專利名稱：一種酵母固定化載體和制造方法
一種涉及發(fā)酵工藝的酵母載體和制造方法。在酒精和啤酒生產(chǎn)發(fā)酵過程中，使用固定化酵母是本世紀(jì)七十年代由固定化酶技術(shù)發(fā)展起來的一項新興的生物技術(shù)。由于固定化酵母可使發(fā)酵系統(tǒng)的細(xì)胞密度成倍甚至數(shù)十倍地增加，而且適于高稀釋率下操作，因而可以大幅度提高發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備生產(chǎn)能力和生產(chǎn)效率，簡化生產(chǎn)工序減輕勞動強度，使生產(chǎn)過程更穩(wěn)定和易于控制，由于上述優(yōu)點，固定化酵母技術(shù)已經(jīng)成為酒精和啤酒行業(yè)發(fā)酵技術(shù)的重要發(fā)展方向，是目前國內(nèi)外十分活躍的研究領(lǐng)域。固定化酵母技術(shù)大致可以分為吸附法和包埋法兩大類，吸附法方法簡單，對反應(yīng)器要求不高，載體材料機械強度較高，壽命較長，因而成本較低，但缺點是吸附的細(xì)胞量很低，當(dāng)醪液的環(huán)境變化時(如高流速，CO2釋放激烈，翻滾劇烈，醪液PH改變時)被吸附的細(xì)胞容易脫落，造成活性下降，且易吸附雜菌難以清除，包埋法的優(yōu)點在于細(xì)胞受載體保護(hù)不易流失，對惡劣環(huán)境抗御能力較強，可進(jìn)行專業(yè)化生產(chǎn)，但其缺點是制作過程較復(fù)雜，載體壽命不長，價格較高，且載體易喪失機械強度，堵塞管路，且使成本提高。近十幾年來，海藻酸鈣包埋法由于具有制作方便固化條件溫和，對反應(yīng)器適應(yīng)性較強，適于增殖培養(yǎng)等優(yōu)點，而被重視使用，研究者們又根據(jù)它存在的弱點，發(fā)明了增殖細(xì)胞法和添加某種材料改善凝膠理化性質(zhì)的方法，增殖細(xì)胞法是通過降低包埋細(xì)胞的初始濃度使CO2釋放變得緩和，因而延緩凝膠崩裂現(xiàn)象，但由于包埋細(xì)胞的初始濃度受到限制，而且對凝膠的磷酸鹽的穩(wěn)定，沒有明顯改善，對于添加輔助材料改善凝膠理化性質(zhì)的方法，可以使原有的海藻酸鈣包埋法得到很大進(jìn)步，但是，所有這些方法，無法從根本上解決海藻酸鈣存在的主要問題。
本發(fā)明正是為了解決上述問題而提出來的，它并不是從凝膠本身理化性質(zhì)方面出發(fā)，直接克服海藻酸鈣的弱點，而是通過把吸附和包埋兩種方法聯(lián)合起來的辦法進(jìn)行解決，這種在同一過程使用兩種方法形成統(tǒng)一的載體，聯(lián)合固定醇母細(xì)胞的技術(shù)，給固定化細(xì)胞領(lǐng)域引入新的概念，解決長期以來的難題，使固定化細(xì)胞的工程得以廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明提供的發(fā)酵過程(主要用于酒精和啤酒發(fā)酵過程)酵母固定化載體，是一種吸附了均勻分布的含酵母凝膠的海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料，其中的酵母細(xì)胞是由兩種材料同時限制固定。即酵母細(xì)胞是被海藻酸鈣凝膠和海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料聯(lián)合固定而形成的，在發(fā)酵過程中這種聯(lián)合固定化酵母既作為發(fā)酵活性主體，同時可用作游離酵母的種源。載體的固定材料之中海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料可以是開孔海綿橡膠和開孔膠乳海綿或化學(xué)纖維材料，如聚乙烯纖維，聚氯乙烯纖維，聚丙烯纖維，聚丙烯睛系纖維，乙烯醇系纖維，聚脂纖維，聚酰胺纖維，彈性纖維，含氟纖維，三乙烯基纖維，變性聚丙烯睛纖維等，上述固定化載體的制造方法是用海綿狀或纖維狀材料吸取含酵母的海藻酸鈣溶液，將該材料浸泡在氯化鈣溶液中至少24小時，海藻酸鈉交換成為海藻酸鈣凝膠，酵母細(xì)胞隨著凝膠化過程被均勻地固定在氯化鈣溶液中，即完成聯(lián)合固定化過程。海藻酸鈉溶液的濃度為1--3％(W/V)，最佳值為2％(W/V)酵母細(xì)胞含量為106-108個/毫升，最佳值為108個/毫升，氯化鈣溶液的濃度為2-10％(W/V)，該載體用于發(fā)酵過程中的用量為酒精發(fā)酵為0.5-5％(V/V)，最高用量為30％(V/V)。啤酒發(fā)酵用量為5--15％(V/V)，最高為30％(V/V)。
固化過程的具體操作步驟是用經(jīng)滅菌處理的海綿狀或纖維狀載體材料先吸取含酵母的海藻酸鈉溶液，將載體材料一塊塊地不粘連地投入氯化鈣溶液中，使海藻酸鈉在載體內(nèi)交換成海藻酸鈣凝膠，酵母細(xì)胞隨凝膠化過程被均勻地固定在統(tǒng)一的載體中，在氯化鈣溶液中，載體材料至少浸泡24小時即可完成凝膠化過程浸泡完畢用無菌清水清洗3次，即可投入發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，也可以直接投入發(fā)酵階段運轉(zhuǎn)，發(fā)酵過程的條件控制與常用的固定化酵母發(fā)酵技術(shù)基本一致。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的特點有三個方面首先在固定化方法操作過程中，現(xiàn)有技術(shù)是海藻酸鈉溶解后與酵母細(xì)胞懸液混合均勻，然后投入某種輔助材料(如砂粒、聚氯乙烯碎片、硅粒等)使其均勻后一起滴入或注入氯化鈣溶液中。換凝膠化，這些方法是以海藻酸鈉溶液為操作主體，即操作以液相處理為主，其它材料是輔助性的混合進(jìn)去，以改善凝膠理化性質(zhì)，本發(fā)明操作過程與上述相反，是以海綿狀或纖維狀載體塊為操作主體，即以固相操作為主，海藻酸鈉溶液是被動的被吸取的，主要不是將海藻酸鈉和載體一起傾入氯化鈣溶液中，而是將吸有海藻酸鈉溶液的載體一塊塊地投入氯化鈣溶液中進(jìn)行交換凝膠化，凝膠被限制在海綿狀或纖維狀載體結(jié)構(gòu)中，酵母細(xì)胞則隨凝膠化而被固定，凝膠固定細(xì)胞使之不能自由運動，而海綿狀或纖維狀載體結(jié)構(gòu)把凝膠限制在其內(nèi)不能散逸，酵母細(xì)胞實際上被一種包埋材料和一種吸附材料兩種材料同時限制即為聯(lián)合這兩種材料組成為統(tǒng)一載體，即為聯(lián)合載體固定化。其次，本發(fā)明固定化酵母使用形式和使用壽命的維持方式只與作為吸附材料的纖維狀或海綿狀材料質(zhì)地性能有關(guān)，而與作為包埋材料的海藻酸鈣關(guān)系不大，一般可以連續(xù)使用四年以上，效果不降，而現(xiàn)有技術(shù)中的單純的海藻酸鈣凝膠包埋，其載體使用壽命很難超過三個月。本發(fā)明的第三個特點是現(xiàn)有的其它酵母固定化方法是單純吸附形式或單純的包埋形式，而本發(fā)明是采用聯(lián)合載體的形式集合了吸附和包埋二者之長，有機結(jié)合，海藻酸鈣凝膠作包埋材料的優(yōu)點是固定條件溫和，無毒，外部細(xì)胞難以進(jìn)入凝膠內(nèi)。在聯(lián)合載體形式中，海藻酸鈣凝膠只起菌體包埋固定作用而海綿狀和纖維狀物體承擔(dān)外形支持，機械強度，和使用壽命的維持，在使用過程中，可以避免海藻酸鈣凝膠的致命弱點，即因CO2釋放激烈而崩解，和因磷酸鹽不穩(wěn)定性而喪失機械強度，海藻酸鈣凝膠受到海綿塊或纖維狀材料的保護(hù)和支持，即使崩裂和喪失機械強度仍可有效地被吸附載留在海綿狀或纖維狀物體中繼續(xù)發(fā)揮效用，可以避免單純吸附法的吸附率不高抗雜菌能力弱的缺點，又可以避免單純的凝膠包埋法載體壽命短的缺點，而表現(xiàn)出獨有的優(yōu)勢。另外，本發(fā)明涉及的載體在發(fā)酵中遷到雜菌污染，機械故障，或水電受阻對載體清洗除雜菌及活化等工作比現(xiàn)有技術(shù)更方便。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的突出效果，在4×7.5M3規(guī)模的試驗車間試驗和日產(chǎn)24噸酒精的大生產(chǎn)車間試產(chǎn)，結(jié)果可以體現(xiàn)對比表示如下
4×7.5M3試驗車間試驗結(jié)果
結(jié)果表明，單純凝膠包埋使用15天后活性已開始下降，而聯(lián)合固化使用120天后仍能保持活性不降。
日產(chǎn)24噸酒精大生產(chǎn)車間試產(chǎn)結(jié)果如下表
結(jié)果表明，雖然聯(lián)合固定化酵母投放量僅為的0.4％但卻能提高生產(chǎn)能力，16％縮短時間30％，同時降低了原料單耗據(jù)統(tǒng)計全期成熟醪酒份平均提高0.48％(V/V)，設(shè)備利用率提高30--35％，增加產(chǎn)值150萬元，增加稅利54萬元，而聯(lián)合固化酵母的成本投入僅為7萬元，效益十分顯著。
實施例1聯(lián)合固定化酵母發(fā)酵甘蔗稀糖密快速生產(chǎn)酒精。
一、材料1)菌種AS2.1190酵母菌株，由中科院微生物所供應(yīng)。
海藻酸鈉，福建廈門冷凍廠生產(chǎn)食用級。
2)海綿30×30×30正方體3)氯化鈣化學(xué)純4)油酸化學(xué)純5)吐溫80化學(xué)純6)培養(yǎng)基1)試管斜面固體培養(yǎng)基，常用米曲汁培養(yǎng)基2)三角瓶液體培養(yǎng)基酵母浸出汁0.3％，尿素0.3％蔗糖10％，磷酸二氫鉀0.2％，碳酸鎂0.051％，PE4.5--5.0用硫酸調(diào)節(jié)，滅菌1公斤/cm330分鐘。
3)增值液體培養(yǎng)基用三角瓶液體培養(yǎng)基4)發(fā)酵稀糖密55B力酸化6小時，稀釋24--26B力含糖17％左右(普通甘蔗糖廠付產(chǎn)品)磷酸二氫鉀0.5％，尿素0.025％，硫酸鎂0.02％。
7)發(fā)酵反應(yīng)器120×450標(biāo)本瓶，內(nèi)裝不銹鋼阻隔網(wǎng)(用于把載體限制在發(fā)酵醪液面以下，確保其作用)8)儀器設(shè)備常用微生物培養(yǎng)基和化學(xué)分析儀器設(shè)備有電爐、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、顯微鏡等。
二、方法(一)包埋固化母液的配制菌液培養(yǎng)取試管斜面母種一支，轉(zhuǎn)管一批試管斜面生產(chǎn)種30℃恒溫培養(yǎng)24小時，取培養(yǎng)好試管生產(chǎn)種一支，接種入500毫升三角瓶(內(nèi)含300ml液體培養(yǎng))30℃旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為60--80轉(zhuǎn)/分)約24小時即成熟備用。并取樣檢查酵母生長情況，要求含酵母1.2--1.5億個/毫升，出芽率20--30％，無雜菌污染即可使用。
母液配制稱取海藻酸鈉20克，用無菌水500毫升溶解完全后，加入菌液250ml，10毫升，油酸和5毫升，吐溫80，攪拌均勻后，加入無菌水至容積1000毫升，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣闯砂窆袒敢海鞣N材料的使用濃度為海藻酸鈉2％，酵母菌懸液25％吐溫800.5％油酸 1.0％(二)聯(lián)合固定酵母交換液的配制稱取氯化鈣200克，用無菌水溶解，定容至2000毫升，配成10％濃度氯化鈣溶液。
海綿塊的準(zhǔn)備取30×30×30mm3/塊規(guī)格的海綿塊20塊，用自來水清洗3次，脫水干燥后105℃下蒸汽滅菌30分鐘，無菌條件下冷卻至室溫并脫去殘留水分備用。
聯(lián)合固定化在無菌操作下，將處理好的海綿塊，一塊一塊地吸取包埋母液至飽和狀態(tài)，然后小心投入交換液中，必須使海綿塊浸于液面之下，全部海綿塊操作完畢后，在交換液中繼續(xù)浸泡約24小時后，海綿中的海藻酸鈣凝膠，酵母細(xì)胞受到凝膠和海綿塊的雙重固定，浸泡交換完畢后，取出海綿塊，用無菌水清洗3次，即可用于發(fā)酵過程，亦可用2％氯化鈣溶液，常溫下保存一個月活性良好?；钚暂d體按1∶1體積生理鹽水浸泡常溫下保存15天，4℃下保存二個月至半年。
聯(lián)合固定化酵母適用于各種反應(yīng)器和不同的工藝要求，進(jìn)行發(fā)酵工藝。
實施例2聯(lián)合固定化酵母發(fā)酵12°麥芽汁快速生產(chǎn)啤酒。
一、材料1)菌種M1G2.101酵母菌株，廣東省微生物研究所菌種保藏中心保存。
2)海藻酸鈉青島市生產(chǎn)，食用級。
3)聚丙烯化纖球規(guī)格為25，1克/個專門制造。
4)氯化鈣廣東臺山市化工廠生產(chǎn)，化學(xué)純。
5)培養(yǎng)基斜面固體培養(yǎng)基常用麥芽汁培養(yǎng)基三角瓶液體培養(yǎng)基麥汁培養(yǎng)基發(fā)酵含增殖培養(yǎng)基，12°麥汁加酒花由啤酒廠提供。
前酵反應(yīng)器1)前酵反應(yīng)器3000ml三角瓶，內(nèi)設(shè)不銹鋼限制網(wǎng)用以限制載體于液面以下，以載體靠近瓶底為宜，用棉紗塞外包錫紙封口。
2)后酵反應(yīng)器2000ml抽濾瓶多個，內(nèi)設(shè)不銹鋼限制網(wǎng)，瓶口密封，抽濾管口用液柱保持瓶內(nèi)正壓。
二、方法聯(lián)合固定化酵母的制備(一)包埋母液的配制菌體培養(yǎng)取試管斜面母種一支轉(zhuǎn)管一批試管斜面生產(chǎn)種，25℃下恒溫培養(yǎng)24小時，取培養(yǎng)生產(chǎn)良好的試管生產(chǎn)種一支，接種入500毫升三角瓶(內(nèi)含300毫升麥汁培養(yǎng)基)20℃旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(60--80轉(zhuǎn)/分)約24小時，即成熟備用。
母液的配制稱取海藻酸鈉20克，用50毫升無菌水溶解后，加入培養(yǎng)成熟的酵母菌液250毫升，充分?jǐn)嚢瑁鶆蚣闯砂窆袒敢?，其中海藻酸鈉濃度為2％，酵母菌液為25％。
(二)聯(lián)合固定酵母交換液的配制稱取氯化鈣100克，用無菌水溶解定容至2000毫升，使之成為5％氯化鈣溶液。
化纖球的準(zhǔn)備取50個化纖球，用自來水煮沸清洗，再用蒸餾水清洗一次，脫水后105℃滅菌60分鐘，取出冷卻至常溫，脫去殘留水份。
聯(lián)合固定在嚴(yán)格無菌操作下，將處理好的化纖球一個一個地吸取母液，至飽和狀態(tài)，小心投入交換液中，必須使化纖球整個浸于液面以下，全部化纖球操作完畢后，在交換液中繼續(xù)浸泡24小時，使化纖球內(nèi)的海藻酸鈉全部交換成海藻酸鈣凝膠，浸泡交換結(jié)束后，取出載體用無菌水清洗2次，再用無菌水浸泡30分鐘，并重復(fù)兩次，使殘留Na+，Ca+等全部清除，整個固化過程要求環(huán)境溫度不高于l5℃，聯(lián)合固定化完成后，載體可直接投入發(fā)酵階段亦可用稀麥汁在0--2℃下保存一至三個月再使用。
用這種特制的化纖球制成的聯(lián)合固定化酵母載體，發(fā)酵，從各方面都優(yōu)于海綿載體的性能。
實施例3聯(lián)合固定化酵母淀粉水解糖快速生產(chǎn)酒精一、材料1)菌種MIG2.44(南陽1308)酵母菌株．廣東省微生物研究所供2)海藻酸鈉福建省廈門冷凍廠生產(chǎn)食用級3)聚氯乙烯纖維塊逢松狀150×50×10mm3片長方體專門訂造4)氯化鈣廣東省臺山市化工廠生產(chǎn)，化學(xué)純5)油酸吐溫8O廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)化學(xué)純6)培養(yǎng)基試管斜面固體培養(yǎng)基米 汁瓊脂培養(yǎng)基，三角瓶液體培養(yǎng)基酵母膏，葡萄糖培養(yǎng)基，增殖液體培養(yǎng)基同實例2發(fā)酵培養(yǎng)基木茨淀粉糖化醪，酒精廠提供，糖化1--2小時，冷卻至28--30℃營養(yǎng)鹽量同常規(guī)法。7)發(fā)酵反應(yīng)器7.51小型發(fā)酵缸，內(nèi)設(shè)載體阻隔網(wǎng)8)儀器設(shè)備常用微生物培養(yǎng)和化學(xué)分析儀器設(shè)備二、方法1)包埋固化母液的制備(同實施例一)
2)聯(lián)合固定酵母交換液的配制(同例一)纖維塊的準(zhǔn)備取纖維塊10塊，用自來水清洗干凈，脫水后，105℃下蒸汽滅菌30分鐘，無菌條件下，冷卻至室溫并脫去殘留水分，備用。
聯(lián)合固定化在無菌操作下，將準(zhǔn)備好的纖維塊一塊一塊地吸取包埋母液，然后小心投入交換液中，必須使纖維塊全部浸于液面之下，全部纖維塊操作完畢后，在交換液中繼續(xù)浸泡24小時，纖維塊中的海藻酸鈉全部交換成海藻酸鈣凝膠，其中酵母細(xì)胞受到凝膠和纖維塊結(jié)構(gòu)的雙重固定，浸泡交換完畢后，取出海綿塊用無菌水清洗3次，即可用于發(fā)酵過程亦可用2％氯化鈣溶液常溫下浸泡，保存一個月活性良好。
這種聯(lián)合固定化酵母載體，可用于發(fā)酵工藝中。
權(quán)利要求
1.一種用于發(fā)酵過程的酵母固定化載體，該載體是一種有彈性的固體材料，其特征在于吸附了均勻分布的含酵母海藻酸鈉凝膠的海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)的材料，其中所含的酵母細(xì)胞是由兩種材料同時限制固定，即酵母細(xì)胞是被海藻酸鈣凝膠和海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料聯(lián)合固定而形式的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的載體，其特征在于載體的固定材料海綿或纖維狀結(jié)構(gòu)材料，可以是開孔海綿橡膠或開孔膠乳海綿或化學(xué)纖維類材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中所述的載體，其特征在于化學(xué)纖維類材料可以是聚乙烯纖維、聚氯乙烯纖維、聚丙烯纖維、聚丙烯腈系纖維、乙烯醇系纖維、聚脂纖維、聚酰胺纖維、彈性纖維、含氟纖維、三乙烯基纖維、變性聚丙烯腈纖維。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的載體，其特征在于所述的海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料的體積可以控制在0.5--1000cm3/塊，最合適的規(guī)格為1.0--100cm3/塊。
5.一種專用于制造權(quán)利要求1中所述的載體的方法，其特征在于海綿狀或纖維狀材料吸取了含酵母的海藻酸鈉溶液，將材料浸泡在氯化鈣溶液中至少24小時，待海藻酸鈉交換成海藻酸鈣凝膠，酵母細(xì)胞隨著凝膠化過程被均勻地固定在氯化鈣溶液中，即完成聯(lián)合固定化過程，形成聯(lián)合固定化酵母載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的海藻酸鈉溶液的濃度為1--3％(W/V)，最佳值為2％(W/V)，其中酵母細(xì)胞含量為(106--109個/毫升)，最佳值為108個/毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的氯化鈣溶液的濃度為2--10％(W/V)，最佳濃度為10％(W/V)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和5中所述的載體，其特征在于該載體用于發(fā)酵過程中的用量為酒精發(fā)酵為0.5--5％(V/V)，最高為(30％(V/V)，啤酒發(fā)酵用量為5.0--15(V/V)，最高為30％(V/V)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵過程的酵母載體及制法。現(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)酵的酵母載體，是用包埋法和吸附法，存在制作復(fù)雜，載體壽命不長等缺點，本發(fā)明把包埋法和吸附法有機聯(lián)合起來，其特征在于是將吸附了含酵母的海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)的材料，在氯化鈣溶液中浸泡，使海藻酸鈉凝膠交換成為海藻酸鈣凝膠，酵母細(xì)胞通過兩種材料即酵母細(xì)胞是被海藻酸鈣凝膠和海綿狀或纖維狀結(jié)構(gòu)材料聯(lián)合固定而形成的。本發(fā)明所述的載體與現(xiàn)有技術(shù)相比具有機械強度高，壽命長，活性高和制作簡單的優(yōu)點。
文檔編號C12N11/02GK1114983SQ9511489
公開日1996年1月17日 申請日期1995年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月28日
發(fā)明者馮志雄, 黃曉維 申請人:廣東省微生物研究所