專利名稱：甲型流感病毒核衣殼蛋白的抗原表位及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型流感病毒感染的檢測(cè)和/或治療，屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流行性感冒(Influenza)簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒引起的呼吸道傳染病，其臨床特點(diǎn)是引起發(fā)熱、乏力、全身酸痛及伴隨一定程度上的呼吸道癥狀。流感病毒是人類健康的一大威脅，全世界姆年約有25-50萬人死于流感病毒的感染(Peter C. Doherty.等人，JClin Invest，2008，118 :3273-3275)。自從流感病毒被發(fā)現(xiàn)以來，人類歷史上共出現(xiàn)了五次世界范圍內(nèi)的流感大流行，共計(jì)造成了數(shù)千萬人的死亡。根據(jù)病毒核蛋白(NP)及基質(zhì)蛋 白(M)抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分為甲(KU乙(B)、丙(C)三型(HorimotoT.等人，NAT REV MICROBIOL, 2005, 3 (8) :591-600)。其中，甲型流感病毒(InfluenzaA Virus，簡(jiǎn)稱Flu A)變異快，致病力強(qiáng)，能引起世界范圍內(nèi)的大流行。こ型流感病毒(Influenza B Virus,簡(jiǎn)稱Flu B)變異較慢,只能引起局部范圍內(nèi)的小流行。丙型流感病毒(Influenza C Virus,簡(jiǎn)稱Flu C)變異最慢,致病力弱,通常只能感染抵抗力較低的孕婦和小孩。在自然界中Flu A的宿主范圍廣，除了其天然宿主水禽以外，還能夠引起人、馬、豬等多種動(dòng)物的感染。Flu A亞型多，變異大，已成為流感防控及疫苗研究的重點(diǎn)。Flu A屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、流感病毒屬、有包膜的單鏈負(fù)義RNA病毒。其基因組由八條分節(jié)段的RNA組成，至少編碼十種病毒蛋白。Flu A根據(jù)表面抗原血凝素(HA)及神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性及基因特性的不同又可以分多種亞型，目前在水禽中已發(fā)現(xiàn)了十六種H亞型(H1-H16)和九種N亞型(N1-N9) (Fouchier RA.等人,J Virol,2005，79 (5) :2814-2822)。人群中流行的Flu A亞型主要有兩種H亞型(HI、H3)和兩種N亞型(NI、N2) οFlu A基因片段5編碼核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein,簡(jiǎn)稱NP)。NP為Flu A的結(jié)構(gòu)蛋白，由498個(gè)氨基酸組成，分子量約為56KD，與病毒RNA及聚合酶形成核糖核蛋白體復(fù)合物。NP在病毒粒子中的含量高，約占病毒總蛋白量的30%，每個(gè)病毒粒子中約含有1000個(gè)NP分子。流感病毒NP的保守性遠(yuǎn)高于表面膜蛋白HA及NA，同型流感病毒NP的氨基酸同源性高于 90% (AltnmulerA.等人，J Gen Virol，1989，70 :2111-2119)，基因變異率僅為2. 3X10_3/年，具有型特異性，是流感病毒型別劃分的主要依據(jù)之一，也是動(dòng)物模型中研究最早的具有交叉保護(hù)效果的抗原(Shu L L.等人，J Virol, 1993,67(5) :2723-2729)。因此，NP作為主要的靶抗原用于流感病毒的檢測(cè)。Flu A感染人后，經(jīng)呼吸系統(tǒng)的傳播速度非常迅速。因此，及時(shí)有效的診斷對(duì)于FluA的預(yù)防及控制有重要意義。人在感染病毒后的36-48小時(shí)為最佳治療時(shí)間，因而快速診斷對(duì)于患者的及時(shí)治療有積極作用。目前流感病毒的診斷主要有以下三類傳統(tǒng)診斷法、分子診斷法及快速診斷法。傳統(tǒng)診斷主要有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)等。病毒分離培養(yǎng)法是流感病毒診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)(Gold Standard)。這種方法的可信度高，特異性好，但周期較長，通常需要3-7天。因而該方法不利于病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不利于病毒的及時(shí)防控。血清學(xué)檢測(cè)主要是檢測(cè)病毒人血清中抗體的存在情況。這種檢測(cè)方法屬于回顧性診斷，具有流行病學(xué)意義，但對(duì)于急性早期診斷意義不大，且敏感度較低。分子診斷法主要是指基于流感病毒核酸診斷的ー類方法，包括常規(guī)RT-PCR、real-time PCR及病毒全基因測(cè)序等。這些方法周期短、特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且能測(cè)定病毒不同的亞型。但這些方法對(duì)技術(shù)及設(shè)備的要求極高，不利于病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不能對(duì)大量臨床標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行平行檢測(cè)及篩查?？焖僭\斷是指能夠快速地得出檢測(cè)結(jié)果(約30分鐘)?？焖僭\斷方法必須符合國際實(shí)驗(yàn)室促進(jìn)協(xié)會(huì)(Committee for Laboratory Improvement Act, CLIA) 1988 年提出的床邊診斷(Point of Care)的要求(Mitamura K.等人，Nippon Rinsho 2003,61 (11)1914-1920 ；Storch GA.等人，CurrOpinPediatr 2003，15 (I) :77-84)。既可以檢測(cè)流 感病毒的抗原也可以檢測(cè)抗體。目前國內(nèi)外已有商品化的流感病毒快速檢測(cè)試劑盒，如Directigen-Flu A/Flu A&B、Quidel-QuiCkVue 等,都能在 15-30 分鐘以內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果。由于流感病毒中NP的高保守性及高豐度，因而，當(dāng)前的快速診斷試劑盒的檢測(cè)靶點(diǎn)都是NP抗原。這些檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、無需特殊設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，抗原快速診斷試劑已成為廣大臨床單位進(jìn)行Flu A診斷的首選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)方面涉及甲型流感病毒核衣殼蛋白(Flu A NP)的抗原表位多肽，其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生甲型流感病毒的特異性抗體或者能夠與甲型流感病毒的抗體特異性結(jié)合。在ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗原表位多肽為(a)甲型流感病毒核衣殼蛋白的多肽片段，其包含SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列或者與SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；并且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生甲型流感病毒的特異性抗體或者能夠與甲型流感病毒的抗體特異性結(jié)合。其中，所述抗原表位多肽的長度可以是9-25個(gè)氨基酸，例如9-20個(gè)氨基酸，例如19個(gè)、18個(gè)、17個(gè)、16個(gè)、15個(gè)、14個(gè)、13個(gè)、12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)或9個(gè)氨基酸。在另ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗原表位多肽為(b)在SEQ IDNO 29所示氨基酸序列的一端或兩端經(jīng)I個(gè)或多個(gè)(例如I個(gè)或幾個(gè))氨基酸，例如1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中經(jīng)I個(gè)或多個(gè)(例如I個(gè)或幾個(gè)，例如1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸)氨基酸的置換得到的多肽；并且其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生甲型流感病毒的特異性抗體或者能夠與甲型流感病毒的抗體特異性結(jié)合。在特別的實(shí)施方式中，所述經(jīng)延伸和/或置換后得到的(b)的抗原表位多肽與上述(a)中的抗原表位多肽有至少90%的序列一致性，例如至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的上述(a)或(b)的抗原表位多肽包含SEQ ID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，特別地，其由SEQ ID NO :17-23或SEQ ID NO :25-29中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成，例如由SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列組成。在又ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包含上述任一本發(fā)明的抗原表位多肽。在具體的實(shí)施方式中，所述分離的多肽可以是甲型流感病毒核衣殼蛋白的多肽片段，其長度可以是例如9-497個(gè)氨基酸、9-400個(gè)氨基酸、9-300個(gè)氨基酸、9-200個(gè)氨基酸、9-178個(gè)氨基酸、9-150個(gè)氨基酸、9-100個(gè)氨基酸、9-50個(gè)氨基酸或9_20個(gè)氨基酸；在ー個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，或者與SEQ ID NO :7有至少90%，例如至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及復(fù)合物，其包含 (i)上述任一種本發(fā)明的抗原表位多肽或上述任一種本發(fā)明的分離的多肽；以及(ii)載體(例如大分子載體或重組載體)；其中所述載體包括但不限于蛋白、毒素或脂類，其中所述抗原表位多肽與所述載體可以通過偶聯(lián)、綴合或融合得到所述復(fù)合物。當(dāng)所述抗原表位多肽與所述載體偶聯(lián)時(shí)，所述偶聯(lián)可以是MBS法、戊ニ醛法、活潑酷法、碳ニ亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法等。所述載體有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、鑰孔血白蛋白及其他Y球蛋白等蛋白類載體，另有重組載體可以為多聚賴氨酸、ニ軟脂酰賴氨酸、三軟脂酸2S甘油半胱氨酰2絲氨?；z氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。特別地，所述復(fù)合物可以是融合蛋白。在ー個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白中的載體為HBVcAg，例如為由HBVcAg的1-183位氨基酸組成的蛋白。在又ー個(gè)方面，本發(fā)明還提供展示上述抗原表位多肽的類病毒顆粒。所述抗原表位多肽典型地通過與載體蛋白融合，經(jīng)過蛋白純化和組裝后而形成類病毒顆粒，并將所述抗原表位多肽展示在類病毒顆粒的表面，使其仍保持誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生的能力，其中所述載體蛋白可以為HBVcAg，例如由HBVcAg的1-183位氨基酸組成。在另外的方面，本發(fā)明還涉及編碼前述任一抗原表位多肽、前述任一分離的多肽或前述任一復(fù)合物(例如所述融合蛋白)的多核苷酸序列，或者包含該多核苷酸序列的分尚的核酸分子。本發(fā)明還涉及核酸載體，其包含前述的任一核酸分子。在又一方面，本發(fā)明還涉及包含上述分離的核酸分子或核酸載體的宿主細(xì)胞，例如微生物宿主細(xì)胞，如大腸桿菌宿主細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明還涉及組合物，例如藥物組合物(如疫苗)或診斷組合物，其包含本發(fā)明所述的任一抗原表位多肽、前述的任一分離的多肽、前述的任ー復(fù)合物、類病毒顆?；蚯笆龅暮怂岱肿?，以及任選地藥學(xué)上可接受的載體(例如佐劑)。本發(fā)明還涉及前述的任一抗原表位多肽，任一分離的多肽、任ー復(fù)合物、任ー類病毒顆粒、任一核酸分子在制備用于檢測(cè)、預(yù)防和/或治療甲型流感病毒感染的組合物中的用途。特別地，本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的前述的任一抗原表位多肽，任一分離的多肽、任一復(fù)合物、任ー類病毒顆粒，或任一核酸分子，或者向其施用本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)。本發(fā)明也涉及診斷甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括(I)使來自受試者的樣品與前述的任一抗原表位多肽、任一分離的多肽、任ー復(fù)合物、或任ー類病毒顆粒接觸，或者與前述任一診斷組合物接觸，以及(2)檢測(cè)所述任ー抗原表位多肽，任一分離的多肽，任ー復(fù)合物或類病毒顆粒與樣品中可能存在的抗體之間形成的特異性免疫結(jié)合物，從而判斷所述受試者是否感染了甲型流感病毒。在又ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及ー種抗體(例如單克隆抗體)，其特異性地識(shí)別本發(fā)明的前述任一抗原表位多肽、前述任一分離的多肽或任一前述復(fù)合物。特別地,本發(fā)明的抗體還包括能阻斷Flu A NP的多抗血清或者抗體4D2與Flu ANP相結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，所述抗體能夠阻斷Flu A NP的多抗血清或者抗體4D2與Flu ANP相結(jié)合的活性的至少50%，例如至少70%、至少80%或至少90%?？梢悦子贸Ｒ?guī)方法如Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中描述的方法，測(cè)定某一未知抗體降低某一已知抗體結(jié)合Flu A NP的能力。例如，先把抗原預(yù)包被在微孔板上，然后把系列稀釋的未標(biāo)記的待測(cè)抗體和特定濃度的標(biāo)記后的已知抗體共同加入上述預(yù)包被后的微孔板中孵育，洗滌后測(cè)定不同稀釋度的待測(cè)抗體和已知抗體結(jié)合到板上的數(shù)量。待測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)已知抗體結(jié)合抗原的能力越強(qiáng)，已知抗體結(jié)合抗原的能力就越弱。通常，抗原是預(yù)包被在96孔微孔板上，并利用放射標(biāo)記法或酶標(biāo)記法測(cè)定未標(biāo)記抗體阻斷已標(biāo)記抗體的能力。在ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其它動(dòng)物來源，或?yàn)榛蚬こ炭贵w，如人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體等。另外，其中所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。特別地，本發(fā)明所述抗體的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :11_13所示氨基酸序列中的ー個(gè)或多個(gè)，和/或其輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :14-16所示氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQID NO :11-13所示的氨基酸序列或者分別由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列組成。在又ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述抗體的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分別由SEQ ID NO : 14-16所示的氨基酸序列組成。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述抗體的重鏈⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ IDNO :11-13所示的氨基酸序列或者分別由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列組成；并且其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分別由SEQID NO :14-16所示的氨基酸序列組成。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體的重鏈可變區(qū)與抗體4D2的重鏈可變區(qū)相同。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體的輕鏈可變區(qū)與抗體4D2的輕鏈可變區(qū)相同。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與抗體4D2 的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)相同。特別地，本發(fā)明所述的抗體為雜交瘤細(xì)胞株4D2所產(chǎn)生的單克隆抗體(在本申請(qǐng)中稱為抗體4D2)，所述雜交瘤細(xì)胞株4D2于2010年10月22日被保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為C2010103。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體廣譜性地特異識(shí)別ー種或多種甲型流感病毒，例如毒株H5N1、HlNl、H3N2、新甲型HlNl等，所述病毒毒株以人或動(dòng)物(例如豬、馬、水禽等)為宿主。在ー個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體衍生自抗體4D2，且所述衍生的抗體可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其它動(dòng)物來源，或?yàn)榛蚬こ炭贵w，如人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體等；其可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明還涉及雜交瘤細(xì)胞株，其是CCTCC保藏編號(hào)為C2010103的雜交瘤。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明還涉及藥物組合物或診斷組合物，其包含前述的任ー種抗體，以及任選地藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及前述的任一抗體在制備用于檢測(cè)、預(yù)防和/或治療甲型流感病毒感染的組合物中的用途。
特別地，本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的前述任一抗體。本發(fā)明也涉及診斷甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括(I)使來自受試者(例如動(dòng)物或人)的樣品與前述任一抗體接觸，以及(2)檢測(cè)所述抗體與樣品中可能存在的甲型流感病毒抗原之間形成的特異性免疫結(jié)合物，從而判斷所述受試者是否感染了甲型流
感病毒。特別地，所述檢測(cè)方法可為間接免疫熒光檢測(cè)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)，ELISA檢測(cè)或蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)等。


圖I為pT0-T7-C183的質(zhì)粒示意圖。圖2為pT0-T7-C183-NP9的質(zhì)粒示意圖。圖3為融合蛋白C183-NP9純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中I :表達(dá)C183-NP9的大腸桿菌(E. coli)全部溶胞產(chǎn)物；2 :C183-NP9超聲上清65°C水浴中熱變性30min后，離心后的上清；圖4為單克隆抗體4D2與Flu A NP、Flu B NP兩種NP重組蛋白的蛋白質(zhì)印跡(簡(jiǎn)稱WB)檢測(cè)結(jié)果。圖中1-7為12% SDS-PAGE電泳結(jié)果，8-13為WB結(jié)果。從左至右依次為1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、1249-NP，(A/Xiamen/1249/2007 (HlNl)) ;3、177_NP，(A/Shantou/177/2005 (H3N2)) ;4、N444-NP，(A/Xiamen/N444/2009 (全國流行的 H1N1)) ;5、212-NP, (A/Hong Kong/212/2003(H5N1)) ;6、 NS727-NP， (A/Swine/NS727/2005(H3N2))；
7、Flu B NP, (B/Shantou/331-5/2005) ;8、1249-NP 的 WB 結(jié)果；9、177-NP 的 WB 結(jié)果；10、N444-NP 的 WB 結(jié)果;11、212_NP 的 WB 結(jié)果;12、NS727_NP 的 WB 結(jié)果;13、Flu B NP 的 WB 結(jié)果O圖5為單克隆抗體4D2與Flu A、Flu B兩種流感病毒的WB檢測(cè)結(jié)果。圖中從左至右依次為1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、Flu A毒株A/California/04/2009的WB結(jié)果，3、Flu B毒株 B/Shantou/331-5/2005 的 WB 結(jié)果。圖6為單克隆抗體4D2與Flu A、Flu B兩種流感病毒的間接免疫熒光結(jié)果。對(duì)于每ー個(gè)特定病毒株而言，左側(cè)照片顯示FITC熒光，右側(cè)照片顯示DAPI熒光。圖7為單克隆抗體4D2與感染Flu A致死的小鼠肺部切片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果O
具體實(shí)施例方式在本申請(qǐng)中， 術(shù)語“抗原表位多肽”指任何能夠被特異性的抗體所識(shí)別的多肽片段。在具體的實(shí)施方式中，所述“抗原表位多肽”的長度可以是4-25個(gè)氨基酸，例如9-25個(gè)氨基酸、9-20個(gè)氨基酸，例如19個(gè)、18個(gè)、17個(gè)、16個(gè)、15個(gè)、14個(gè)、13個(gè)、12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)或9個(gè)氨基酸。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“甲型流感病毒核衣殼蛋白的多肽片段”是指這樣的多肽(i)其氨基酸序列包含在SEQ ID NO :1所示的序列中，或者(ii)其氨基酸序列與SEQ ID NO:I所示的序列或其片段有至少90%，例如至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性；并且(iii)其不是由SEQID NO :1所示的氨基酸序列所組成的多肽。在本申請(qǐng)中，“序列一致性”是指候選序列中的核酸或氨基酸分別與對(duì)應(yīng)的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同或相似的百分比。對(duì)于某ー個(gè)序列，將它和目的序列進(jìn)行比對(duì)，必要時(shí)可跳過突變?nèi)饱?，以達(dá)到最大的相似百分比。本領(lǐng)域的多種比對(duì)方法可用于確定核酸或氨基酸序列的相似性，可以使用的計(jì)算機(jī)軟件包括例如BLAST，BLAST-2, ALIGN,ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得為比對(duì)設(shè)定合適的測(cè)量參數(shù)，包括使用最大可比性的ー些運(yùn)算法則以達(dá)到全長序列的比較。在本申請(qǐng)中“特異性結(jié)合”指的是，兩分子間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)，如抗體和產(chǎn)生該抗體的抗原間的反應(yīng)。此處，結(jié)合第一種抗原的抗體對(duì)第二種抗原的結(jié)合親和カ是檢測(cè)不到的或者即使可以檢測(cè)到，也是很弱的。在本發(fā)明中，可用于甲型流感病毒感染檢測(cè)的方法包括但不限于，例如酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)、放射免疫檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)、免疫色譜法、競(jìng)爭(zhēng)法、免疫組織化學(xué)檢測(cè)法及類似的檢測(cè)方法。本發(fā)明中涉及的藥物組合物或診斷組合物可進(jìn)ー步包含用于預(yù)防、治療和/或診斷甲型流感病毒感染的其它試劑或組合物，可以和這些抗病毒試劑同時(shí)、分開或連續(xù)給藥，所述其它試劑或組合物包括但不限干，例如干擾素，免疫抑制劑如環(huán)胞菌素。在本申請(qǐng)中，“預(yù)防或治療有效量”指足以防止或減少Flu A感染的量?！八帉W(xué)可接受的載體”指不會(huì)在所施用的受試者身上引發(fā)過敏反應(yīng)或其他不適影響的載體，以及表示不干擾活性成分的生物活性的效カ的非毒性物質(zhì)。合適的藥學(xué)可接受的載體包括，例如，ー種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、こ醇和其他類似物，以及上述物質(zhì)的組合。藥學(xué)可接受的載體可進(jìn)ー步包括能提高多肽、抗體或核酸分子的保存期限或效用的微量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化剤、防腐劑或緩沖液。本發(fā)明的組合物，例如藥物組合物的施用方式包括但不限于傳統(tǒng)的施用途徑，例如靜脈滴注、肌肉注射、陰道、ロ服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內(nèi)、內(nèi)胞漿網(wǎng)槽內(nèi)、腹股溝、膀胱內(nèi)、局部(如，粉劑、藥膏或滴劑)，或鼻腔途徑等。特別地，所述施用形式是注射或輸液形式。本發(fā)明的組合物可以各種形式存在，包括但不限于例如，固體、半固體和液體的劑型，例如片劑、丸劑、粉末、溶液、分散液或懸浮液、脂質(zhì)體、栓劑、注射用及輸液用溶液。優(yōu)選的形式根據(jù)具體的施用方式及其預(yù)防、治療或診斷應(yīng)用而定。適合腸胃外途徑注射的本發(fā)明的組合物可能含有符合藥物制備要求的無菌水或非水溶液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，或者可在臨用時(shí)重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無菌粉齊U。如適合的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、こ醇、多羥基化合物(如丙烯こニ醇、聚こ烯ニ醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機(jī)脂，如こ烷油酸，如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動(dòng)性，如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合適的顆粒尺寸。本發(fā)明所述的組合物還可含有ー些起保護(hù)性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也可以含有預(yù)防微生物污染的速溶成分，如各種抗細(xì)菌試劑、抗真菌試劑，如對(duì)羥苯甲酸甲酷、三氯叔丁醇、苯酚，山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCl及其類似物?？墒褂醚娱L吸附的試劑來延長注射用藥物成分吸附時(shí)間，如單硬脂酸鹽和凝膠等。 本發(fā)明的組合物也可制成適合獸用治療或診斷的混合物，或符合獸用的溶劑或初成藥，井根據(jù)普通獸醫(yī)和獸醫(yī)從業(yè)者的要求制成最適合某種特定動(dòng)物的施用劑量和劑型。本發(fā)明所述的表位多肽、抗體或組合物可以與其它抗病毒試劑相結(jié)合而用于預(yù)防和/或治療Flu A感染及與之相關(guān)的疾病。本發(fā)明的組合物可以和其它抗病毒試劑同時(shí)、分開或連續(xù)施用。其它抗病毒試劑包括但不限于，例如利巴韋林、金剛烷、羧基服、IL-2、IL-12和五羧鏈胞酸。下面結(jié)合具體實(shí)施例與附圖，進(jìn)一歩對(duì)本發(fā)明加以描述，但這些描述并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。除非另外定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域里的普通技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中的步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)命名和步驟。實(shí)施例I :NP蛋白B細(xì)胞抗原表位區(qū)域的篩選由于Flu A NP蛋白氨基酸同源性高于90%，于是本發(fā)明選擇Flu A毒株A/HK/212/2003(H5N1)用于NP蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選，所述毒株A/HK/212/2003 (H5N1)NP 蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO: I) MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVSGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKffVRELILYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHLMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERSTIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAEEYDN根據(jù)A/HK/212/2003NP蛋白氨基酸序列，設(shè)計(jì)了亞克隆片段(128_305aa和300-498aa)及NP蛋白全長(l_498aa)。設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物，如表I所示，并將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的DNA片段插入表達(dá)載體PT0-T7與His-tag進(jìn)行融合表達(dá)。融合表達(dá)的NP亞克隆重組蛋白與抗甲型流感NP蛋白的小鼠血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(WB)分析，分析NP蛋白抗原表位所在區(qū)域，結(jié)果見表2所示。其中作為陰性對(duì)照，選用了一株こ型流感病毒的NP重組蛋白，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2) MSNMDIDGINTGTIDKAPEEITSGTSGTTRPIIRPATLAPPSNKRTRNPSPERATTIGEADVGRKTQKKQTPTEIKKSVYNMVVKLGEFYNQMMVKAGLNDDMERNLIQNAHAVERILLAATDDKKTEFQKKKNVRDVKEGKEEIDHNKTGGTFYKMVRDDKTIYFSPIRVTFLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDVCFQRSKALKRVGLDPSLISTFAGSTLPRRSGATGVAIKGGGTLVAEAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAYEKILLNLKNKCSAPQQKALVDQVIGSRNPGIADIEDLTLLARSMAVVRPSVASKVVLPISIYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSILRVGDDAKDKSQLFFMSCFGAAYEDLRVLSALTGTEFKPRSALKCKGFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNEVG⑶GGSGQISCSPVFAVERPIALSKQAVRIMLSMNIEGRDADVKGNLLKMMNDSMAKKTNGNAFIGKKIFQISDKNKTNPVEIPIKQTIPNFFFGRDTAEDYDDLDY。簡(jiǎn)要 地，分析流程如下設(shè)計(jì)亞克隆片段序列——合成亞克隆片段的PCR引物——構(gòu)建表達(dá)載體——誘導(dǎo)表達(dá)——親和層析純化亞克隆片段——檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物與抗NP蛋白的小鼠血清的反應(yīng)性——根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析NP蛋白抗原表位所在的區(qū)域。結(jié)果分析表明，初步鑒定出的NP蛋白B細(xì)胞抗原表位區(qū)域?yàn)?28_305aa。表INP蛋白亞克隆片段擴(kuò)增的引物序列
NP蛋白片段「 序列編號(hào) I引物名稱I_引物序列_
SEO ID NO: 3 128-305F 5-GAATTCGACGCAACTGCTGGTCTTAC-3 128-305aa ----
__SEQ ID NO: 4 __128~305R__5=GTCGACACGGAAAGGATCTATTC= 3 _
SEO ID NO: 5 300-498F5-GAATTCGGAATAGATCCTTTC-3
300-498aa ------
__SEQ ID NO: 6 __300-498R__5-GTCGACATTGTCATACTCCTCTGC-3 _表2NP亞克隆片段與NP蛋白抗血清WB反應(yīng)結(jié)果
序列編號(hào) NP亞克隆片段WB結(jié)果
SEQ ID NO: 7 128-305aa+
SEQ ID NO: 8 300-498aa-
SEQ ID NO: I (陽性對(duì)照)l-498aa+
SEQ ID NO: 2(陰性對(duì)照)_こ型流感NP蛋白_ - _注每種NP亞克隆重組抗原以5 μ g/well進(jìn)行15% SDS-PAGE ；NP蛋白小鼠抗血清為500倍稀釋；“ + ”代表WB反應(yīng)陽性，代表WB反應(yīng)陰性。實(shí)施例2 NP蛋白杭原表位定位根據(jù)實(shí)施例I中初步鑒定出的抗原表位區(qū)域，設(shè)計(jì)合成了覆蓋128_307aa的多肽庫。庫內(nèi)共含有17條多肽，每條多肽由20個(gè)氨基酸組成，相鄰2條多肽有10個(gè)氨基酸殘基重疊。肽庫合成由上海吉爾生化有限公司完成，所有多肽純度大于60%，均進(jìn)行了 HPLC和MS分析。將17條多肽分別以包被緩沖液(20mM CB，PH9. 6)稀釋到5 μ g/ml，4°C包被過夜。次日以O(shè). I % PBS-Tween洗板I次，以含I % BSA的PBS-T溶液37°C封閉2小時(shí)，拍干。將NP蛋白的小鼠抗血清與包被后的17條多肽進(jìn)行間接ELISA分析，反應(yīng)結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，經(jīng)合成肽掃描及間接ELISA鑒定出的NP蛋白抗原表位序列為M12(238-257aa) (SEQID NO 17)。表3NP蛋白多肽與NP蛋白抗血清間接ELISA反應(yīng)結(jié)果
權(quán)利要求
1.分離的抗原表位多肽，其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生甲型流感病毒的特異性抗體和/或能夠與甲型流感病毒的抗體特異性結(jié)合，所述抗原表位多肽選自 (a)甲型流感病毒核衣殼蛋白的多肽片段，其包含SEQID NO :29所示的氨基酸序列或者與SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；或 (b)在SEQID NO 29所示氨基酸序列的一端和/或兩端經(jīng)I個(gè)或幾個(gè)氨基酸，例如I、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中經(jīng)I個(gè)或幾個(gè)，例如1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸的置換而得到的多肽； 其中，所述抗原表位多肽的長度可以是9-25個(gè)氨基酸，例如9-20個(gè)氨基酸，例如19個(gè)、18個(gè)、17個(gè)、16個(gè)、15個(gè)、14個(gè)、13個(gè)、12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)或9個(gè)氨基酸。
2.權(quán)利要求I所述的抗原表位多肽，其包含SEQID NO 17-23或SEQID NO 25-29中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求I或2所述的抗原表位多肽，其由SEQID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成。
4.分離的多肽，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽；特別地，其為甲型流感病毒核衣殼蛋白的多肽片段。
5.復(fù)合物，其包含 (i)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽或權(quán)利要求4所述的分離的多肽；和 ( )載體； 其中所述載體為蛋白、毒素或脂類；其中所述抗原表位多肽與所述載體通過偶聯(lián)、綴合或融合得到所述復(fù)合物；優(yōu)選地，所述載體為蛋白，例如HBVcAg。
6.權(quán)利要求5所述的復(fù)合物，其為融合蛋白。
7.類病毒顆粒，其展示權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽。
8.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽、權(quán)利要求4中所述的分離的多肽或權(quán)利要求6所述的復(fù)合物的核酸序列。
9.核酸載體，其包含權(quán)利要求8所述的分離的核酸分子。
10.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8所述的分離的核酸分子或權(quán)利要求9所述的核酸載體。
11.藥物組合物或診斷組合物，例如疫苗，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽，權(quán)利要求4所述的分離的多肽，權(quán)利要求5或6中所述的復(fù)合物，權(quán)利要求7所述的類病毒顆?；蛘邫?quán)利要求8所述的分離的核酸分子，以及任選地藥學(xué)上可接受的載體。
12.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽，權(quán)利要求4所述的分離的多肽，權(quán)利要求5或6中所述的復(fù)合物，權(quán)利要求7所述的類病毒顆?；蛘邫?quán)利要求8所述的分離的核酸分子在制備用于檢測(cè)、預(yù)防和/或治療甲型流感病毒感染的組合物中的用途。
13.抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原表位多肽、權(quán)利要求4所述的分離的多肽或權(quán)利要求5或6所述的復(fù)合物；其中所述抗體可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其他動(dòng)物來源，或?yàn)榛蚬こ炭贵w，如人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體；所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
14.權(quán)利要求13所述的抗體，其中 所述抗體的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列或者分別由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列組成。
15.權(quán)利要求13或14所述的抗體，其中 所述抗體的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分別由SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列組成。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與CCTCC保藏編號(hào)為C2010103的雜交瘤產(chǎn)生的抗體4D2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列相同。
17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與CCTCC保藏編號(hào)為C2010103的雜交瘤產(chǎn)生的抗體4D2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相同。
18.權(quán)利要求17所述的抗體，其是CCTCC保藏編號(hào)為C2010103的雜交瘤產(chǎn)生的抗體.4D2。
19.一種雜交瘤細(xì)胞株，其是CCTCC保藏編號(hào)為C2010103的雜交瘤。
20.藥物組合物或診斷組合物，例如疫苗，其包含權(quán)利要求13-18中任ー項(xiàng)所述的抗體，以及任選地藥學(xué)上可接受的載體。
21.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于檢測(cè)、預(yù)防或治療甲型流感病毒感染的組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲型流感病毒核衣殼蛋白的保守表位多肽及其用途。具體而言，本發(fā)明提供了甲型流感病毒核衣殼蛋白的保守表位多肽，及其保守性變異體或活性片段，及其相關(guān)編碼序列，其融合蛋白或偶聯(lián)物，及應(yīng)用該多肽于預(yù)防或診斷的用途，本發(fā)明還提供特異識(shí)別該保守表位多肽的抗體，及其用于診斷或治療甲型流感病毒感染的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102775469SQ20111012246
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者吳興容, 夏寧邵, 桂勛, 鄭清炳, 陳毅歆, 黃德黨 申請(qǐng)人:廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)