一種煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用，煙草青枯病分子檢測引物由上下游內(nèi)引物、上下游外引物和環(huán)引物組成，檢測方法是以提取的疑似感病煙草總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的分子檢測引物進行環(huán)式等溫擴增，反應結(jié)束后，根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色判定結(jié)果，所述的分子檢測引物用于制備煙草青枯病病原菌檢測用試劑盒，可以快速準確地完成煙草青枯菌的檢測。
【專利說明】一種煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治領(lǐng)域，具體涉及一種煙草青枯病病菌分子檢測引物、檢測方法及應用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草青枯病的病原為爺科勞爾氏菌Ofe/siofliaso/aaacea/--入桿狀,無莢膜,革蘭氏染色陰性。這種病原菌寄主范圍超過200個種，包括了許多重要的經(jīng)濟作物，如番茄、馬鈴薯、煙草。因此，快速的早期診斷對于控制青枯病的發(fā)生蔓延以及重大損失的發(fā)生具有
重要意義。
[0003]隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學數(shù)據(jù)的積累，多個Ralstoniasolanacearum菌株的基因組學列已經(jīng)被公布，其中GMI1000菌株的測序結(jié)果公布最早，且注釋信息最詳細，已經(jīng)成為其他菌株基因組研究的參考。在Tfe/siofliasoJaflaceara?基因組編碼的眾多蛋白中，/7ic基因編碼鞭毛亞基蛋白(I)，N-端和C-非常保守，但是中間區(qū)域變異明顯，可以被用來作為不同菌種和不同菌株鑒定的依據(jù)。正因如此，flic基因常被作為高特異性、高靈敏性PCR檢測的目標基因(2)。
[0004]環(huán)介導的擴增首先由Notomi報道，這是一種極具前景的新方法，可以廣泛應用于病原微生物的快速檢測。這種方法需要一組引物，這組引物共6條，經(jīng)過特殊設計，可是識別6個不同模板并能在Bst聚合酶大亞基作用下完成鏈取代式的DNA合成，原理核心LAMP的原理核心是針對靶基因6個區(qū)域設計的6條特殊引物和具有鏈置換活性的Bst(Bacillus stearothermophilus) DNA 聚合酶。在 Bst DNA 聚合酶最適溫度 60~65°C恒溫條件下，利用可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物和Bst DNA聚合酶鏈置換合成的活性，在靶序列兩端引物結(jié)合處循環(huán)不斷地產(chǎn) 生環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，使得引物在等溫條件下引發(fā)新鏈合成，從而使靶基因高效擴增。反應產(chǎn)物既可以通過傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，也可以直接加入SYBR green染色劑，通過顏色變化肉眼識別。
[0005]目前煙草青枯病病原菌的檢測主要用的PCR檢測法，對專業(yè)儀器依賴重，并且檢測時間較長的確定，而本發(fā)明利用環(huán)式等溫擴增原理，為煙草青枯病病原菌的檢測設計了一套分子檢測引物，利用這套引物，通過環(huán)式等溫擴增反應，可以快速準確的完成煙草青枯菌的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中煙草青枯病病原菌的檢測主要用的PCR檢測法，對專業(yè)儀器依賴重，并且檢測時間較長，本發(fā)明提供一種基于環(huán)式等溫擴增原理的煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用，利用環(huán)式等溫擴增原理，為煙草青枯病病原菌的檢測設計了一套分子檢測引物，利用這套引物，通過環(huán)式等溫擴增反應，可以快速準確地完成煙草青枯菌的檢測。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:本發(fā)明煙草青枯病病原菌分子檢測引物，由上下游內(nèi)引物、上下游外引物 和環(huán)引物組成，所述分子檢測引物的DNA序列為:
上游外引物(F3 ): 5 ’ -AGCCGGAACAAGTATTCATC-3 ’
下游外引物(B3):5，-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3，
上游內(nèi)引物(FIP):
5，-ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3，
下游內(nèi)引物(BIP):
5，-GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3，
環(huán)引物 F (Loop F):5，-CGTTTGCAGGGACGAGAT-3，
環(huán)引物 B (Loop B):5’ -CGGTCTGCGTGTGAACAG-3’。
[0008]本發(fā)明煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，包括以下步驟:以提取的疑似感
病煙草總DNA為模板，利用上述的分子檢測引物進行環(huán)式等溫擴增，反應結(jié)束后，根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色判定結(jié)果，反應產(chǎn)物為綠色的，即為煙草青枯病病原菌檢出。
[0009]更進一步，煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，在25ul體系中，上游內(nèi)引物 和下游內(nèi)引物濃度為1.6uM，上游外引物和下游外引物濃度為0.2uM，環(huán)引物B濃度
0.4uM, dNTP 濃度 400uM,甜菜堿 1.0M, Tris-HCl 的 pH 為 8.8，濃度 20mM ；KC1 濃度 IOmM,(NH4)2SO4 濃度 10mM，MgSO 4 濃度 6mM，l%Triton X_100，8 個單位的 BstDNA 聚合酶大亞基，20ul礦物油，最后整個反應體系61°C孵育45分鐘。
[0010]本發(fā)明煙草青枯病病原菌分子檢測引物可以應用于制備煙草青枯病病 原菌檢測用試劑盒。
[0011]本發(fā)明達到的有益效果:本發(fā)明根據(jù)煙草青枯病病原菌flic基因序列設計引物，該引物可用于煙草青枯病病原菌的環(huán)式等溫擴增檢測。而且本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明檢測方法能夠在45分鐘準確判斷是否存在煙草青枯病病原菌，為病害的早期診斷提供了保證。具體表現(xiàn)為
1、特異性強
2、實用性好
3、操作簡便快捷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]附圖1:煙草青枯病病原菌單菌落特異性檢測結(jié)果，從左至右分別以青枯病病原菌作為模板的反應產(chǎn)物，對照反應產(chǎn)物，綠色代表青枯病病原菌被檢出；附圖1的右邊電泳圖是對應反應產(chǎn)物的電泳結(jié)果，病原菌被環(huán)式等溫擴增法檢出后，電泳結(jié)果呈現(xiàn)梯狀條帶分布，沒有檢出的則是空白泳道；
附圖2:是帶病煙葉特異性檢測結(jié)果，左側(cè)為帶病煙葉DNA作為模板的反應產(chǎn)物，右側(cè)為健康煙葉DNA作為模板的反應產(chǎn)物；綠色代表青枯病病原菌被檢出；附圖2的右邊電泳圖是對應反應產(chǎn)物的電泳結(jié)果，病原菌被環(huán)式等溫擴增法檢出后，電泳結(jié)果呈現(xiàn)梯狀條帶分布，沒有檢出的則是空白泳道。
【具體實施方式】[0013]實施例1: 一、菌落DNA的快速提取
用滅菌牙簽挑取一個單菌落在IOOul裂解緩沖液(20nMTr1-Hcl，pH8.0 ；2nM EDTA,
1.2% Triton-100)中懸起，沸水浴10分鐘，冰上冷卻，粗裂解液直接作為LAMP模板
二、煙葉基因唔DNA的提取
采用天根生化的植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)提取煙葉基因組DNA，包括如下步
驟:
(1)取0.1g煙草葉片，以液氮研磨值粉末；加入400ul緩沖液LPl和6ul RNaseAC IOmg/ml)，渦旋振蕩I分鐘，室溫放置10分鐘；
(2)加入130ul緩沖液LP2，充分混勻，渦旋振蕩I分鐘；之后12000rpm離心5分鐘，將上清液移至新的離心管中；
(3)加入1.5倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻15秒，將所得溶液加入一個吸附柱內(nèi)；將吸附柱12000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中；
(4)再向吸附柱加入600ul漂洗液PW，12000rpm離心30秒，棄掉廢液后，吸附柱放入收集管中，再重復一遍上述操作；
(5)棄掉廢液，吸附柱放入收集管中，12000rpm離心2分鐘，再次棄掉廢液，吸附柱在室溫條件下放置數(shù)分鐘，已徹底晾干吸附材料中的殘余漂洗液；
(6)將吸附柱放入一個干凈的離心管，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200ul洗脫液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中；
(7)提取的基因組DNA濃度和質(zhì)量使用Nanodrop分析儀檢測。
[0014]三、引物的設計與合成
以國內(nèi)外多家研究機構(gòu)發(fā)布的W1S toniasolanacearum基因組測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，/7iC基因有多段核酸序列保守區(qū)域，適合設計環(huán)式等溫擴增的引物。根據(jù)目標區(qū)的序列特點及相關(guān)設計原則設計引物，獲得煙草青枯病病原菌環(huán)式等溫擴增檢測引物序列。所述煙草青枯病病原菌分子檢測引物DNA序列為:
上游外引物(F3 ):AGCCGGAACAAGTATTCATC 下游外引物(B3 ): TGGCGTTCTGAATACCTTG 上游內(nèi)引物(FIP):
ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC
下游內(nèi)引物(BIP):
GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC
環(huán)引物 F (Loop F):CGTTTGCAGGGACGAGAT
環(huán)引物 B (Loop B):CGGTCTGCGTGTGAACAG
四、環(huán)式等溫擴增檢測的方法建立
所述等溫擴增體系為25ul，體系中引物FIP和BIP濃度為1.6uM，引物F3和B3濃度為
0.2uM, 10pB 引物濃度 0.4uM，dNTP 濃度 400uM，甜菜堿 1.0M, Tris-HCl (pH8.8)濃度 20mM，KCl 濃度 IOmM, (NH4)2SO4 濃度 IOmM, MgSO4 濃度 6mM, l%Triton X-100，另外加入模板 DNA,然后加入8個單位的fciDNA聚合酶大亞基，然后立即混勻，加入20ul礦物油，混勻后離心10s，最后整個反應體系61°C孵育45min，以SYBR green染色；陽性結(jié)果反應產(chǎn)物將變成綠色，陰性結(jié)果反應產(chǎn)物為橙色。
[0015]實施例2
對煙草青枯病病原菌單菌落環(huán)式等溫擴增方法的特異性檢測:
用牙簽取煙草青枯病病菌單菌落，同時挑取無菌落的培養(yǎng)基做為對照，按照實施例1方法提取菌落DNA作為模板，然后進行環(huán)式等溫擴增。通過反應產(chǎn)物顏色判斷檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，青枯病單菌落對應的反應產(chǎn)物為綠色，而對照對應的反應產(chǎn)物仍為橙色。檢測結(jié)果如圖標示。表明建立的環(huán)式等溫擴增檢測方法具有良好的特異性，可以用于煙草青枯病病原菌單菌落的快速檢測。
[0016]實施例3
對帶有煙草青枯病病原菌的煙葉環(huán)式等溫擴增方法的特異性檢測:
分別取感有煙草青枯病的鮮煙葉健康鮮煙葉，按照實施例1方法提取煙草葉片基因組DNA，進行環(huán)式等溫擴增。通過反應產(chǎn)物顏色 判斷檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，感病煙葉對應的反應產(chǎn)物為綠色，健康葉片對應的反應產(chǎn)物仍為橙色。檢測結(jié)果如圖標示。表明建立的環(huán)式等溫擴增檢測方法具有良好的特異性，可以用于煙草青枯病病原菌的快速檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種煙草青枯病病原菌分子檢測引物，其特征在于:由上下游內(nèi)引物、上下游外引物和環(huán)引物組成，所述分子檢測引物的DNA序列為: 上游外引物:5’ -AGCCGGAACAAGTATTCATC-3’ 下游外引物:5，-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3， 上游內(nèi)引物:5’ -ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3’ 下游內(nèi)引物:5’ -GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3’ 環(huán)引物 F:5’ -CGITTGCAGGGACGAGAT-3’
環(huán)引物 B: 5 ’ -CGGTCTGCGTGTGAACAG-3，。
2.一種煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:以提取的疑似感病煙草總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的分子檢測引物進行環(huán)式等溫擴增，反應結(jié)束后，根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色判定結(jié)果，反應產(chǎn)物為綠色的，即為煙草青枯病病原菌檢出。
3.如權(quán)利要求2所述的煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，其特征在于: 在25ul體系中，上游內(nèi)弓丨物和下游內(nèi)弓丨物濃度為1.6uM，上游外引物和下游外引物濃度為0.2uM,環(huán)引物B濃度0.4uM, dNTP濃度400uM,甜菜堿1.0M, Tris-HCl的pH為8.8，濃度 20mM ；KC1 濃度 IOmM, (NH4)2SO4 濃度 IOmM, MgSO4 濃度 6mM, l%Triton X_100，8 個單位的BstDNA聚合酶大亞基，20ul礦物油，最后整個反應體系61°C孵育45分鐘。
4.一種如權(quán)利要求1所述的煙草青枯病病原菌分子檢測引物的應用，其特征在于:所述煙草青枯病病原菌分子 檢測引物用于制備煙草青枯病病原菌檢測用試劑盒。
【文檔編號】C12N15/11GK103468794SQ201310297162
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】賈蒙驁, 陳興江, 曹毅, 陸寧, 商勝華 申請人:貴州省煙草科學研究院