一種在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的構建與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及構建基于甲醇營養(yǎng)型漢遜酵母和畢赤酵母的通用載體，其構建方法包括如下步驟：步驟（1），用限制性內(nèi)切酶 Bgl Ⅱ和 Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP，得到pHan載體；步驟（2），用限制性內(nèi)切酶 Bgl Ⅱ和 Bam HⅠ雙酶切消化載體質(zhì)粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段PAOX1-HPV16L1-CYC1TT后與步驟（1）所得pHan載體以T4連接酶16℃連接過夜，轉化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanAOX1-HPV16L1。本發(fā)明使用上述通用載體指導了人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1在畢赤酵母和漢遜酵母中的表達。
【專利說明】一種在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載 體的構建與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及構建基于甲醇營養(yǎng)型漢遜酵母和畢赤酵 母的通用載體，通過考察漢遜酵母核糖體DNA和自主復制序列以及畢赤酵母醇氧化酶1型 啟動子、翻譯延伸因子l-α啟動子，和漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子在穿梭載體中的作用， 構建基于漢遜酵母核糖體DNA以及畢赤酵母啟動子的能于漢遜酵母和畢赤酵母中穿梭表 達的通用載體的方法。

【背景技術】
[0002] 甲醇營養(yǎng)型酵母畢赤酵母和漢遜酵母是兩個異源蛋白表達宿主系統(tǒng)。它們不僅具 有分泌效率高和翻譯后蛋白修飾的真核表達系統(tǒng)特點，并且還具備基因操作容易、在簡單 培養(yǎng)基中快速生長以及不產(chǎn)生內(nèi)毒素和病毒DNAs的優(yōu)勢。這兩個宿主系統(tǒng)均具有細胞生 長高密和蛋白高產(chǎn)量的特點，因此適合于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白。
[0003] 近些年，由于漢遜酵母所具備的的優(yōu)勢特性，如生長溫度高、生長速率快、蛋白表 達高效，已成為國際上公認的理想的外源基因表達系統(tǒng)之一。在漢遜酵母中，外源DNA整合 于酵母染色體基因組中，隨染色體有絲分裂而復制，穩(wěn)定存在于染色體上，因此異源蛋白獲 得在宿主內(nèi)的穩(wěn)定表達。這種整合可以是同源重組整合或隨機整合。在同源重組中，引入 的外源DNA序列必須與漢遜酵母基因組具有同源序列，而由于重組方式和重組位點的不同 將會導致重組轉化子性質(zhì)相異。為了使重組蛋白穩(wěn)定而高效地表達，重組質(zhì)粒必須高拷貝 地整合入酵母基因組中。在漢遜酵母中，高拷貝的基因組整合質(zhì)?？梢酝ㄟ^高頻率的同源 或非同源重組的方式獲得。
[0004] 核糖體DNA序列已成功介導了重組質(zhì)粒在廣泛的異源宿主系統(tǒng)中的整合。而這樣 的整合主要得益于核糖體DNA保守的結構以及在基因組一個或多個位點上頭尾相接的串 聯(lián)重復排列模式。核糖體DNA重復排列的數(shù)目和長度在不同的種屬里變化很大。在漢遜酵 母中一個8. Ik堿基對長的單元可以在單一染色體基因組上具有50至60個拷貝。而漢遜酵 母核糖體DNA的組成和順序同釀酒酵母中的核糖體DNA單元非常相似。每一個核糖體DNA 單元均由以下幾個元件順序構成，分別是非轉錄間隔區(qū)l，5SrRNA，非轉錄間隔區(qū)2,35S前 體序列，外部轉錄間隔區(qū)，18S，5.8S和25S rRNA序列。這樣的保守性給漢遜酵母提供了一 個基于核糖體DNA的表達平臺，擴大了漢遜質(zhì)粒在不同酵母宿主間指導蛋白表達的能力， 例如植酸酶酵母。在植酸酶酵母中，核糖體DNA靶向的載體能夠共整合多達3個不同的表 達質(zhì)粒，而這僅僅只通過一次轉化步驟。
[0005] 除了漢遜酵母核糖體DNA外，先前的研宄顯示漢遜酵母自主復制序列也可用于外 源基因的高拷貝整合。自主復制序列又稱為復制起點序列，作為順式作用元件，是真核生物 中一類能啟動DNA復制的序列，是染色體正常起始復制所必需的。自主復制序列DNA具有 一段富含AT的200個堿基對的保守序列，真核生物染色體上有多個自主復制序列。在漢遜 酵母中，攜帶有漢遜酵母自主復制序列的質(zhì)粒可以高效地轉化漢遜酵母，并且可以在體外 以自我復制的形式游離穩(wěn)定存在。
[0006] 相比于漢遜酵母而言，畢赤酵母較難獲得高拷貝的整合，而這樣高拷貝的整合發(fā) 生的幾率僅僅為1%。
[0007] 畢赤酵母和漢遜酵母均為甲醇營養(yǎng)型酵母。它們使用甲醇作為唯一的碳源用于異 源蛋白的表達，并且分別受到嚴格的甲醇調(diào)控啟動子醇氧化酶1型啟動子和甲醇氧化酶啟 動子的調(diào)控。兩個啟動子均是較強的啟動子并且在兩個宿主表達系統(tǒng)中均應用廣泛。兩 個啟動子均具有相同的調(diào)控機制。當酵母細胞在抑制性碳源，如葡萄糖、甘油和乙醇中生 長時，醇氧化酶1型啟動子在畢赤酵母中同甲醇氧化酶啟動子在漢遜酵母中一樣均沒有活 性；當去除了抑制性碳源加入甲醇后，兩個啟動子均能被強烈地誘導，顯示出較高的活性。
[0008] 與誘導型啟動子比起來，由于不需要誘導并且容易操作，組成型啟動子在指導異 源蛋白表達上得到了廣泛的應用。畢赤酵母翻譯延伸因子l-α啟動子是近年發(fā)現(xiàn)的較強 的組成型啟動子。翻譯延伸因子l-α啟動子可以使用廣泛的碳源對異源蛋白的表達進行 調(diào)控，碳源如葡萄糖、甘油、甲醇和其它碳源，而指導異源蛋白表達顯示出了生長相關的調(diào) 控模式。使用植酸酶酵母的翻譯延伸因子l-α啟動子成功指導了綠色熒光蛋白在漢遜酵 母中的表達，而畢赤酵母翻譯延伸因子l-α啟動子在漢遜酵母中的應用卻還沒有報道。但 畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子也早已在漢遜酵母中應用，如使用畢赤酵母醇氧化酶1型啟 動子在漢遜酵母中表達轉化酶可達1克每升的產(chǎn)量。
[0009] 畢赤酵母及漢遜酵母都是目前應用廣泛的表達系統(tǒng)，一個異源蛋白的高效表達往 往與宿主細胞的遺傳背景密切相關，很難保證一個宿主系統(tǒng)對所有的異源蛋白的表達都是 必要的，因此，經(jīng)常需要在多個系統(tǒng)中進行表達優(yōu)化的嘗試。本發(fā)明致力于構建一個通用型 的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，以實現(xiàn)異源蛋白在畢赤酵母及漢遜酵母中的穿梭應用。而該通用質(zhì)粒載 體則主要是基于漢遜酵母的核糖體DN A元件以及畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一個在畢赤酵母和漢遜酵母中 穿梭表達異源蛋白的方法，通過基于漢遜酵母核糖體DNA和畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子 的通用載體實現(xiàn)。
[0011] 本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0012] 一種在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的構建方法，包括如 下步驟：
[0013] 步驟（1)，用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP，得到pHan 載體；
[0014] 步驟（2)，用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切消化載體質(zhì)粒pPinkAO X1-HPV16L1，回收片段？_1-即￥161^1-0￥(：11'1'后與步驟（1)所得pHan載體以T4連接酶16°C 連接過夜，轉化并涂布含〇. lmg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組漢遜 酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll，該質(zhì)粒即為通用載體。
[0015] 上述技術方案中，所述的步驟（1)中的酶切反應體系為質(zhì)粒pHanMOX-GF P 0· 25 μ g/ μ 1 20 微升，Bgl II 1 微升，BamH I 1 微升，IOXK buffer 5 微升，雙蒸水 23 微 升。
[0016] 上述技術方案中，所述的步驟⑵中的酶切反應體系為質(zhì)粒pPinkAOXl-H PV16L10. 35 μ g/μ 1 20 微升，Bgl II 1 微升，BamH I 1 微升，10 X K buffer 5 微升，雙蒸水 23微升。
[0017] 上述技術方案中，所述的連接反應體系為PAQX1-HPV16L1-CYC1TT片段2微升，PHan 載體1. 26微升，10 X T4buffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水5. 24微升；其中，所述的 PAQX1-HPV16L1-CYC1TT片段與pHan載體的連接摩爾濃度比為1:3。片段與載體的具體濃度 沒有要求，只要片段和載體摩爾濃度比為1:3即可，本發(fā)明其他地方亦同。
[0018] 上述技術方案中，所述的含0. lmg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物質(zhì)：每升含胰 蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化鈉10克和瓊脂粉15克；還包括終濃度為0. lmg/mL的 卡那霉素。
[0019] 上述技術方案中，所述的提取質(zhì)粒酶切鑒定的具體操作方法為，質(zhì)粒pHan A0X1-HPV16L1用限制性內(nèi)切酶Sac I于37°C水浴鍋中酶切1小時候，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳后，顯示于2470個堿基長度的地方有一條帶則表明質(zhì)粒構建正確，其中酶切鑒定反 應體系為 ：質(zhì)?？谒?^(?1-即￥161^10.36 48/^12微升，53(3 10.2微升，10\1^131^€61'1 微升，雙蒸水6. 8微升。
[0020] 上述構建的重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl_HPV16Ll在指導人乳頭瘤病毒16型主要 衣殼蛋白Ll表達中的應用。
[0021] 重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll轉化畢赤酵母和漢遜酵母來指導人乳頭瘤 病毒16型主要衣殼蛋白Ll表達，具體方法為：重組漢遜酵母質(zhì)粒pHa nA0Xl-HPV16Ll經(jīng)限 制性內(nèi)切酶Afl II消化后轉化畢赤酵母，重組克隆子經(jīng)過無博來霉素加壓的連續(xù)培養(yǎng)后再 經(jīng)博來霉素加壓篩選的過程，隨機挑取6個單克隆重組子經(jīng)甲醇誘導表達人乳頭瘤病毒16 型主要衣殼蛋白Ll蛋白。
[0022] 指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll的表達方法為：
[0023] 漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll經(jīng)Af I II線性化后電轉化畢赤酵母 Pink?Strain I及漢遜酵母細胞，涂布含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板， 分別于30°C和37°C培養(yǎng)；待菌落長出后，分別從四個平板上各挑取3個菌落進行非抗性壓 力下的連續(xù)傳代，共重復轉接培養(yǎng)5次，將第六次轉接培養(yǎng)24小時后的菌液于含0. 2mg/mL 博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板劃線，培養(yǎng)后分別隨機挑取各平板上的6個菌落進行 誘導表達，誘導24小時后的酵母培養(yǎng)物進行蛋白免疫印跡檢測人乳頭瘤病毒16型主要衣 殼蛋白Ll的表達。
[0024] 本發(fā)明的作用機理及研宄過程：
[0025] 首先本發(fā)明考察了漢遜酵母核糖體DNA和自主復制序列元件在介導重組質(zhì)粒在 漢遜酵母和畢赤酵母中的轉化效率的研宄。3個漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanM OX-GFP (包含有 漢遜酵母核糖體DNA和自主復制序列元件）、pHanMOX-rDNA (僅包含有漢遜酵母核糖體序 列）、pHanMOX-HARS(僅包含有漢遜酵母自主復制序列）經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Afl II消化后分 別轉化漢遜酵母和畢赤酵母。轉化效率使用每微克線性化DNA轉化后所產(chǎn)生的克隆形成單 位來表示，見圖1。重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanMOX-GFP在漢遜酵母中的轉化效率較其在畢赤酵 母中高，重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanMOX-rDNA無論是在漢遜酵母中還是畢赤酵母中均同重組 漢遜酵母質(zhì)粒PHanMOX-GFP -樣，并且均顯著高于質(zhì)粒pHanMOX-HARS在漢遜酵母中的轉化 效率（大約20至30倍），然而質(zhì)粒pHanMOX-HARS在畢赤酵母中的轉化效率幾乎為零。結 果表明，漢遜酵母核糖體DNA在漢遜酵母本身中介導了比漢遜酵母自主復制序列高的轉化 效率；而在畢赤酵母中漢遜酵母核糖體DNA盡管也介導了轉化，但轉化效率卻低很多。相比 之下，漢遜酵母自主復制序列則不能夠介導質(zhì)粒在畢赤酵母中的轉化，表明漢遜酵母自主 復制序列在畢赤酵母中不具備以體外游離質(zhì)粒自主復制形式存在的能力，并且漢遜酵母自 主復制序列也不能夠介導在畢赤酵母中有效的整合。.
[0026] 線性化質(zhì)粒在同源重組事件和質(zhì)粒整合至染色體基因組中具有重要的意義。但實 際上，線性化的質(zhì)粒具備再環(huán)化的潛力，并且再環(huán)化的質(zhì)粒對轉化效率會產(chǎn)生影響。
[0027] 堿性磷酸酶在人體內(nèi)臟中廣泛分布。堿性磷酸酶是一種重要的分子生物學酶工 具。堿性磷酸酶可以去除脫氧核苷酸5'末端的磷酸基團，從而阻止了脫氧核苷酸5'末端 和3'末端的連接，因此脫氧核苷酸處于抑制狀態(tài)，能夠保持線性化的形式。
[0028] 為了考察質(zhì)粒再環(huán)化對含有漢遜酵母核糖體DNA和/或者漢遜酵母自主復制序列 元件的重組質(zhì)粒轉化漢遜酵母和畢赤酵母的轉化效率的影響，線性化的質(zhì)粒pHanMOX-GFP， pHanMOX-rDNA，和pHanMOX-HARS在轉化前分別經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理和未處理。結果 表明，在畢赤酵母中，相比于經(jīng)過牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒，牛小腸堿性磷酸酶未處 理的重組質(zhì)粒PHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA具有較高的轉化效率。經(jīng)過牛小腸堿性磷 酸酶處理的質(zhì)粒導致質(zhì)粒在體內(nèi)不能夠再環(huán)化，降低了轉化效率，見圖2A。然而重組質(zhì)粒 pHanMOX-HARS在轉化板上沒有克隆產(chǎn)生。在漢遜酵母中，經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒 HanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA比未經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒具有較高的轉化效率， 而牛小腸堿性磷酸酶未處理的重組質(zhì)粒pHanMOX-HARS的轉化效率卻略高于經(jīng)牛小腸堿性 磷酸酶處理的質(zhì)粒，結果見圖2B。結果表明，線性化對于重組質(zhì)粒在漢遜酵母中的轉化效率 起到重要的作用，再環(huán)化可能會阻礙質(zhì)粒整合至染色體基因組中；而在畢赤酵母中，轉化質(zhì) ?？赡芤杂坞x形式存在于基因組外，因此再環(huán)化對于漢遜酵母核糖體DNA介導的重組質(zhì)粒 在畢赤酵母中的轉化效率影響較顯著。
[0029] 以上轉化實驗的結果表明漢遜酵母核糖體DNA介導的質(zhì)粒在畢赤酵母中的轉化 效率不高，但仍能指導異源蛋白的表達。因此我們以綠色熒光蛋白作為報告基因，使用漢遜 酵母核糖體DNA介導的質(zhì)粒，在畢赤酵母中指導綠色熒光蛋白的表達。
[0030] 漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanMOX-GFP轉化畢赤酵母PichiaPink ?Strain I感受態(tài)細 胞，隨機挑取克隆進行表達。結果顯示10%的克隆能指導綠色熒光蛋白表達，表明漢遜酵母 甲醇氧化酶啟動子能夠在畢赤酵母中工作，而漢遜酵母核糖體DNA未能介導質(zhì)粒在畢赤酵 母基因組中有效的整合。
[0031] 為了在畢赤酵母中獲得整合的重組子，采用兩種方法篩選高表達克隆。一種就是 采用博來霉素不斷加壓篩選，另一種則是經(jīng)過無博來霉素壓力連續(xù)傳代后再經(jīng)過博來霉素 加壓篩選。結果表明經(jīng)過一系列不同濃度博來霉素抗生素加壓篩選后，在不同濃度抗生素 平板上單克隆的數(shù)目并沒有變化（見圖3)，隨機挑取不同抗生素濃度平板上的克隆進行表 達，綠色熒光蛋白的表達強度在不同濃度加壓篩選下沒有區(qū)別，見圖4A。相比之下，經(jīng)過無 博來霉素壓力連續(xù)傳代后，綠色熒光蛋白的表達強度顯著提高，見圖4B。
[0032] 以上結論表明漢遜酵母核糖體DNA介導的質(zhì)粒在畢赤酵母中的轉化，可能以游離 復制的形式存在于染色體基因組外。這些質(zhì)粒不能在擴增的細胞中穩(wěn)定存在，在沒有抗生 素加壓的連續(xù)的細胞增殖和有絲分裂過程中維持幾代后便漸漸丟失，而只有整合至染色體 基因組中的質(zhì)粒，由于可能發(fā)生的同源或非同源重組事件，因而再經(jīng)過博來霉素加壓篩選 后能穩(wěn)定存在并且有效地指導異源蛋白的表達。
[0033] 至此我們已建立了以漢遜酵母核糖體DNA介導的重組質(zhì)粒在畢赤酵母中有效的 整合方法，并且通過此方法可以篩選到高表達的克隆。
[0034] 然而作為基因的一部分，啟動子控制著基因表達的起始和表達的程度。因此對于 一個穿梭載體而言，一個通用的強的啟動子是必不可少的。于是我們考察了畢赤酵母醇氧 化酶1型啟動子、翻譯延伸因子1-α啟動子和漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子分別在畢赤酵母 和漢遜酵母中指導蛋白表達的能力。
[0035] 畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子是一個廣泛使用的強的甲醇調(diào)控啟動子。醇氧化酶 催化甲醇代謝的第一步反應，將甲醇轉化為甲醛。低聚物黃素酶對甲醇和氧氣的親和性較 低，需要大量的醇氧化酶維持細胞在甲醇中的生長，因此醇氧化酶的含量占到了細胞中總 mRNA的5%和總可溶性蛋白的30%。醇氧化酶在抑制性碳源中沒有活性，如葡萄糖、甘油和 乙醇，這種嚴格的調(diào)控是在轉錄水平上進行的。
[0036] 畢赤酵母翻譯延伸因子l-α啟動子是目前應用比較廣泛的組成型啟動子。翻譯 延伸因子l-α是真核翻譯機械的主要組成部分，介導了氨酰tRNA轉移至核糖體上維持肽 鏈的延伸。畢赤酵母翻譯延伸因子l-α啟動子具有很強的生長相關特性，是一個適合于異 源蛋白表達的強的組成型啟動子。
[0037] 漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子是漢遜酵母中應用最為廣泛的甲醇誘導型啟動子。當 細胞生長在甲醇、甘油或是山梨醇培養(yǎng)基中，甲醇氧化酶基因能被強烈地激活，而當細胞生 長在葡萄糖或是乙醇培養(yǎng)基中，甲醇氧化酶啟動子不具備活性。
[0038] 首先我們考察了上述三個啟動子，即醇氧化酶1型、翻譯延伸因子l-α和甲醇氧 化酶啟動子能否在畢赤酵母中工作?；诋叧嘟湍纲|(zhì)粒pPink-LC改造的重組畢赤酵母質(zhì) 粒pPinkAOXl-GFP，pPinkTEFl-GFP和pPinkMOX-GFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶Spe I消化后分別轉 化畢赤酵母PichiaPink?Strain I，隨機挑取重組克隆子表達綠色熒光蛋白，結果顯示三 個啟動子均能夠在畢赤酵母中工作，并能指導綠色熒光蛋白的表達，見圖5A。
[0039] 其次我們考察了上述三個啟動子能否在漢遜酵母中工作?；跐h遜酵母質(zhì)粒改造 的重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanAOXl-GFP，pHanTEFl-GFP和pHanMOX-GFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶Af I II 消化后轉化漢遜酵母。結果顯示，三個啟動子均能在漢遜酵母中工作，其中畢赤酵母醇氧化 酶1型啟動子指導綠色熒光蛋白表達的強度同漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子一致，而畢赤酵 母翻譯延伸因子l-α啟動子則弱于以上兩個啟動子，見圖5B。
[0040] 此外，之前的研宄發(fā)現(xiàn)畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子在漢遜酵母中具有很強的滲 漏表達，這同漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子一致。醇氧化酶1型啟動子和甲醇氧化酶啟動子 二者在畢赤酵母和漢遜酵母中的表達能力顯示兩者均可用于構建穿梭質(zhì)粒，結合先前的研 宄結果表明畢赤酵母和漢遜酵母啟動子以及漢遜酵母的整合元件均可以用于從宿主的基 因背景出發(fā)進行通用穿梭載體的優(yōu)化表達。
[0041] 根據(jù)上述研宄成果，我們使用構建的穿梭質(zhì)粒用于人乳頭瘤病毒16型主要衣殼 蛋白Ll的表達應用。人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll是目前主要的對抗人乳頭瘤病毒 感染的預防性商業(yè)化疫苗的主要抗原。因此作為我們本研宄的模式蛋白，人乳頭瘤病毒16 型主要衣殼蛋白LI在畢赤酵母和漢遜酵母中的表達被用于基于漢遜酵母核糖體DNA和畢 赤酵母醇氧化酶1型啟動子的通用載體的功能研宄。重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Afl II消化后轉化畢赤酵母，重組克隆子經(jīng)過無博來霉素加壓的連續(xù)培養(yǎng) 后再經(jīng)博來霉素加壓篩選的過程，隨機挑取6個單克隆重組子經(jīng)甲醇誘導表達人乳頭瘤病 毒16型主要衣殼蛋白Ll。蛋白免疫印跡結果顯示，重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll無 論是轉化畢赤酵母還是漢遜酵母均能成功地表達了人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1， 見圖6。
[0042] 本發(fā)明的作用機理及研宄過程的具體操作步驟在【具體實施方式】中有相應的說明。
[0043] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果為：
[0044] 一.本發(fā)明主要提供一種用于異源蛋白表達的通用載體在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母 和漢遜酵母中的應用方法。
[0045] 二.其次本發(fā)明通過使用包含有漢遜酵母核糖體DNA和/或者自主復制序列的漢 遜酵母重組質(zhì)粒轉化漢遜酵母和畢赤酵母，發(fā)現(xiàn)漢遜酵母核糖體DNA能夠有效地介導重組 質(zhì)粒在漢遜酵母本身中的轉化，同時也能介導其在畢赤酵母中的轉化。
[0046] 三.本發(fā)明通過使用綠色熒光蛋白作為報告基因，經(jīng)過無博來霉素壓力的連續(xù)傳 代后再經(jīng)過博來霉素的加壓篩選過程，使得含有漢遜酵母核糖體DNA的漢遜酵母重組質(zhì)粒 PHanMOX-GFP能夠介導其在畢赤酵母基因組中穩(wěn)定的整合并且能很好地指導綠色熒光蛋白 的表達。
[0047] 四.本發(fā)明表明畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子和翻譯延伸因子l-α啟動子以及 漢遜酵母甲醇氧化酶啟動子均能在畢赤酵母和漢遜酵母兩個宿主表達系統(tǒng)中很好地工作。
[0048] 五.本發(fā)明成功
[0049] 使用基于漢遜酵母核糖體DNA和畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子的通用載體指導了 人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll在畢赤酵母和漢遜酵母中的表達。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖 1 為漢遜酵母重組質(zhì)粒 pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA、pHanMOX-H ARS 轉化畢赤 酵母和漢遜酵母轉化效率比較；其中，A.漢遜酵母重組質(zhì)粒pHa nMOX-GFP轉化漢遜酵母和 畢赤酵母，B.漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS轉化漢遜酵母C.漢遜酵 母重組質(zhì)粒pHanMOX-rDNA和pH anMOX-HARS轉化畢赤酵母；數(shù)據(jù)以每微克線性化DNA轉化 后所產(chǎn)生的克隆形成單位表示，每次轉化獨立進行三次平行實驗；
[0051] 圖 2 為漢遜酵母重組質(zhì)粒 pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA、pHanMOX-H ARS 經(jīng)牛小腸 堿性磷酸酶處理和未處理轉化畢赤酵母和漢遜酵母的轉化效率比較;A.重組質(zhì)粒轉化畢 赤酵母克隆數(shù)B.重組質(zhì)粒轉化漢遜酵母克隆數(shù)；數(shù)據(jù)以每微克線性化DNA轉化后所產(chǎn)生的 克隆形成單位表示，每次轉化獨立進行三次平行實驗；
[0052] 圖3為漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanMOX-GFP重組菌在不同濃度博來霉素的酵母浸出粉 胨葡萄糖平板上的生長情況；其中，A為0. 2mg/mL博來霉素；B為0. 5mg/mL博來霉素；C為 lmg/mL博來霉素；
[0053] 圖4為漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanMOX-GFP轉化畢赤酵母后在博來霉素加壓篩選和 無博來霉素加壓連續(xù)傳代下綠色熒光蛋白的表達情況;A為轉化重組子在一系列不同濃度 博來霉素壓力篩選下表達綠色熒光蛋白；I :〇. 2mg/mL博來霉素；2 :0. 5mg/mL博來霉素；3 : lmg/mL博來霉素 B為轉化重組子經(jīng)過無博來霉素壓力連續(xù)傳代后再經(jīng)過博來霉素加壓篩 選表達綠色熒光蛋白；4 :第一次傳代；5 :第二次傳代；6 :第三次傳代；
[0054] 圖5為畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子和翻譯延伸因子l-α啟動子以及漢遜 酵母甲醇氧化酶啟動子指導綠色熒光蛋白在畢赤酵母和漢遜酵母中的表達;A為畢赤酵 母重組質(zhì)粒pPinkAOXl-GFP、pPinkTEF-GFP、pPinkMOX-GFP介導綠色熒光蛋白在畢赤酵 母細胞中的表達；1 :重組質(zhì)粒PPinkAOXl-GFP ;2 :重組質(zhì)粒pPinkTEFl-GFP ;3 :重組質(zhì) 粒 pPinkMOX-GFP ;B 為漢遜酵母重組質(zhì)粒 pHanAOXl-GFP、pHanTEFl-GFP、pHanMOX-GFP 介導綠色熒光蛋白在漢遜酵母細胞中的表達；4 :重組質(zhì)粒pHanAOXl-GFP ;5 :重組質(zhì)粒 pHanTEFl-GFP ;6 :重組質(zhì)粒 pHanMOX-GFP ;
[0055] 圖6為重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl_HPV16Ll介導的人乳頭瘤病毒16型主 要衣殼蛋白Ll在畢赤酵母和漢遜酵母中表達情況的蛋白免疫印跡；上欄為重組質(zhì)粒 pHanA0Xl-HPV16Ll介導的人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll在畢赤酵母中的表達；下欄 為重組質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll介導的人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll在漢遜酵母中 的表達；數(shù)字1?6代表不同重組克隆子。

【具體實施方式】
[0056] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0057] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā) 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件 或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0058] 本發(fā)明中各種限制性內(nèi)切酶、buffer緩沖液、T4連接酶還有PCR的各種試劑均是 購自于Takara?，中文名：寶生物工程（大連）有限公司的。
[0059] 離心機的型號為Sorvall ST 16R Centrifuge，廠家：賽默飛世爾科技（中國）有 限公司，文中離心沒有以r/min來規(guī)定離心速度，而是采用離心力來表示的。
[0060] 材料與方法
[0061] 菌株與質(zhì)粒
[0062] 畢赤酵母細胞系PichiaPink?Strain I (Invitrogen?)用作蛋白表達宿主菌，漢 遜酵母菌株購自美國菌種典藏中心（ATCC)，也用作蛋白表達宿主菌。
[0063] 大腸桿菌DH5 a (Takara?)用作表達載體構建中的克隆宿主。
[0064] 畢赤酵母質(zhì)粒pPink-LC (Invitrogen?)和Ptefi-pM D 1 8-T用于畢赤酵母重組 質(zhì)粒構建。
[0065] 畢赤酵母重組質(zhì)粒pPinkA0Xl_HPV16Ll用于漢遜酵母重組質(zhì)粒構建。
[0066] 漢遜酵母原始質(zhì)粒pHanMOX-GFP和pRMHP2. 1用于漢遜酵母重組質(zhì)粒構建。
[0067] 質(zhì)粒pThioHisA (Invitrogen?)用于漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanMOX-HARS構建。
[0068] 質(zhì)粒p⑶NA3-GFP用于綠色熒光蛋白的核苷酸片段擴增。
[0069] 畢赤酵母改造表達質(zhì)粒為 pPinkAOXl-GFP、pPinkTEFl-GFP、pPinkMOX-GFP，漢 遜酵母改造表達質(zhì)粒為 pHanMOX-rDNA、pHanMOX-HARS、pHanAO XI-GFP、pHanTEFI-GFP、 pHanA0Xl-HPV16Ll〇
[0070] 巴斯德畢赤酵母和漢遜酵母的轉化：
[0071] 巴斯德畢赤酵母的轉化采用電轉化的方法。電轉化感受態(tài)細胞的制備依據(jù) 畢赤酵母PichiaPink?表達系統(tǒng)表達手冊制備。制備方法如下：取少部分畢赤酵母 PichiaPinkTMStrain I甘油菌劃酵母浸出粉胨葡萄糖復合培養(yǎng)基瓊脂平板，于30°C培養(yǎng) 3-5天。挑取單菌落于裝有10毫升酵母浸出粉胨葡萄糖的125毫升三角瓶中，30°C、280r/ min培養(yǎng)24小時后，取部分過夜菌液加入到裝有100毫升酵母浸出粉胨葡萄糖的1升三 角瓶中，調(diào)節(jié)600納米波長處吸光值至0. 2,30°C、280r/min過夜培養(yǎng)。用分光光度計監(jiān)測 菌液600納米波長處吸光值，至該吸光值到1. 3-1. 5 (菌體處于對數(shù)生長期）后，將菌液轉 移至50毫升滅菌的離心筒中，1500g、4°C離心5分鐘，棄上清，沉淀用40毫升冰預冷的無 菌水重懸菌體；1500g、4°C離心5分鐘，棄上清，沉淀再次用40毫升冰預冷的無菌水重懸菌 體；1500g、4°C離心5分鐘，棄上清，沉淀用20毫升1摩爾冰預冷的滅菌山梨醇重懸菌體； 1500g、4°C離心5分鐘，沉淀用600微升1摩爾冰預冷的滅菌山梨醇重懸菌體，于冰上分裝， 每支80-100微升，現(xiàn)用現(xiàn)做，不能凍存。
[0072] 畢赤酵母電轉化PichiaPink?Strain I感受態(tài)細胞的方法和電轉條件如下：將 80-100微升電轉化畢赤酵母PichiaPink?Strain I細胞與5-10微克線性化質(zhì)?；旌虾筠D 移至冰預冷的2毫米電轉杯中，于冰上放置5分鐘，使用Gene Pu Iser Xcell電轉儀電轉 化DNA，電轉條件為：1500伏，25微伏，200歐。電轉后迅速加入1毫升冰預冷的酵母浸出粉 胨葡萄糖山梨醇緩沖溶液輕輕混勻后于24-30°C靜置至少2小時，取100-300微升涂布于畢 赤酵母腺嘌呤缺陷平板或含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，于30°C培養(yǎng) 5-6 天。
[0073] 漢遜酵母的轉化亦采用電轉化方法。電轉化感受態(tài)細胞制備如下：挑在酵母浸出 粉胨葡萄糖培養(yǎng)平板上挑取漢遜酵母保存菌種單菌落于5毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng) 基中，37°C過夜培養(yǎng)。之后將這5毫升過夜菌液接種于300毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)至600納米波長處吸光值為1. 2?1. 5之間（約6小時），之后將該培養(yǎng)菌 液3000g、4°C離心10分鐘，加入滅菌水洗滌下沉淀（不懸），之后加入50毫升pH = 7. 5的 清洗液重懸后，于37°C、轉速為100?200r/min搖床培養(yǎng)15分鐘。之后將菌液經(jīng)3000g， 4°C離心10分鐘后，用200毫升冰預冷的STM溶液重懸，再經(jīng)3000g，4°C離心10分鐘后用 100毫升冰預冷的STM溶液重懸，之后在3000g，4°C離心10分鐘，最后加入1毫升冰預冷的 STM溶液重懸，每管60微升分裝后凍存于-80°C備用。
[0074] 漢遜酵母電轉化感受態(tài)細胞的方法和電轉條件如下：將60微升電轉化漢遜酵母 感受態(tài)細胞與1-2微克線性化質(zhì)粒混合后轉移至冰預冷的2毫米電轉杯中，于冰上放置5 分鐘，使用Gene Pulser Xcell電轉儀電轉化DNA，電轉條件為：1500伏，50微伏，129歐。 電轉后迅速加入1毫升冰預冷的酵母浸出粉胨葡萄糖緩沖溶液上下混勻3次，后于37°C靜 置培養(yǎng)2小時，取100-300微升涂布于含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板， 于37 °C培養(yǎng)3-4天。
[0075] 培養(yǎng)基：
[0076] 含0. lmg/mL卡那霉素的LB平板：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化鈉 10克，瓊脂粉15克；終濃度為0. lmg/mL的卡那霉素，加雙蒸水定容至1升。
[0077] 含0. lmg/mL氨芐西林霉素的LB平板：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯 化鈉10克，瓊脂粉15克；終濃度為0. lmg/mL的氨芐西林霉素，加雙蒸水定容至1升。
[0078] 畢赤酵母腺嘌呤缺陷篩選平板：每升含有含有硫酸銨而不含氨基酸的酵母氮堿基 13. 4g，腺嘌呤氨基酸混合物1.25g，瓊脂粉20克，生物素5毫克，10 X葡萄糖100毫升，加 雙蒸水定容至1升。
[0079] 含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板：每升含有酵母提取物10克， 蛋白胨20克，葡萄糖20克，瓊脂粉20克，終濃度為0. 2mg/mL博來霉素，加雙蒸水定容至1 升。
[0080] 甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基和甲醇復合物緩沖液培養(yǎng)基：每升包含酵母提取物10 克，蛋白胨20克，100毫摩爾pH6. 0磷酸鉀緩沖液，含有硫酸銨而不含氨基酸的酵母氮堿基 13. 4g，生物素0.004克，其中甘油復合物緩沖液中加入10 X甘油100毫升，而甲醇復合物 緩沖液中加入IOX甲醇100毫升，加雙蒸水定容至1升。
[0081] 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，葡萄糖20 克，加雙蒸水定容至1升。
[0082] 酵母浸出粉胨甘油培養(yǎng)基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，IOX甘油 100毫升，加雙蒸水定容至1升。
[0083] 酵母浸出粉胨甲醇培養(yǎng)基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，IOX甲醇 100毫升，加雙蒸水定容至1升。
[0084] 轉化效率：
[0085] 重組質(zhì)粒轉化實驗每個轉化均獨立進行三次平行實驗。轉化效率使用每微克線性 化DNA轉化后所產(chǎn)生的克隆形成單位來表示。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5. 0軟件統(tǒng)計分析。 [0086] 綠色灰光蛋白檢測：
[0087] 取10微升酵母培養(yǎng)物涂片，用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達，使用油鏡 100X拍照保存。
[0088] 蛋白免疫印跡檢測方法如下：
[0089] 酵母培養(yǎng)物樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠（分離膠質(zhì)量濃度為12% )電泳分離后 使用Bio-Rad半干轉膜儀300毫安恒流條件下轉聚偏二氟乙烯膜1小時。封閉液（每升含 脫脂奶粉50克）封閉1小時，鼠抗人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白LlIgG2a單克隆抗體 一抗孵育1. 5小時，用Tris鹽-吐溫20緩沖液洗膜三次，每次5分鐘；之后用辣根過氧化 物酶標記的兔抗鼠 IgG二抗孵育1小時，T ris鹽-吐溫20緩沖液洗膜三次，Tris鹽緩沖 液洗膜兩次，每次5分鐘，加入Pi erce'ECL顯色底物孵育1?2分鐘后，用X光片曝光顯 色。
[0090] 實施例：用于異源蛋白表達的通用載體在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母和漢遜酵母中的應 用方法
[0091] 1)漢遜酵母核糖體DNA及自主復制序列元件對質(zhì)粒在畢赤酵母和漢遜酵母細胞 中轉化效率的作用分析
[0092] ①重組質(zhì)粒 pHanMOX-rDNA 和 pHanMOX-HARS 構建
[0093] 用限制性內(nèi)切酶Sal I單酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后以T4連接 酶16°C連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含〇. lmg/mL卡那霉素的LB平板， 提取質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒為pHanMOX-rDNA。酶切反應體系為：質(zhì)粒pHanMOX-GFP O^yg/yl 15微升，Sal I 1微升，IOXH buffer 4微升，雙蒸水20微升。連接反應體系 為：質(zhì)粒 pHanMOX-rDNAO. 45 μ g/ μ 1 4 微升，10 X T4buffer 1 微升，T4 連接酶 0. 5 微升，雙 蒸水4. 5微升。
[0094] 用限制性內(nèi)切酶Nde I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pThioHisA所得Trx基因片段，與 同樣雙酶切質(zhì)粒PRMHP2. 1所得載體以T4連接酶16°C連接過夜，轉化、涂板，提取質(zhì)粒酶切 鑒定。
[0095] 質(zhì)粒pThioHisA的酶切反應體系為：質(zhì)粒pThioHisA 0· 47 μ g/μ 1 15微升，N de I 1微升，EcoR I 1微升，10XH buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0096] 質(zhì)粒pRMHP2. 1的酶切反應體系為：質(zhì)粒pRMHP2. KX 36 μ g/ μ 1 15微升，Nde I 1 微升，EcoR I 1微升，10XH buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0097] 連接反應體系為：Trx基因片段3. 2微升，質(zhì)粒載體pRMHP2. 10. 8微升， 10XT4buffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水4. 5微升。Trx基因片段與質(zhì)粒載體 PRMHP2. 1的連接摩爾濃度比為1:3。
[0098] ②重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HAR S分別轉化畢 赤酵母和漢遜酵母轉化效率比較
[0099] 質(zhì)粒pHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA用限制性內(nèi)切酶Afl II線性化，質(zhì)粒 PHanMOX-HARS用限制性內(nèi)切酶Nde I線性化，于37°C水浴中酶切3小時，線性化產(chǎn)物 用1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，測DNA濃度。分別取等量（其中含線性化質(zhì)粒2? 3微克）的線性化質(zhì)粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HARS電轉化畢赤酵母 PichiaPink?Strain I感受態(tài)細胞，涂含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板， 30°C培養(yǎng)5-6天；再分別取等量的線性化質(zhì)粒電轉化漢遜酵母感受態(tài)細胞，涂板，37°C培養(yǎng) 3-4天。待菌落長出后，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，結果以每微克線性化DNA所轉化出的菌落個 數(shù)顯示。分別進行三次獨立轉化實驗，實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件分析，以直方統(tǒng)計 圖顯示。
[0100] ③重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanMOX-GFP、pHanMOX-rDNA和pHanMOX-HAR S經(jīng)牛小腸堿 性磷酸酶處理后和未經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒分別轉化畢赤酵母和漢遜酵母的轉 化效率比較
[0101] 質(zhì)粒pHanMOX-GFP和pHanMOX-rDNA用限制性內(nèi)切酶Afl II線性化，質(zhì)粒 pHanMOX-HARS用限制性內(nèi)切酶Nde I線性化，于37°C水浴中酶切3小時，線性化產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，測DNA濃度。分別取一定量的線性化質(zhì)粒（其中含線性化 質(zhì)粒5?6微克），用牛小腸堿性磷酸酶37°C處理30分鐘后回收，測DNA濃度。之后，分 別取未經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理和經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的等量（其中含線性化質(zhì)粒 2?3微克）線性化質(zhì)粒電轉化畢赤酵母PichiaPink?Strain I感受態(tài)細胞，涂含0. 2mg/ mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，30°C培養(yǎng)5-6天；同樣，線性化質(zhì)粒電轉化漢遜酵 母感受態(tài)細胞，涂板，37°C培養(yǎng)3-4天。待菌落長出后，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，結果以每微克 線性化DNA所轉化出的菌落個數(shù)顯示。分別進行三次獨立轉化實驗，實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件分析，以直方統(tǒng)計圖顯示。
[0102] 2)基于漢遜酵母核糖體DNA靶向的質(zhì)粒pHanMOX-GFP在畢赤酵母中介導報告基因 綠色熒光蛋白的表達
[0103] 漢遜酵母質(zhì)粒pHanMOX-GFP轉化畢赤酵母誘導表達
[0104] 質(zhì)粒pHanMOX-GFP用限制性內(nèi)切酶Afl II于37°C水浴中酶切3小時，線性化產(chǎn)物 用1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收，測DNA濃度。取20微升0. 28 μ g/ μ 1線性化質(zhì)粒 電轉化畢赤酵母PichiaPink?Strain I感受態(tài)細胞，涂板，30°C培養(yǎng)5-6天。
[0105] ①博來霉素加壓篩選整合質(zhì)粒：
[0106] 用牙簽隨機挑取平板上白色菌落（共75個）轉移至含0.2mg/mL博來霉素的酵 母浸出粉胨葡萄糖平板上30°C培養(yǎng)3-4天，之后相繼對應轉移至含0. 5mg/mL博來霉素、含 lmg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板上，分別于30°C培養(yǎng)3-4天。挑取不同博來霉 素濃度的酵母浸出粉胨葡萄糖平板各自10個單菌落進行表達。重組菌單菌落接種于5毫 升甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基中，30°C、280r/min過夜培養(yǎng)。24小時后，各取1毫升誘導前菌 液保存，換為5毫升甲醇復合物緩沖液培養(yǎng)基進行誘導表達。誘導后24小時取樣，檢測綠 色熒光蛋白表達。
[0107] ②博來霉素不加壓連續(xù)傳代后再經(jīng)博來霉素抗性篩選整合質(zhì)粒：
[0108] 隨機從線性化質(zhì)粒pHanMOX-GFP轉化畢赤酵母PichiaPink?Strain I平板上 挑取5個單菌落于5毫升甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基中，30 °C、280r/min培養(yǎng)48小時后，各 取50微升菌液涂布含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板（板1-5 :第一次傳 代誘導），同時，取菌液以1 :1〇的比例轉接至新鮮的5毫升甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基中于 30°C、280r/min培養(yǎng)48小時后，同樣按之前的涂布、轉接與培養(yǎng)操作，重復兩個循環(huán)。獲得 板6-10(第二次傳代）以及板11-15(第三次傳代）。分別隨機從各板中各挑取2個菌落進 行誘導表達，誘導后24小時的樣品進行綠色熒光蛋白檢測。
[0109] 3)考察畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子、翻譯延伸因子l-α啟動子以及漢遜酵母甲 醇甲醇氧化酶啟動子在畢赤酵母和漢遜酵母中表達綠色熒光蛋白的能力
[0110] ①重組畢赤酵母質(zhì)粒PPinkAOXl-GFP構建
[0111] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I分別雙酶切綠色熒光蛋白核苷酸片段擴增產(chǎn) 物（編碼綠色熒光蛋白基因的核苷酸序列見SEQ ID NO. 1，綠色熒光蛋白基核苷酸片段擴增 引物見SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3;核苷酸片段擴增綠色熒光蛋白基因以質(zhì)粒p⑶NA3-GFP 為模板，擴增反應條件為：95°C，預變性5分鐘，之后95°C，變性30秒；52°C，退火30秒； 72°C，延伸1分鐘；72°C，再延伸10分鐘，共30個循環(huán)）和畢赤酵母質(zhì)粒pPink-LC，酶切產(chǎn) 物回收后，綠色熒光蛋白基因片段和載體PPink-LC按一定比例，以T4連接酶16°C連接過 夜，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含0. lmg/mL氨芐西林美素的LB平板，篩選陽性 克隆，酶切鑒定正確的質(zhì)粒為pPinkAOXl-GFP。
[0112] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I分別雙酶切綠色熒光蛋白核苷酸片段擴增產(chǎn) 物酶切反應體系為：綠色熒光蛋白核苷酸片段擴增產(chǎn)物0.08 μ g/μ 1 20微升，EcoR I 1微 升，Kpn I L 5微升，10XM buffer 5微升，雙蒸水22. 5微升。
[0113] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I分別雙酶切畢赤酵母質(zhì)粒pPink-LC酶切反應 體系為：pPink-LC 0.40 μ g/μ 1 20 微升，EcoR I 1 微升，Kpn I 1.5 微升，10XM buffer 5微升，雙蒸水22. 5微升。
[0114] 連接反應體系為：綠色熒光蛋白基因4微升，pPink-LC 1微升，10XT4b uffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水3. 5微升；其中，綠色熒光蛋白基因片段和質(zhì)粒載體 pPink-LC的連接摩爾濃度比為1:3。
[0115] ②重組畢赤酵母質(zhì)粒pPinkTEFl-GFP構建
[0116] 用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I雙酶切消化PTEF1-pMDl8-T載體所得片段 Ptefi，與同樣雙酶切消化質(zhì)粒PPinkAOXl-GFP所得載體以T4連接酶16°C連接過夜，轉化、涂 板，提取質(zhì)粒酶切鑒定。
[0117] 酶切質(zhì)SpTEF1-pMD?18-T 反應體系為：質(zhì)粒 Ptefi-pMD*18-T 0.433 yg/ μ 115微升，Bgl II 1微升，EcoR I 0· 7微升，IOXH buffer 5微升，雙蒸水28. 3微升。
[0118] 酶切質(zhì)粒 pPinkAOXl-GFP 反應體系為：質(zhì)粒 pPinkAOXl-GFP 0.733 以8/^115微 升，Bgl II 1微升，EcoR I 0· 7微升，IOXH buffer 5微升，雙蒸水28. 3微升。
[0119] 連接反應體系為：PTEF1基因1微升，質(zhì)粒pPink-GFP 1微升，10XT4bu ffer 1微 升，T4連接酶1微升，雙蒸水6微升；其中，Ptefi基因片段和質(zhì)粒載體pPink-GFP的連接摩 爾濃度比為1:3。
[0120] ③重組畢赤酵母質(zhì)粒pPinkMOX-GFP構建
[0121] 用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切質(zhì)粒pHanM0X_GFP所得片段 Pmot-GFP-M0XTT，與同樣雙酶切畢赤酵母質(zhì)粒PPink-LC所得載體以T4連接酶16°C連接 過夜，轉化、涂含〇. lmg/mL的氨節(jié)西林霉素平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒為 pPinkMOX-GFP〇
[0122] 酶切質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 反應體系為：質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 0. 633 μ g/ μ 1 15 微升， Bgl II 1微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0123] 酶切質(zhì)粒 pPink-LC 反應體系為：質(zhì)粒 pPink-LC 0.733 μ g/μ 1 15 微升，Bg I II 1 微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0124] 連接反應體系為：pMOX-GFP-MOXTT 4 微升，質(zhì)粒 pPink-LC 1 微升，10XT4buffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水3. 5微升；其中，pMOX-GF P-MOXTT片段和質(zhì)粒載體 pPink-LC的連接摩爾濃度比為1:3。
[0125] ④重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanAOXl-GFP構建
[0126] 用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切消化載體質(zhì)粒pPinkAOXl-GFP，回收片段 PA<m-GFP-CYC1TT后與同樣雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP所得載體以T4連接酶16°C連接過夜， 轉化、涂布含0. lmg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定。
[0127] 酶切質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 反應體系為：質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 0. 25 μ g/ μ 1 20 微升， Bgl II 1微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 5微升，雙蒸水23微升。
[0128] 酶切質(zhì)粒 pPinkAOXl-GFP 反應體系為：質(zhì)粒pPinkAOXl-GFP 0· 35 μ g/ μ 120 微升， Bgl II 1微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 5微升，雙蒸水23微升。
[0129] 連接反應體系為：PAm-GFP-CYClTT 2微升，質(zhì)粒載體pHan 1. 26微升， 10XT4buffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水5. 24微升；其中，片段Pmxi-Gfp-CYCITT 和質(zhì)粒載體PHan的連接摩爾濃度比為1:3。
[0130] ⑤重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanTEFl-GFP構建
[0131] 用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切質(zhì)粒pPinkTEFl-GFP載體所得片段 Ptef1-GFP-CYC1TT與同樣雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP所得載體以T4連接酶16°C連接過夜，轉 化涂布含0. lmg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定。
[0132] 酶切質(zhì)粒 pPinkTEFl-GFP 反應體系為：質(zhì)粒 pPinkTEFl-GFP 0.467 以8/^115微 升，Bgl II 1微升，BamH I 1微升，IOXK buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0133] 酶切質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 反應體系為：質(zhì)粒 pHanMOX-GFP 0. 333 μ g/ μ 1 15 微升， Bgl II 1微升，BamH I 1微升，IOXK buffer 4微升，雙蒸水19微升。
[0134] 連接反應體系為：Ptef1-GFP-CYC1TT 2微升，質(zhì)粒載體pHan 1. 2微升， 10 X T4buffer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水5. 3微升，其中，片段Ptefi-Gfp-CYCITT和 質(zhì)粒載體PHan的連接摩爾濃度比為1:3。
[0135] ⑥利用畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子、翻譯延伸因子l-α啟動子以及漢遜 酵母甲醇氧化酶啟動子分別在畢赤酵母和漢遜酵母中表達綠色熒光蛋白。重組質(zhì)粒 pPinkAOXl-GFP、pPinkTEFl-GFP、和 pPinkMOX-GFP 經(jīng)限制性內(nèi)切酶 S pe I 線性化，重組 質(zhì)粒pHanAOXl-GFP、pHanTEFl-GFP、和pHanMOX-GF P經(jīng)限制性內(nèi)切酶Af I II線性化，回收 后，線性化質(zhì)粒分別電轉化畢赤酵母Pich iaPink?Strain I和漢遜酵母感受態(tài)細胞，涂含 0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板。隨機從轉化畢赤酵母質(zhì)粒板子上各挑取 10個單克隆于5毫升甘油復合物緩沖液培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24小時后換為5毫升甲醇復合物緩 沖液誘導表達。同樣，隨機從轉化漢遜酵母質(zhì)粒板子上各挑取10個單克隆于5毫升酵母浸 出粉胨甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24小時后換為5毫升酵母浸出粉胨甲醇培養(yǎng)基誘導表達，取誘 導后24小時菌液檢測綠色熒光蛋白表達情況。
[0136] 4)應用所構建的基于漢遜酵母核糖體DNA、自主復制序列和畢赤酵母醇氧化酶1 型啟動子的通用載體pHanA0Xl-HPV16Ll在畢赤酵母和漢遜酵母中穿梭表達人乳頭瘤病毒 16型主要衣殼蛋白L1。
[0137] ①重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl_HPV16Ll的構建，包括如下步驟：
[0138] 步驟（1)，用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP，得到pHan 載體；
[0139] 步驟（2)，用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I雙酶切消化載體質(zhì)粒pPinkAO X1-HPV16L1，回收片段？_1-即￥161^1-0￥(：11'1'后與步驟（1)所得pHan載體以T4連接酶16°C 連接過夜，轉化并涂布含〇. lmg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組漢遜 酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll，該質(zhì)粒即為通用載體。
[0140] 所述的步驟（1)中的酶切反應體系為質(zhì)粒pHanMOX-GFP 0.25 μ g/μ 1 20微升， Bgl II 1微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 5微升，雙蒸水23微升。
[0141] 所述的步驟（2)中的酶切反應體系為質(zhì)粒pPinkA0Xl-HPV16L10. 35 μ g/ μ 120微 升，Bgl II 1微升，BamH I 1微升，10ΧΚ buffer 5微升，雙蒸水23微升。
[0142] 所述的連接反應體系為PAQX1-HPV16L1-CYC1TT片段2微升，pHan載體1. 26 微升，10XT4bufTer 1微升，T4連接酶0. 5微升，雙蒸水5. 24微升；其中，所述的 Paqxi-HPV16L1-CYC1TT片段與pHan載體的連接摩爾濃度比為1:3。
[0143] 所述的含0. lmg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物質(zhì)：每升含胰蛋白胨10克，酵 素提取物5克，氯化鈉10克和瓊脂粉15克；還包括終濃度為0. lmg/mL的卡那霉素。
[0144] 所述的提取質(zhì)粒酶切鑒定的具體操作方法為，質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll用限制 性內(nèi)切酶Sac I于37°C水浴鍋中酶切1小時候，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，顯示于 2470個堿基長度的地方有一條帶則表明質(zhì)粒構建正確，其中酶切鑒定反應體系為：質(zhì)粒pH &11八(《1-即￥161^0.36 48/^12微升，53(3 10.2微升，10\1^131^€61'1微升，雙蒸水6.8 微升。
[0145] ②重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanAOXl-HPV16Ll轉化畢赤酵母和漢遜酵母指導人乳頭瘤 病毒16型主要衣殼蛋白Ll的表達
[0146] 重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanAOXl_HPV16Ll轉化畢赤酵母和漢遜酵母來指導人乳頭瘤 病毒16型主要衣殼蛋白Ll表達，具體方法為：重組漢遜酵母質(zhì)粒pHa nAOXl-HPV16Ll經(jīng)限 制性內(nèi)切酶Afl II消化后轉化畢赤酵母，重組克隆子經(jīng)過無博來霉素加壓的連續(xù)培養(yǎng)后再 經(jīng)博來霉素加壓篩選的過程，隨機挑取6個單克隆重組子經(jīng)甲醇誘導表達人乳頭瘤病毒16 型主要衣殼蛋白Ll蛋白。
[0147] 指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll的表達方法為：
[0148] 漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanAOXl-HPV16Ll經(jīng)Af I II線性化后電轉化畢赤酵母 Pink?Strain I及漢遜酵母細胞，涂布含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板， 分別于30°C和37°C培養(yǎng)；待菌落長出后，分別從四個平板上各挑取3個菌落進行非抗性壓 力下的連續(xù)傳代，共重復轉接培養(yǎng)5次，將第六次轉接培養(yǎng)24小時后的菌液于含0. 2mg/mL 博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板劃線，培養(yǎng)后分別隨機挑取各平板上的6個菌落進行 誘導表達，誘導24小時后的酵母培養(yǎng)物進行蛋白免疫印跡檢測人乳頭瘤病毒16型主要衣 殼蛋白Ll的表達。
[0149] 本發(fā)明所述編碼綠色熒光蛋白基因的核苷酸序列及上述的引物的序列如表1所 不O
[0150] 表1序列
[0151]

【權利要求】
1. 一種在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的構建方法，其特征在 于，包括如下步驟： 步驟（1)，用限制性內(nèi)切酶你/II和I雙酶切質(zhì)粒pHanMOX-GFP，得到pHan載體； 步驟（2)，用限制性內(nèi)切酶你711和AaMl I雙酶切消化載體質(zhì)粒pPinkA0Xl-HPV16Ll， 回收片段PAQX1-HPV16L1-CYC1TT后與步驟（1)所得pHan載體以T4連接酶16°C連接過夜， 轉化并涂布含〇. lmg/mL卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組漢遜酵母質(zhì)粒 pHanA0Xl-HPV16Ll，該質(zhì)粒即為通用載體。
2. 根據(jù)權利要求1所述的在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的 構建方法，其特征在于，所述的步驟（1)中的酶切反應體系為質(zhì)粒pHanMOX-GFP 0. 25 y g/ yl 20微升，你711 1微升，I 1微升，10XK buffer 5微升，雙蒸水23微升。
3. 根據(jù)權利要求1所述的在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體 的構建方法，其特征在于，所述的步驟（2)中的酶切反應體系為質(zhì)粒pPinkA0Xl-HPV16Ll 0.35yg/yl 20微升，MI 1微升，I 1微升，10XK buffer 5微升，雙蒸水23微 升。
4. 根據(jù)權利要求1所述的在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的 構建方法，其特征在于，所述的連接反應體系為PAOT1-HPV16L1-CYC1TT片段2微升，pHan載 體1.26微升，10XT4 buffer 1微升，T4連接酶0.5微升，雙蒸水5. 24微升；其中，所述的 PAQX1-HPV16L1-CYC1TT片段與pHan載體的連接摩爾濃度比為1:3。
5. 根據(jù)權利要求1所述的在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用載體的 構建方法，其特征在于，所述的含〇. lmg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物質(zhì)：每升含胰蛋 白胨10克，酵素提取物5克，氯化鈉10克和瓊脂粉15克；還包括終濃度為0. lmg/mL的卡 那霉素，其溶劑為雙蒸水。
6. 根據(jù)權利要求1所述的在畢赤酵母和漢遜酵母中進行異源蛋白表達的通用 載體的構建方法，其特征在于，所述的提取質(zhì)粒酶切鑒定的具體操作方法為，質(zhì)粒 pHanA0Xl-HPV16Ll用限制性內(nèi)切酶Sac I于37° C水浴鍋中酶切1小時候，酶切產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳后，顯示于2470個堿基長度的地方有一條帶則表明質(zhì)粒構建正確，其中酶 切鑒定反應體系為：質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll 0. 36yg/yl 2微升，Sac I 0. 2微升，10XL buffer 1微升，雙蒸水6. 8微升。
7. 權利要求1-6任意一項構建的重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll在指導人乳頭 瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1表達中的應用。
8. 根據(jù)權利要求7所述的重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll在指導人乳頭瘤病毒 16型主要衣殼蛋白L1表達中的應用，其特征在于，重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll轉 化畢赤酵母和漢遜酵母來指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1表達，具體方法為：重組 漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll經(jīng)限制性內(nèi)切酶J/7II消化后轉化畢赤酵母，重組克隆子 經(jīng)過無博來霉素加壓的連續(xù)培養(yǎng)后再經(jīng)博來霉素加壓篩選的過程，隨機挑取6個單克隆重 組子經(jīng)甲醇誘導表達人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1蛋白。
9. 根據(jù)權利要求8所述的重組漢遜酵母質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll在指導人乳頭瘤病毒 16型主要衣殼蛋白L1表達中的應用，其特征在于，指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白 L1的表達方法為： 漢遜酵母重組質(zhì)粒pHanA0Xl-HPV16Ll經(jīng)J/7II線性化后電轉化畢赤酵母 Pink?泣rai/7 /及漢遜酵母細胞，涂布含0. 2mg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板， 分別于30°C和37°C培養(yǎng)；待菌落長出后，分別從四個平板上各挑取3個菌落進行非抗性壓 力下的連續(xù)傳代，共重復轉接培養(yǎng)5次，將第六次轉接培養(yǎng)24小時后的菌液于含0. 2mg/mL 博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板劃線，培養(yǎng)后分別隨機挑取各平板上的6個菌落進行 誘導表達，誘導24小時后的酵母培養(yǎng)物進行蛋白免疫印跡檢測人乳頭瘤病毒16型主要衣 殼蛋白L1的表達。
【文檔編號】C12N15/66GK104480131SQ201410855978
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權日:2014年12月31日
【發(fā)明者】馬雁冰, 金曉媚, 劉存寶, 姚宇峰, 楊旭, 黃惟巍, 孫文佳, 龍瓊, 李楊, 褚曉杰 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所