專利名稱：具有雙重篩選標(biāo)記的多形漢遜酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有雙重篩選標(biāo)記的多形漢遜酵母菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母菌作為單細(xì)胞真核生物，既具有原核生物生長(zhǎng)快，遺傳操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，又具有與高等真核生物相似的基因表達(dá)調(diào)控和翻譯后修飾機(jī)制，因此是生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛的微生物細(xì)胞工廠，在大宗發(fā)酵產(chǎn)品、精細(xì)醫(yī)藥化工原料和蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母是近年來(lái)備受關(guān)注的一類酵母菌，其中的多型漢遜酵母 (Hansenula polymorpha)因具有以下優(yōu)勢(shì)(1)可利用自身強(qiáng)啟動(dòng)子高效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)；( 非同源重組的頻率高，可以使目標(biāo)基因高拷貝整合到染色體上，易獲得高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子；C3)表達(dá)的外源蛋白通常貯存在過(guò)氧化物酶體內(nèi)，可使其免受胞內(nèi)蛋白酶的降解，并且降低了對(duì)細(xì)胞的毒害作用；(4)外源蛋白的表達(dá)量和分泌效率比釀酒酵母高 10-100倍，且沒(méi)有過(guò)度糖基化的現(xiàn)象；( 能用廉價(jià)的培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵，進(jìn)一步提高外源基因的表達(dá)水平；(6)耐高溫，最適生長(zhǎng)溫度為37°C-43°C，生長(zhǎng)速率快，大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間短、污染率低。因此是目前國(guó)際上公認(rèn)的生產(chǎn)醫(yī)藥用蛋白的理想宿主，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)目的蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)，漢遜酵母能在較高溫度下實(shí)現(xiàn)木糖和乙醇的轉(zhuǎn)化，在生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化中糖化發(fā)酵同步進(jìn)行發(fā)揮重要功能，因此受到國(guó)內(nèi)外研究者的極大關(guān)注。漢遜酵母將不斷成為生物技術(shù)領(lǐng)域新的微生物細(xì)胞工廠。近年來(lái)，關(guān)于漢遜酵母遺傳操作系統(tǒng)的研究取得了較大的進(jìn)展，但目前的遺傳操作系統(tǒng)基本上利用的是單篩選標(biāo)記，難以滿足對(duì)該酵母菌進(jìn)行功能基因組學(xué)研究、組合生物合成和代謝工程改造、以及功能蛋白高效表達(dá)等的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型多形漢遜酵母菌。本發(fā)明所提供的尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4778。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型基因工程酵母菌。本發(fā)明所提供的尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型基因工程酵母菌，為尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶編碼基因的功能喪失，得到的重組菌即為基因工程酵母菌。所述將尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶編碼基因的功能喪失是通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)的；所述尿嘧啶合成缺陷型酵母菌為多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)
4HU-IICGMCC No. 1218。所述同源重組的方法包括如下步驟向多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-Il中導(dǎo)入序列表中序列2所示的DNA。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種表達(dá)外源蛋白的試劑盒。本發(fā)明所提供的表達(dá)外源蛋白的試劑盒，包括所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌和酵母表達(dá)載體，所述酵母表達(dá)載體為如下1) 和/或幻所示1)滿足如下條件的酵母表達(dá)載體I 將所述酵母表達(dá)載體I轉(zhuǎn)入所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula p0lym0rpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能夠合成尿嘧啶；2)滿足如下條件的酵母表達(dá)載體II 將所述酵母表達(dá)載體II轉(zhuǎn)入所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能夠合成色氨酸。所述酵母表達(dá)載體I按照如下方法制備在載體YEp352的多克隆位點(diǎn)上插入由甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子ΜΟΧρ、外源蛋白編碼基因和醇氧化酶基因終止子AOXlTT依次連接而成的表達(dá)盒得到的酵母表達(dá)載體；所述酵母表達(dá)載體II按照如下方法制備在載體P352HTRP的多克隆位點(diǎn)上插入由甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子ΜΟΧρ、外源蛋白編碼基因和醇氧化酶基因終止子AOXlTT依次連接而成的表達(dá)盒得到的酵母表達(dá)載體；所述甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子MOXp的核苷酸序列如序列表中序列3第1位到1517 位所示；所述醇氧化酶基因終止子Α0Χ1ΤΤ的核苷酸序列如序列表中序列3第3286位到 3690位所示；所述載體P352HTRP按照如下方法制備將序列表中序列1所示的DNA序列插入表達(dá)載體ΥΕρ352的MuI和NdeI酶切位點(diǎn)得到的重組載體。所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或所述基因工程酵母菌在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述試劑盒在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種表達(dá)外源蛋白的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)外源蛋白的方法，包括如下步驟1)將外源蛋白的編碼基因通過(guò)酵母表達(dá)載體導(dǎo)入所述的多形漢遜酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31或所述基因工程酵母菌中，得到重組酵母菌；2)用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組酵母菌，得到存活的重組酵母菌；3)培養(yǎng)所述存活的重組酵母菌，得到所述外源蛋白；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體I時(shí)，所述步驟2、中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有尿嘧啶但含有色氨酸；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體II時(shí)，所述步驟幻中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有色氨酸但含有尿嘧啶；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體I和酵母表達(dá)載體II時(shí)，所述步驟2)中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有色氨酸也不含有尿嘧啶。所述培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為酵母菌基本培養(yǎng)基YNB。一種DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。本發(fā)明利用小片段同源序列介導(dǎo)的同源重組和整合構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的、乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURAiB)和5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶基因(HTRPl)同時(shí)被阻斷的尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷的多形漢遜酵母重組菌，特別是多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-3ICGMCC No. 4778。該菌株同時(shí)具有尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重組菌株的培養(yǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)， 不但可以簡(jiǎn)單快速篩選到重組菌株，而且雙重篩選標(biāo)記可以提高目標(biāo)基因在染色體上整合的拷貝數(shù)，提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)雙重篩選標(biāo)記也將用于漢遜酵母功能基因組學(xué)、合成生物學(xué)及代謝工程的多基因遺傳修飾。


圖1為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31的表型分析。圖2為質(zhì)粒ρΜΟΧΖ α -ALP、pMU α A禾口 ρΜΤ α A的物理圖譜。圖3為重組菌株HUTA-I和HP_A_1產(chǎn)α -淀粉酶能力比較。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用限制性內(nèi)切酶和T4-DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；pfu DNA聚合酶mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。實(shí)施例1、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的構(gòu)建及生物學(xué)分析一、尿嘧啶和色氨酸合成雙缺陷多形漢遜酵母菌的構(gòu)建1,5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶基因HTRPl的克隆和序列分析根據(jù)已報(bào)道的多形漢遜酵母菌的HTRPl的核苷酸序列(GenBank Access No. AY795576自5'末端第1-1010位的脫氧核糖核苷酸所示的序列)，設(shè)計(jì)的引物序列如下引物1 :5
位點(diǎn))引物2:5
位點(diǎn))以多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) JCM3621 (CGMCC 2. 2498)(購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，CGMCC)的總DNA為模板，在引物1和引物2 的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增HTRPl，PCR反應(yīng)體系為模板DNA 0. 6yg，引物10. 5μπιο1/ L，引物20. 5ymol/L，pfu DNA聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1次；94°C 40秒， 540C 1分鐘，72°C 2分鐘，四個(gè)循環(huán)；94°C 40秒，54°C 1分鐘，72°C 15分鐘，循環(huán)1次。將PCR產(chǎn)物回收并純化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明得到了大小約
-ATAAGGCCTCGGAGGATCGCAGGAGACGG-3 ‘(劃線部分堿基為 StuI 識(shí)別 -TCACATATGCGCCGAGGAGGTCATTGCTG-3 ‘(劃線部分堿基為 NdeI 識(shí)別1. Ikb的DNA片段，與預(yù)期的大小一致，將其命名為HTRPl，其核苷酸序列如序列表中序列1 所示。用StuI和NdeI酶切PCR擴(kuò)增到的HTRPl，回收約1. 11Λ的DNA片段；同時(shí)用 StuI和NdeI酶切穿梭載體YEp352(公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，記載過(guò)穿梭載體YEp；352的非專利文獻(xiàn)是Hill JE, Meyers AM, Koerner TJ, et al. A yeast/E. coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites. Yeast,1993,9 :163-167), 純化回收約4. 71Λ的載體大片段，在T4DNA連接酶作用下，將回收的載體大片段與回收的 1. Ikb的HTRPl基因片段連接，16°C反應(yīng)10小時(shí)進(jìn)行連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體YEp352的MuI和NdeI酶切位點(diǎn)間插入的DNA序列為序列表中的序列1，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為P352HTRP， P352HTRP的其他元件與載體YEp352相同，但用HTRPl替換了載體YEp352上的&URA3。重組質(zhì)粒P352HTRP可以互補(bǔ)釀酒酵母的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶基因功能缺陷，說(shuō)明本發(fā)明擴(kuò)增到的多形漢遜酵母菌HTRPl基因是5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶基因的編碼序列，HTRPl編碼的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶催化色氨酸合成途徑中N-(5'-磷酸核糖)-氨基苯甲酸向烯醇式1- (0-羧基苯氨基)-1-脫氧核酮糖-5-磷酸的轉(zhuǎn)化，因此HTRPl 基因被破壞后菌株不能合成色氨酸，產(chǎn)生色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷。2、HTRP1基因被破壞的重組DNA的構(gòu)建根據(jù)YEp352質(zhì)粒上URA3和IacZ基因序列，設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物 3 5' -TGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG-3‘(劃線部分為 HindIII 識(shí)別序列)引物 4 5‘ -ATCGTCGACTAACAAGAGCTTTTCAATTCATC-3‘(劃線部分為 SalI 識(shí)別序列)以質(zhì)粒YEp352為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增DNA片段 UZjPCR 反應(yīng)體系為模板 DNA 0. 6 μ g，引物 30. 5 μ mol/L，引物 40. 5 μ mol/L，pfu DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，設(shè)置 PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1次；94°C 30秒，1分鐘，72°C 2分鐘，四個(gè)循環(huán)； 940C 30秒，540C 1分鐘，72°C 15分鐘，循環(huán)1次。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物為約1. 3kb的DNA片段，與預(yù)期大小一致，將擴(kuò)增得到的DNA片段命名為UZ。用HindIII和Mil酶切PCR產(chǎn)物，回收約1. 3kb的UZ片段，同時(shí)用HindIII和 MlI酶切載體PUC18 (Takara公司)，回收載體大片段，將回收的載體大片段與回收的1. 3kb 的UZ片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PUC18的HindIII和MlI酶切位點(diǎn)間插入了 UZ片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將獲得的重組質(zhì)粒命名為P18UZ。合成引物，序列如下引物 5 -gcttgcagggtaccgagctcgaattctcctgcgagagcttcatgac-3‘，引物 6 -gtcatgaagctctcgcaggagaattcgagctcggtaccctgcaagc-3‘，引物 7 :5' -cgatcacgggcagatcgagaccgcatcaggcgccattcgcc-3‘，引物 8 :5' -ggcgaatggcgcctgatgcggtctcgatctgcccgtgatcg-3‘。以重組質(zhì)粒p352HTRP為模板，利用引物1和引物5進(jìn)行PCR擴(kuò)增HTRPl的5 ‘端約500bp的序列HTRP1-5 ‘，利用引物8和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增HTRPl的3 ‘端約500bp的序列HTRP1-3'；以重組質(zhì)粒pl8UZ為模板，利用引物6和引物7進(jìn)行PCR擴(kuò)增1. 5kb的ZUZ 片斷。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 0. 6yg，上游引物0. 5ymol/L，下游引物0. 5ymol/L，pfu DNA聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至50 μ L，混勻；用TECHNETC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1次；94°C 30秒，54°C 1分鐘，72°C 1分鐘，29 個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，54°C 1分鐘，72°C 15分鐘，循環(huán)1次。利用PCR清潔試劑盒純化回收上述三種PCR產(chǎn)物，然后將三種PCR產(chǎn)物等量混合，得到PCR產(chǎn)物混合物；以上述PCR產(chǎn)物混合物為模板，利用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為模板DNA 0.6yg，引物 10. 5 μ mol/L，引物 20. SymolA^Long-iTaq DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至 50 μ L， 混勻；用TECHNE TC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1 次；94°C 30 秒，540C 1 分鐘，72°C 3 分鐘，29 個(gè)循環(huán)；94°C 30 秒，54°C 1 分鐘，72°C 15 分鐘， 循環(huán)1次。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物有兩種，為大小分別為約1. 2kb和2. 5kb的DNA片段，序列分析表明約1. 2kb的小片段為HTRPl基因被破壞的重組DNA，該重組DNA是由179bp的IacZ 序列取代了 HTRPl基因中約60bp的序列形成的重組DNA，將該重組DNA命名為m_HTRPl，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。3、酵母菌遺傳轉(zhuǎn)化及尿嘧啶和色氨酸合成雙缺陷多形漢遜酵母菌的篩選將重組DNA 片段m-HTRPl 通過(guò)電轉(zhuǎn)化法(Bio-Rad Gene-Pulser 儀，1. 5kV,50y F, 200Q,3mSec)轉(zhuǎn)化尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-1ICGMCC No. 1218 (專利號(hào) ZL200410080517. 2)，在含有 90mg/l 色氨酸、0. 5g/l 2-氨基 ~5~ 氟苯甲酸(5-FAA)的YEPDS培養(yǎng)基(10g/l酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、182g/L山梨醇和 10g/L瓊脂粉)平板上篩選轉(zhuǎn)化子。將上述平板上長(zhǎng)出的單菌落分別接于無(wú)菌水中混勻，室溫靜置4小時(shí)，然后分別接種于酵母菌基本培養(yǎng)基YNB(10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L瓊脂粉) 平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，獲得在同時(shí)添加尿嘧啶和色氨酸的YNB平板上能夠正常生長(zhǎng)，而在YNB培養(yǎng)基、添加30mg/l尿嘧啶的YNB 平板和添加90mg/l色氨酸的YNB平板上不能生長(zhǎng)的菌株，將上述菌株在YEPD平板上劃線培養(yǎng)，每個(gè)菌株挑取20個(gè)單菌落分別置于無(wú)菌水中，室溫靜置4小時(shí)后，分別接種于上述不同的A、B、C和D篩選培養(yǎng)基平板上，對(duì)不同菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷特性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得尿嘧啶合成和色氨酸合成同時(shí)被阻斷的雙缺陷漢遜酵母菌株，記作雙缺陷重組酵母菌。用質(zhì)粒YEp352(帶有ScURA； )和p352HTRP (帶有HTRP1)共同轉(zhuǎn)化上述雙缺陷漢遜酵母菌株，轉(zhuǎn)化菌株能夠在不添加尿嘧啶和色氨酸的基本培養(yǎng)基YNB上生長(zhǎng)，說(shuō)明尿嘧啶合成缺陷可以被YEp352的&URA3互補(bǔ)、色氨酸合成缺陷可以被p352HTRP的HTRPl互補(bǔ)，從生物學(xué)功能上證明上述雙缺陷重組酵母菌(尿嘧啶和色氨酸雙缺陷菌)為HURA3和 HTRPl基因功能缺失的漢遜酵母菌。將雙缺陷重組酵母菌中的一株命名為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31。該多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31,已于2011年4月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4778。其菌落呈凸起狀、乳白色、有光澤、邊緣整齊，細(xì)胞呈橢圓形，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為37°C，pH 為 5. 5。二、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31 表型分析將上述步驟一構(gòu)建的尿嘧啶和色氨酸雙缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31與尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HU-Il分別接種于酵母菌基本培養(yǎng)基YNB平板(A)、添加30mg/ 1尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果表明多形漢遜酵母菌HUT-31 只能在同時(shí)添加尿嘧啶和色氨酸的YNB平板(D)上能夠正常生長(zhǎng)，而在YNB培養(yǎng)基(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板⑶和添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)上不能生長(zhǎng)；而多形漢遜酵母菌HU-Il可在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板⑶和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和 90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上正常生長(zhǎng)(圖1，圖1中a為HUT-31和HU-Il在YNB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況；圖1中b為HUT-31和HU-Il在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板上的生長(zhǎng)情況；圖1中c為HUT-31和HU-Il在添加90mg/l色氨酸的YNB平板上的生長(zhǎng)情況；圖1中 d為HUT-31和HU-Il在同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板上的生長(zhǎng)情況)。三、尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的生物學(xué)特性將尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31 CGMCC No. 4778和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-11CGMCC No. 1218分別接種于^iil YEPD液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；再按10% 接種量轉(zhuǎn)接于10ml YEPD液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；離心收集菌體細(xì)胞，將細(xì)胞用無(wú)菌水洗兩次，重懸于5ml無(wú)菌水中，再分別轉(zhuǎn)接于50ml YEPD液體培養(yǎng)基中和50ml YEPM (甲醇代替YEPD中的葡萄糖)液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)對(duì)小時(shí)，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌水洗一次，再次離心后，將收集的細(xì)胞沉淀稱重，計(jì)算其生物量。在以葡萄糖為碳源的YEPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)M小時(shí)，尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HU-Il和尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31的生物量分別為25. 8g/L和25. 4g/L ；以甲醇為碳源的YEPM培養(yǎng)基中，尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HU-11和尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31的生物量分別為23. 5g/L和22. 7g/L。因此尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HU-Il之間在細(xì)胞生長(zhǎng)特性方面沒(méi)有明顯差異，生長(zhǎng)較穩(wěn)定。四、尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31的遺傳穩(wěn)定性分析將上述步驟一構(gòu)建的尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31在YEPD液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10次，每次M小時(shí)；培養(yǎng)液經(jīng)IO7稀釋后，涂布于YEPD平板，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，隨機(jī)挑取100個(gè)單菌落分別置于2ml無(wú)菌水中， 在室溫下饑餓4-6小時(shí)；取饑餓后的菌液分別接種于酵母菌基本培養(yǎng)基YNB平板(A)、添加 30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果表明所有單菌落在同時(shí)添加尿嘧啶和色氨酸的YNB基本培養(yǎng)基(D)上都生長(zhǎng)，在添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、 添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和酵母菌基本培養(yǎng)基YNB平板(A)上則完全不能生長(zhǎng)， 證明本發(fā)明構(gòu)建的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31是一株遺傳穩(wěn)定的尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組菌株。實(shí)施例2、α -淀粉酶在多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31中的分泌表達(dá)一、α -淀粉酶基因ALPl表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)報(bào)道的扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera) α -淀粉酶基因 ALPl的核苷酸序列(GenBank Access No. X79051自5'末端第1530-3030位的脫氧核糖核苷酸所示的序列)設(shè)計(jì)引物，序列如下引物 9 5 ‘ -CCGAATTCAATATGCAAATTTCAAAAGC-3 ‘，(劃線部分堿基為 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn))；引物 10 :5' -CATTCTAGAGCCATCATGAACAAATGTCAG-3‘，(劃線部分為 XbaI 識(shí)別位點(diǎn))ο以扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No. 2. 16 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物保藏管理中心CGMCC)染色體DNA為模板，在引物9和引物10的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)體系為模板 DNA 0. 6 μ g，引物 90. 5 μ mol/L，引物 100. 5 μ mol/L，pfu DNA 聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至50 μ L，混勻；用TECHNETC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增， 設(shè)置PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1次；94°C 40秒，1分鐘，72 °C 2分鐘，四個(gè)循環(huán)；94°C 40秒，54°C 1分鐘，72°C 15分鐘，循環(huán)1次。將PCR產(chǎn)物回收并純化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明得到了大小約 1. 51Λ的DNA片段，與預(yù)期的大小一致，序列分析表明與文獻(xiàn)報(bào)道的序列完全一致，將其命名為ALPl。用EcoRI和XbaI酶切PCR產(chǎn)物，回收約1. 5kb的ALPl片段，同時(shí)用EcoRI和XbaI 酶切載體pMOXZ-alpha-A (專利申請(qǐng)?zhí)?00810101801. 1)，回收載體大片段，將回收的載體大片段與回收的1. 5kb的ALPl片段在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過(guò)^ocin抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)， 提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pMOXZ-alpha-A的EcoRI和)(baI酶切位點(diǎn)間插入了 ALPl片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將獲得的重組質(zhì)粒命名為ρΜΟΧΖ α -ALP。該質(zhì)粒的物理圖譜如圖2中A所示。依據(jù)載體pMOXZ-alpha-A中MOXp和A0X1TT序列設(shè)計(jì)引物，序列如下
引物 11 5 ‘ -TCATCGACGCGGAGAACGATCTCCT-3 ‘，引物 12 5 ‘ -ACTGCACAAACGAAGGTCTC-3 ‘。以重組質(zhì)粒ρΜΟΧΖα-ALP的DNA為模板，在引物11和引物12的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)體系為模板DNA 0. 6μ g，引物 110. 5ymol/L，引物 120. 5ymol/L，Long-Taq DNA聚合酶mix 25 μ L，用去離子水補(bǔ)至50 μ L，混勻；用TECHNE TC-3000PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，循環(huán)1次；94°C 40秒，1分鐘，72°C 3分鐘，四個(gè)循環(huán)；94°C 40秒，54°C 1分鐘，72°C 15分鐘，循環(huán)1次。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增到約3. 7kb的DNA片段，與預(yù)期大小一致，命名為MOXp- α ALP1-A0X1TT,序列分析表明其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中第1787位到3285位為α-淀粉酶基因ALP1，第1位到1517位為甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子ΜΟΧρ，第 3286位到3690位為醇氧化酶基因終止子Α0Χ1ΤΤ。純化回收約3. 7kb的PCR產(chǎn)物，并將其插入到載體YEp352的SmaI位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體YEp352的SmaI酶切位點(diǎn)插入了 MOXp- α ALP1-A0X1TT片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將獲得的重組質(zhì)粒命名為PMU α A(該質(zhì)粒的物理圖譜如圖2中B所示)。同時(shí)，將純化回收的約3. 7kb的PCR產(chǎn)物插入到載體P352HTRP的SmaI位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)， 提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體P352HTRP的SmaI酶切位點(diǎn)插入了 MOXp- α ALP1-A0X1TT片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將獲得的重組質(zhì)粒命名為ρΜΤ α Α(該質(zhì)粒的物理圖譜如圖2中C所示)。獲得的重組質(zhì)粒pMU α A和重組質(zhì)粒ρΜΤ α A均帶有表達(dá)框 MOXp- α ALP1-A0X1TT，其中重組質(zhì)粒pMU α A帶有ScURA3篩選標(biāo)記，重組質(zhì)粒ρΜΤ α A帶有 HTRPl篩選標(biāo)記。二、酵母遺傳轉(zhuǎn)化及重組漢遜酵母的構(gòu)建1、尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子用SacII酶切重組質(zhì)粒pMUa A使質(zhì)粒線性化。將線性化的質(zhì)粒pMU a A通過(guò)電轉(zhuǎn)化法(Bio-I ad Gene-Pulser 儀，1. 5kV，50y F，200Q，3n^ec)轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31，在含有90mg/l色氨酸的酵母菌基本培養(yǎng)基YNB (10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L瓊脂粉)平板上，通過(guò)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子，在該培養(yǎng)基上存活的重組酵母菌即為目的重組酵母菌(即尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子)。挑取多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子單菌落置于Iml無(wú)菌水中，在室溫條件下饑餓4-6小時(shí)，取饑餓后的菌液分別接種于酵母菌基本培養(yǎng)基YNB平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的 YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上，37°C培養(yǎng)48 小時(shí)，結(jié)果宿主菌HUT-31只能在同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶ 上生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化子單菌落可在添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板⑶上正常生長(zhǎng)，說(shuō)明重組質(zhì)粒pMU α A上的ScURA3互補(bǔ)了宿主菌HUT-31中的尿嘧啶合成缺陷。將宿主菌HUT-31和轉(zhuǎn)化菌分別接于10ml YPG培養(yǎng)基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml 酵母粉，lml/100ml甘油)中，37°C，200rpm培養(yǎng)20小時(shí)，離心收集細(xì)胞，無(wú)菌水洗兩次后， 細(xì)胞重懸于10ml YPM培養(yǎng)基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甲醇)中， 37°C，200rpm進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5ml/100ml。每 M小時(shí)取發(fā)酵液，通過(guò)3，5-二硝基水揚(yáng)酸法測(cè)定發(fā)酵液中α-淀粉酶活性(Miller幾， Glennon WE,Burton AL. Measurement of carboxymethylcellulase activity. Analytical Biochemistry, 1960, 2 :127-132)。在宿主菌發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到α-淀粉酶活性，但在轉(zhuǎn)化菌株中檢測(cè)到α-淀粉酶活性，誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后α-淀粉酶活性水平為2300IU/ L4600IU/L，其中上清液中的酶活力為總活力的91%。將發(fā)酵液中α-淀粉酶活性最高的
11轉(zhuǎn)化菌株命名為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUTA-I。2、色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子用SacII酶切重組質(zhì)粒ρΜΤ α A使質(zhì)粒線性化。將線性化的質(zhì)粒ρΜΤ α A通過(guò)電轉(zhuǎn)化法(Bio-Rad Gene-Pulser儀，1. 5kV，50 μ F，200 Ω，3n^ec)轉(zhuǎn)化上述構(gòu)建的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUTA-I，在酵母菌基本培養(yǎng)基 YNB(10g/L葡萄糖、7g/L Yeast Nitrogen Base和10g/L瓊脂粉)上，通過(guò)尿嘧啶和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子，在該培養(yǎng)基上存活的重組酵母菌即為目的重組酵母菌(即尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子)。分別挑取尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31、尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的多形漢遜酵母菌HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子單菌落置于 Iml無(wú)菌水中，在室溫條件下饑餓4-6小時(shí)，取饑餓后的菌液分別接種于酵母菌基本培養(yǎng)基 YNB平板(A)、添加30mg/l尿嘧啶的YNB平板(B)、添加90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D)上，37°C培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型多形漢遜酵母菌HUT-31只能在同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/ 1色氨酸的YNB平板(D)上生長(zhǎng)，尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的多形漢遜酵母菌HUTA-I可在添加 90mg/l色氨酸的YNB平板(C)和同時(shí)添加30mg/l尿嘧啶和90mg/l色氨酸的YNB平板(D) 上正常生長(zhǎng)，尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子在上述四種上述不同的A、B、C和D 培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)。說(shuō)明通過(guò)線性化重組質(zhì)粒PMU α A和重組質(zhì)粒ρΜΤ α A的遺傳轉(zhuǎn)化，使多形漢遜酵母菌HUT-31的尿嘧啶和色氨酸合成缺陷同時(shí)得到互補(bǔ)。按前述3，5-二硝基水揚(yáng)酸法測(cè)定多形漢遜酵母菌HUT-31、多形漢遜酵母菌 HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液中α -淀粉酶活性，在多形漢遜酵母菌HUT-31發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到α -淀粉酶活性，但在多形漢遜酵母菌HUTA-I和尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化菌株中均檢測(cè)到α-淀粉酶活性。誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后，多形漢遜酵母菌HUTA-I發(fā)酵液中α -淀粉酶活性水平為^30IU/L，尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液中的α-淀粉酶活力為2710IU/L-3060IU/L。將發(fā)酵液中 α-淀粉酶活性最高的尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化菌株命名為多形漢遜酵母菌 (Hansenula polymorpha)HP-A-1。三、表達(dá)淀粉酶的不同重組漢遜酵母產(chǎn)酶特性比較將多形漢遜酵母菌HUTA-I和多形漢遜酵母菌HP-A-I分別接于10ml YPG培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集細(xì)胞，無(wú)菌水洗兩次后，細(xì)胞重懸于IOmlYPM培養(yǎng)基中，按10%接種量轉(zhuǎn)接到裝有45ml YPM培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C，200rpm進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)96小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5ml/100ml。每12小時(shí)取發(fā)酵液，按前述 3. 5-二硝基水揚(yáng)酸法測(cè)定α-淀粉酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。結(jié)果多形漢遜酵母菌HUTA-I 和多形漢遜酵母菌HP-A-I均在誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后α -淀粉酶活性達(dá)到最高，而且在整個(gè)檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)，多形漢遜酵母菌HP-A-I發(fā)酵液中的α -淀粉酶活性均高于多形漢遜酵母菌HUTA-I，而兩菌株細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，生物量沒(méi)有明顯差異(圖3)。
權(quán)利要求
1.尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenulapolymorpha) HUT-31，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4778。
2.一種尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型基因工程酵母菌，為將尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶編碼基因的功能喪失，得到的重組菌即為尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型基因工程酵母菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程酵母菌，其特征在于所述將尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構(gòu)酶編碼基因的功能喪失是通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)的；所述尿嘧啶合成缺陷型酵母菌為多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HU-IICGMCC No. 1218。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因工程酵母菌，其特征在于所述同源重組的方法包括如下步驟向多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-Il中導(dǎo)入序列表中序列2所示的DNA。
5.一種表達(dá)外源蛋白的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或權(quán)利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌和酵母表達(dá)載體，所述酵母表達(dá)載體為如下1)和/或2、所示1)滿足如下條件的酵母表達(dá)載體I將所述酵母表達(dá)載體I轉(zhuǎn)入權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或權(quán)利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能夠合成尿嘧啶；2)滿足如下條件的酵母表達(dá)載體II將所述酵母表達(dá)載體II轉(zhuǎn)入權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUT-31或權(quán)利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能夠合成色氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述酵母表達(dá)載體I按照如下方法制備在載體YEp352的多克隆位點(diǎn)上插入由甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子ΜΟΧρ、外源蛋白編碼基因和醇氧化酶基因終止子AOXlTT依次連接而成的表達(dá)盒得到的酵母表達(dá)載體；所述酵母表達(dá)載體II按照如下方法制備在載體P352HTRP的多克隆位點(diǎn)上插入由甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子ΜΟΧρ、外源蛋白編碼基因和醇氧化酶基因終止子AOXlTT依次連接而成的表達(dá)盒得到的酵母表達(dá)載體；所述甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子MOXp的核苷酸序列如序列表中序列3第1位到1517位所示；所述醇氧化酶基因終止子AOXlTT的核苷酸序列如序列表中序列3第3286位到3690 位所示；所述載體P352HTRP按照如下方法制備將序列表中序列1所示的DNA序列插入表達(dá)載體ΥΕρ352的MuI和NdeI酶切位點(diǎn)得到的重組載體。
7.權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌(Hansenulapolymorpha) HUT-31或權(quán)利要求2_4 中任一所述基因工程酵母菌在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用；或權(quán)利要求5所述試劑盒在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
8.—種表達(dá)外源蛋白的方法，包括如下步驟1)將外源蛋白的編碼基因通過(guò)酵母表達(dá)載體導(dǎo)入權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母菌 (Hansenula polymorpha) HUT-31或權(quán)利要求2_4中任一所述基因工程酵母菌中，得到重組酵母菌；2)用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組酵母菌，得到存活的重組酵母菌；3)培養(yǎng)所述存活的重組酵母菌，得到所述外源蛋白；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體I時(shí)，所述步驟幻中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有尿嘧啶但含有色氨酸；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體II時(shí)，所述步驟幻中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有色氨酸但含有尿嘧啶；所述步驟1)中的酵母表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體I和酵母表達(dá)載體II時(shí)，所述步驟2) 中的篩選培養(yǎng)基為培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，且其中不含有色氨酸也不含有尿嘧啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為酵母菌基本培養(yǎng)基YNB。
10.一種DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有雙重篩選標(biāo)記的多形漢遜酵母菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的具有雙重篩選標(biāo)記的多形漢遜酵母為尿嘧啶合成和色氨酸合成雙缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31，其保藏號(hào)為CGMCC No.4778。該菌株同時(shí)具有尿嘧啶和色氨酸雙營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重組菌株的培養(yǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)，不但可以簡(jiǎn)單快速篩選到重組菌株，而且雙重篩選標(biāo)記可以提高目標(biāo)基因在染色體上整合的拷貝數(shù)，提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)雙重篩選標(biāo)記也將用于漢遜酵母功能基因組學(xué)、合成生物學(xué)及代謝工程的多基因遺傳修飾。
文檔編號(hào)C12N1/16GK102226154SQ20111012227
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者何秀萍, 張博潤(rùn), 郭雪娜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所