量比為1 1 1 ；
5、菌劑的制備
發(fā)酵結(jié)束后，降低發(fā)酵通風(fēng)比至1 0.08，維持發(fā)酵罐正壓0.02MPa，降低攪拌轉(zhuǎn)速至 20rpm，對(duì)發(fā)酵液降溫至至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5。添加濃縮液體積量的0. 07%調(diào)配緩沖保護(hù)劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對(duì)濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；所述的噴霧干燥方法為對(duì)干燥塔、旋風(fēng)分離器進(jìn)行30分鐘的120°C的熱風(fēng)滅菌，然后降低熱風(fēng)溫度至80°C，依次開啟引風(fēng)機(jī)、鼓風(fēng)機(jī)、加熱器、進(jìn)料泵、閉風(fēng)器，調(diào)整物料流量 150Kg/小時(shí)、通風(fēng)量5000m3/小時(shí)，開啟隔膜泵泵入調(diào)配好的發(fā)酵液，進(jìn)行產(chǎn)品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。
實(shí)施例2
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴(kuò)大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 1，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，至18%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內(nèi)，初期通風(fēng)比量1 0. 25，后期通風(fēng)比1 1 ；同時(shí)，控制發(fā)酵液的pH值為 7. 1，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 rpm ；至芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進(jìn)行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對(duì)接入種子液的發(fā)酵罐，溫度30°C，pH7.1，通風(fēng)量1 0.7，攪拌轉(zhuǎn)速165 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 5%、總氮含量38ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率60%，進(jìn)入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機(jī)氮源補(bǔ)充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結(jié)束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機(jī)氮源的制備方法為將等質(zhì)量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調(diào)制成重量分?jǐn)?shù)為13%的混合溶液，加入到反應(yīng)釜內(nèi)；然后在反應(yīng)釜內(nèi)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進(jìn)行消化水解，同時(shí)保持溫度120°C、 壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分?jǐn)?shù)為15%的玉米漿和由等質(zhì)量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分?jǐn)?shù)17%的有機(jī)氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質(zhì)量比為1 1 1 ；
5、菌劑的制備
發(fā)酵結(jié)束后，降低發(fā)酵通風(fēng)比至1 0. 08，維持發(fā)酵罐正壓0. 02MPa,降低攪拌轉(zhuǎn)速至 20rpm，對(duì)發(fā)酵液降溫至至10°C以下；通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/6。添加濃縮液體積量的0. 07%調(diào)配緩沖保護(hù)劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對(duì)濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；
所述的噴霧干燥方法為對(duì)干燥塔、旋風(fēng)分離器進(jìn)行30分鐘的120°C的熱風(fēng)滅菌，然后降低熱風(fēng)溫度至80°C，依次開啟引風(fēng)機(jī)、鼓風(fēng)機(jī)、加熱器、進(jìn)料泵、閉風(fēng)器，調(diào)整物料流量 16^(g/小時(shí)、通風(fēng)量6500m3/小時(shí)，開啟隔膜泵泵入調(diào)配好的發(fā)酵液，進(jìn)行產(chǎn)品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。
實(shí)施例3
一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑，其制備方法包括以下步驟
1、菌種活化對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買的斜面保藏的枯草芽孢桿菌B908活化培養(yǎng)至芽孢脫落；
活化培養(yǎng)基(NA)配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至IOOOml ；
2、搖床擴(kuò)大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，至20%的芽孢脫落為止；
所用的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. Ig,魚粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內(nèi)，初期通風(fēng)比量1 0. 25，后期通風(fēng)比1 1 ；同時(shí)，控制發(fā)酵液的pH值為 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為220 rpm ；至芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；
所用的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、發(fā)酵罐發(fā)酵
將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進(jìn)行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；
(1)發(fā)酵罐前期培養(yǎng)對(duì)接入種子液的發(fā)酵罐，溫度32°C，pH7.3，通風(fēng)量1 1.1，攪拌轉(zhuǎn)速180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量0. 6%、總氮含量45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率65%，進(jìn)入發(fā)酵后期；
(2)發(fā)酵后期培養(yǎng)不再調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使用有機(jī)氮源補(bǔ)充發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至綜合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，發(fā)酵結(jié)束；
所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig,魚粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有機(jī)氮源的制備方法為將等質(zhì)量的花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉混合，調(diào)制成重量分?jǐn)?shù)為16%的混合溶液，加入到反應(yīng)釜內(nèi)；然后在反應(yīng)釜內(nèi)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的pH為6. 0，來進(jìn)行消化水解，同時(shí)保持溫度 120°C、壓力0. IMPa，水解25分鐘，提取水解液；向水解液中加入重量分?jǐn)?shù)為15%的玉米漿和由等質(zhì)量的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分?jǐn)?shù)18%的有機(jī)氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質(zhì)量比為 1:1:1;5、菌劑的制備
發(fā)酵結(jié)束后，降低發(fā)酵通風(fēng)比至1 0. 08，維持發(fā)酵罐正壓0. 02MPa,降低攪拌轉(zhuǎn)速至 20rpm，對(duì)發(fā)酵液降溫至至10°C以下；
通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/8。添加濃縮液體積量的0. 07%調(diào)配緩沖保護(hù)劑(即磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，對(duì)濃縮后的發(fā)行噴霧干燥處理；
所述的噴霧干燥方法為對(duì)干燥塔、旋風(fēng)分離器進(jìn)行30分鐘的120°C的熱風(fēng)滅菌，然后降低熱風(fēng)溫度至80°C，依次開啟引風(fēng)機(jī)、鼓風(fēng)機(jī)、加熱器、進(jìn)料泵、閉風(fēng)器，調(diào)整物料流量 ISOKg/小時(shí)、通風(fēng)量8000m3/小時(shí)，開啟隔膜泵泵入調(diào)配好的發(fā)酵液，進(jìn)行產(chǎn)品的噴霧干燥， 得到成品菌劑。 最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于由以下方法制備而成(1)菌種活化對(duì)保藏的枯草芽孢桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)至芽孢脫落；(2)搖床擴(kuò)大培養(yǎng)將活化后的枯草芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)， 初始PH值為7. 0 7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，至15 20%的芽孢脫落為止；(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)在無菌操作下，將搖床擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌液接入到含有種子罐培養(yǎng)基的種子罐內(nèi)，初期通風(fēng)比1 0.25，后期通風(fēng)比1 1 ；同時(shí)，控制發(fā)酵液的pH值為 6. 9 7. 3，溫度為32°C，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為80 220 rpm ；至芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子罐菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，罐裝量為發(fā)酵罐容積的70%，進(jìn)行發(fā)酵罐的前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)；(5)菌劑的制備發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)束后，降低發(fā)酵通風(fēng)比至1 0.08，維持發(fā)酵罐壓力 0. 02MPa,降低攪拌轉(zhuǎn)速至20rpm，對(duì)發(fā)酵液降溫至10°C以下；然后通過膜過濾濃縮處理，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/5 1/8 ；再添加調(diào)配緩沖保護(hù)劑，混合均勻后，對(duì)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥處理，得到菌劑產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)活化所用的培養(yǎng)基配方為牛肉胨3g，蛋白胨5g，瓊脂16g，水定容至 1000ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)的液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉6.5g，葡萄糖2. 5g，豆餅粉10. lg，魚粉 2. 5g, CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至500ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)的種子罐培養(yǎng)基配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. lg，魚粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 IOOOml0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆餅粉20. Ig, 魚粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至1000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐前期培養(yǎng)方法為對(duì)接入種子液的發(fā)酵罐，溫度觀 32°C， !16.9 7.3，通風(fēng)量1 0. 25 1. 1，攪拌轉(zhuǎn)速150 180 rpm ；保持發(fā)酵液總糖含量 0. 35 0. 6%、總氮含量30 45ng/ml，培養(yǎng)至芽孢形成率55 65%，進(jìn)入發(fā)酵后期。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的發(fā)酵罐后期培養(yǎng)方法為使用有機(jī)氮源調(diào)節(jié)發(fā)酵液的總氮含量，控制總氮含量在40ng/ml以上，培養(yǎng)至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期發(fā)酵結(jié)束。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)的有機(jī)氮源的制備方法為將花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、酵母粉、蠶蛹粉、魚粉按照重量比為1 :1:1:1:1: 1的比例混合，調(diào)制成重量分?jǐn)?shù)為 9% 16%的混合溶液，加入到反應(yīng)釜內(nèi)；然后在反應(yīng)釜內(nèi)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 10%的鹽酸控制溶液的PH為6. 0，來進(jìn)行消化水解，同時(shí)保持溫度120°C、壓力0. IMPa,水解25分鐘， 提取水解液；向水解液中加入重量分?jǐn)?shù)為15%的玉米漿和重量比為1 1 1 1 1的纈氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸組成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量為重量分?jǐn)?shù) 16% 18%的有機(jī)氮源，比例為水解液、玉米漿和混合氨基酸溶液的混合質(zhì)量比為1 1 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的噴霧干燥方法為對(duì)干燥塔、旋風(fēng)分離器進(jìn)行30分鐘的120°C的熱風(fēng)滅菌，然后降低熱風(fēng)溫度至80°C，依次開啟引風(fēng)機(jī)、鼓風(fēng)機(jī)、加熱器、進(jìn)料泵、閉風(fēng)器，調(diào)整物料流量至150 180Kg/h、通風(fēng)量至5000 8000m3/h，開啟隔膜泵泵入調(diào)配好的發(fā)酵液， 進(jìn)行產(chǎn)品的噴霧干燥，得到成品菌劑，菌粉質(zhì)量指標(biāo)為水分小于3. 5%，每克菌數(shù)大于2000 億個(gè)，菌體芽孢形成率大于85%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的調(diào)配緩沖保護(hù)劑為由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉混合而成的PH8. 0的溶液， 添加量為濃縮液體積量的0. 07%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括菌種活化、搖床擴(kuò)大培養(yǎng)、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵和菌劑的制備等步驟制備而成；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于在菌體發(fā)酵的這過程中，通過后期補(bǔ)加有機(jī)氮源，使得菌體形成代謝性生長(zhǎng)，提高堿性蛋白抗生素的產(chǎn)生，同時(shí)利于芽孢的正常生成，最終獲得一種高效抗煙草青枯病的枯草芽孢菌劑。
文檔編號(hào)A01P1/00GK102258059SQ201110195718
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者史蘭東, 呂玉成, 薛明政 申請(qǐng)人:山東玉成生化農(nóng)藥有限公司