一種防治煙草青枯病的生防放線菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種防治煙草青枯病的生防放線菌菌株及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌（Wsioflia 侵染引起的一種在世 界范圍內(nèi)廣泛傳播的土傳病害。該病菌株系復(fù)雜、寄主范圍廣、極易爆發(fā)流行，防治難度較 大。煙草青枯病在我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)普遍發(fā)生，尤以福建、廣東、湖南、貴州等煙區(qū) 危害較重，重病田塊發(fā)病率高達(dá)90%以上，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損 失。
[0003] 目前，在生產(chǎn)中主要通過(guò)栽培抗病品種、改善耕作制度和采用化學(xué)防治等措施來(lái) 防治煙草青枯病。但培育抗病品種周期長(zhǎng)，且易受環(huán)境影響，防治效果不理想。改善耕作制 度，采用輪作是目前對(duì)抗該病的有效措施，但是在實(shí)際生產(chǎn)中很難實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)藥劑雖在一定 程度上可減輕該病的危害，但是防治效果不高，且長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的環(huán)境污染、農(nóng)藥 殘留、病菌抗藥性不斷增強(qiáng)等問(wèn)題日益突出。因此尋找一種有效、安全的防治措施是當(dāng)務(wù)之 急。生物防治具有無(wú)毒、無(wú)殘留、可利用資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，已成為解決土傳病害的有效途徑。 其中，利用拮抗微生物防治植物病害已成為生物防治中的重要方向。迄今為止，篩選出的生 防菌主要有假單胞菌、芽孢桿菌、菌根真菌及少數(shù)放線菌。但總體來(lái)說(shuō)，我國(guó)利用拮抗菌株 防治煙草青枯病的研究基礎(chǔ)還相對(duì)薄弱，特別是高效菌種明顯匱乏。
[0004] 放線菌（Actinomycetes)是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值的微生物，種類(lèi)豐 富，廣泛分布于自然界中。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的約8000種生物活性物質(zhì)當(dāng)中，近70%是 由放線菌產(chǎn)生，特別是鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，如中生菌素、阿維菌素 等。土壤拮抗放線菌具有對(duì)環(huán)境友好、效果持久、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。 因此從煙田根圍土壤分離獲得對(duì)煙草青枯病菌具有拮抗作用的放線菌，對(duì)該病害的防治具 有重要意義，符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于：針對(duì)煙草青枯病病發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，化學(xué)防治效果不理想， 同時(shí)帶來(lái)環(huán)境污染的實(shí)際情況，提供一種高效防治煙草青枯病的生防放線菌菌株及其應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明首先提供了一種生防放線菌菌株，所述的菌株為鏈霉菌5/7.) Κ4,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2014年3月24 日，保藏號(hào)為CGMCC NO. 8949。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述的生防放線菌菌株在制備生防菌劑中的應(yīng)用。
[0008] 所述生防菌劑的制備方法如下：所述生防菌劑的制備方法如下：將所述的鏈霉菌 (5/7. )K4接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 °C，180 r/min，培養(yǎng)2_3d后，制 成種子液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中；發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2%、 NaCl 0. 3%、CaC03 0. 2%，發(fā)酵條件為：接種量10% V /V、裝瓶量60mL /250mL、發(fā)酵培養(yǎng)基初 始pH值8. 0、28 °C，180-200 r/min，培養(yǎng)5-6 d，制成濃度為108CFU/ml的K4菌株發(fā)酵液， 作為生防菌劑。
[0009] 以及，所述的生防放線菌菌株在煙草青枯病生物防治中的應(yīng)用。具體應(yīng)用為：所述 生防菌劑在煙苗移栽時(shí)隨定根水使用；或者在煙苗移栽4-5天后灌根使用；或者與有機(jī)肥 混合制成菌肥使用。
[0010] 灌根使用時(shí)，每株50ml，連續(xù)使用2-3次，每次間隔8-12天。
[0011] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明篩選出的生防放線菌K4能夠明顯抑制煙草青枯病菌的生長(zhǎng)。由于是生物制劑， 因此沒(méi)有化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來(lái)的一系列問(wèn)題，對(duì)減少農(nóng)業(yè)污染具有重要的作用，而且有利 于煙葉的綠色生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明菌株分離自煙草根圍土壤，與土壤生態(tài)和諧相容，有利于充分發(fā)揮菌株的 優(yōu)勢(shì)。
[0013] 盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，該生防菌對(duì)煙草青枯病的防治效果顯著，高達(dá)82. 91%。同時(shí)， 該菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為菌株K4氣生菌絲和孢子絲形態(tài)(光學(xué)顯微鏡下40X )。
[0015] 圖2為菌株K4孢子形態(tài)（電子顯微鏡7000X )。
[0016] 圖3為菌株K4依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0017]圖4為菌株K4發(fā)酵液對(duì)煙草青枯病菌的平板抑菌效果圖。其中，1為優(yōu)化之前的 抑菌效果，2和3為優(yōu)化之后的抑菌效果。
[0018] 圖5為菌株K4對(duì)煙草青枯病的溫室盆栽控病作用。其中，左邊為施用K4發(fā)酵液， 右邊為清水對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但并不 是對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0020] -株生防放線菌，菌種命名為K4,分類(lèi)命名：鏈霉菌5/7.)，其保藏 編號(hào)：CGMCC No. 8949,保藏日期：2014年3月24日，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0021] 實(shí)施例一拮抗放線菌的篩選 具體過(guò)程如下： 1、土壤樣品的采集 從福建省政和縣采集不同煙田地塊5-20cm深處的根圍土壤，共4份，分裝標(biāo)記后帶回 實(shí)驗(yàn)室，待自然風(fēng)干后分離。
[0022] 2、放線菌的分離 采用平板稀釋法進(jìn)行分離。稱(chēng)取土壤樣品l〇g，倒入裝有小玻璃珠和90ml無(wú)菌水的三 角瓶中，震蕩30min后靜置5分鐘，依次稀釋10倍，分別配制成10'10'10'10'KT6的 懸浮液，吸取不同濃度的懸浮液各〇. Iml加到高氏一號(hào)培養(yǎng)基(加入終濃度為50mg /L的 K2GrO7)平板上，均勻涂布后置于28°C培養(yǎng)觀察，5-7天后挑取不同的單菌落劃線純化。將純 化后的菌株轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4°C保存?zhèn)溆茫卜蛛x得到126株放線菌。
[0023] 3、拮抗放線菌的篩選 采用瓊脂塊法對(duì)分離得到的放線菌進(jìn)行抑菌活性的初篩。將放線菌接種于高氏一號(hào)培 養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后，用滅過(guò)菌的直徑6 _的打孔器打出若干菌餅，挑取一塊放入PDA平板中 央，于28 °C培養(yǎng)4 d后，倒入含煙草青枯病菌（108CFU/ml )的NA培養(yǎng)基10mL，待凝固后 置于28 °C，2d后記錄抑菌圈的大小和有無(wú)，重復(fù)3次。經(jīng)初篩發(fā)現(xiàn)有15株放線菌對(duì)煙草 青枯病菌具有不同程度的抑制作用(表1)，其中菌株Ρ1〇、Ρ12、Κ2、Κ4、Κ13和K24對(duì)煙草青 枯病菌的抑菌圈直徑都在30mm以上。
[0024] 表1 15株放線菌對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生防放線菌菌株，其特征在于，所述的菌株為鏈霉菌（5/7. )K4,已 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2014年3月24日，保 藏號(hào)為 CGMCC NO. 8949。
2. 如權(quán)利要求1所述的生防放線菌菌株在制備生防菌劑中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述生防菌劑的制備方法如下：將所述的 鏈霉菌（5/7. )K4接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 °C，180 r/min，培養(yǎng)2_3d 后，制成種子液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中；發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：淀粉2%、葡萄糖I. 5%、黃豆粉 2%、NaCl 0.3%、CaC03 0.2%，發(fā)酵條件為：接種量10% V /v、裝瓶量60mL /250mL、發(fā)酵培養(yǎng) 基初始pH值8. 0、28 °C，180-200 r/min，培養(yǎng)5-6 d，制成濃度為108CFU/ml的K4菌株發(fā) 酵液，作為生防菌劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的生防放線菌菌株在煙草青枯病生物防治中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生防菌劑在煙苗移栽時(shí)隨定根水使 用；或者在煙苗移栽4-5天后灌根使用；或者與有機(jī)肥混合制成菌肥使用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種防治煙草青枯病的放線菌菌株及其應(yīng)用方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的菌株為鏈霉菌（<i>Streptomyces？sp.</i>）K4，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2014年3月24日，保藏號(hào)為CGMCC？NO.8949。該菌株通過(guò)產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制煙草青枯病菌的生長(zhǎng)，對(duì)煙草青枯病表現(xiàn)出較好的防治效果。所述的生防放線菌菌株用于制備生防菌劑，應(yīng)用時(shí)可以在煙苗移栽時(shí)隨定根水使用；或者移栽4-5天后灌根使用。該菌劑也可與有機(jī)肥混合制成菌肥使用。所述菌株K4是從煙田根圍土壤中獲得，與土壤生態(tài)和諧相容，因此在煙草青枯病的生物防治中具有良好的應(yīng)用前景。CGMCC No. 89492014.03.24
【IPC分類(lèi)】A01N63-00, C12N1-20, A01P1-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104560827
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510010789
【發(fā)明人】謝世勇, 丁雪玲, 謝廷鑫, 陳志厚, 林勇, 黃建成, 陳慶河, 李本金
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日