一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的dna片段及表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，是一種利用畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶DNA 片段及表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼料中大量添加亞治療量的抗生素和促生長(zhǎng)劑，造成了動(dòng)物耐藥性的產(chǎn)生。由于 這種多抗性、頑固病菌的出現(xiàn)，使傳統(tǒng)抗生素面臨巨大挑戰(zhàn)。面對(duì)未來，必須開拓全新路徑， 從自然界中尋求具有抗菌消炎、增強(qiáng)免疫力的活性物質(zhì)作為替代品已成為人們?nèi)找骊P(guān)心的 問題。我國(guó)著名的微生物學(xué)專家魏曦說過："光輝的抗生素之后的時(shí)代將是光輝的生態(tài)制劑 時(shí)代"。溶菌酶是被認(rèn)為替代抗生素的最有前途的產(chǎn)品。
[0003] 溶菌酶（lysozyme)又稱脆壁質(zhì)酶或N-乙酰壁質(zhì)聚糖水解酶，能降解細(xì)菌細(xì)胞壁 中N-乙酞胞壁酸和N-乙酞氨基葡糖之間的0 -1，4糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁，使得細(xì)菌由 于滲透溶解而死亡。對(duì)溶菌酶的研宄首先是從尼科遼（Nicolle) 1907年發(fā)表枯草芽孢桿菌 溶解因子的報(bào)告開始的。兩年后，拉希琴科（Laschtscbenko)指出，雞蛋清有強(qiáng)抑菌作用， 是酶作用的結(jié)果。1922年，弗來明（Fleming)發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚也有強(qiáng)力的溶菌活 性，因其具有溶菌作用，被命名為溶菌酶。溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在動(dòng)物 體內(nèi)主要存在于唾液、組織液和雞蛋清中，而在蛋清中溶菌酶約占總蛋白的3. 5%，是目前 溶菌酶制劑的主要來源之一。作為一種天然的抗菌劑，溶菌酶無(wú)毒、無(wú)害、安全性高，故在食 品領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。
[0004] 根據(jù)溶菌酶氨基酸序列和底物的差異，可以將溶菌酶大致分為3種類型：c型（雞 蛋清溶菌酶）、g型（鵝蛋清溶菌酶）和噬菌體溶菌酶。迄今為止，生產(chǎn)上應(yīng)用最多的是雞 蛋清溶菌酶（hen egg white Isozyme)。雞蛋清中溶菌酶的含量很豐富，約占蛋清總蛋白的 3.4% -3. 5%，作為溶菌酶類的典型代表，是結(jié)構(gòu)了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129個(gè) 氨基酸，分子量約為14, 300Da，雞蛋清溶菌酶具有的廣譜抗性使其在食品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域早 已得到廣泛地應(yīng)用。溶菌酶制劑能有效防止球蟲病，飼喂小麥基礎(chǔ)日糧的雞，添加和不添加 酶對(duì)球蟲病的應(yīng)激呈現(xiàn)不同的反應(yīng)，對(duì)照組雞生長(zhǎng)被抑制52. 5%，而加酶組為30. 5%，而 且損傷系數(shù)要好得多。此外，溶菌酶還能改變腸道微生物群，增加腸道有益菌，使腸道內(nèi)的 胺、甲酚等有害物減少，增加機(jī)體抗病力，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。在不用任何抗生素情況下， 于肉雞飼料中添加飼用溶菌酶制劑，可促進(jìn)雞體的健康，增加體重和飼料報(bào)酬，減少死亡。 飼用溶菌酶可以促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，提高飼料的消化率，最大限度地提高飼 料原料的利用率。
[0005]目前，我國(guó)主要采用蛋廠雞蛋殼中殘留的雞蛋清為原料來生產(chǎn)雞蛋清溶菌酶，其 中相關(guān)的報(bào)道很多，有直接結(jié)晶法、親和色譜法、離子交換法、沉淀法、雙水相萃取、超濾法 等。各種方法優(yōu)缺點(diǎn)不一，產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)成本也有所不同。溶菌酶制備材料相當(dāng)有限、 來源極其困難，因原料來源受限和分離純化成本較高限制了其應(yīng)用，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)， 難于滿足越來越大的市場(chǎng)需求，因此尋找其他廉價(jià)的生產(chǎn)雞蛋清溶菌酶的途徑是非常有意 義的，近年來人們正研宄利用分子生物技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，通過發(fā)酵手段生產(chǎn)溶菌酶，將 是提高溶菌酶產(chǎn)量，降低成本的有效手段之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的正是為了克服傳統(tǒng)方法的不足，而提供一種利用重組畢赤酵母高效 表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，本方法利用基因合成技術(shù)直接獲得雞蛋清溶菌酶的CDNA序列， 應(yīng)用真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建含有相關(guān)基因的重組畢赤酵母工程菌株，在甲醇的誘導(dǎo) 下實(shí)現(xiàn)雞蛋清溶菌酶在胞外的高效表達(dá)。此方法不受原材料來源的限制，不僅能增加該溶 菌酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量和活性，還簡(jiǎn)化了后期分離純化工藝，實(shí)現(xiàn)了雞蛋清溶 菌酶的大批量工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題：
[0008] 一種DNA序列，其中編碼雞蛋清溶菌酶信號(hào)肽的DNA段是根據(jù)畢赤酵母密碼子偏 愛性優(yōu)化合成，優(yōu)化后的DNA序列如序列表1所示；
[0009] 上述利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，具體方法包括以下幾個(gè)步 驟：
[0010] (1)獲取雞蛋清溶菌酶基因lyz :根據(jù)Gene Bank中已發(fā)表的編碼具有雞蛋清溶菌 酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了雞蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根據(jù)畢赤酵母表達(dá)宿 主進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，多肽氨基酸序列如序列表2所示；
[0011] (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用酶切連接的方法分別將上述目的基因lyz與表達(dá)載體 PPIC9K相連，得到攜帶目的基因的重組表達(dá)載體pPIC9K-lyz，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證；
[0012] (3)基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株GS115 中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株；
[0013] (4)高拷貝重組子的篩選和鑒定：利用G418(氨基糖苷類抗生素）濃度梯度進(jìn)行 高拷貝重組子的篩選，再用菌落PCR方法進(jìn)一步篩選及鑒定高拷貝抗性菌株；
[0014] (5)重組雞蛋清溶菌酶的高效表達(dá)：利用甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清 溶菌酶。
[0015] 優(yōu)選的，上述一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，所用的真核 表達(dá)載體是畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K，表達(dá)宿主細(xì)胞是畢赤酵母GS115菌株。
[0016] 優(yōu)選的，上述一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，所述步驟（2) 中基因工程菌株的構(gòu)建方法中所用的內(nèi)切酶為EcoR I和Not I，50 yL酶切體系為：
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的DNA序列，其特征是，其中編碼雞 蛋清溶菌酶信號(hào)肽的DNA段是根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性優(yōu)化合成，優(yōu)化后的DNA序列如 序列表1所示。
2. -種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特征是，包括以下幾個(gè)步 驟： (1) 獲取雞蛋清溶菌酶基因lyz:根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的編碼具有雞蛋清溶菌酶蛋 白活性的多肽氨基酸序列，合成了雞蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根據(jù)畢赤酵母表達(dá)宿主進(jìn) 行了密碼子的優(yōu)化，多肽氨基酸序列如序列表2所示； (2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用酶切連接的方法分別將上述目的基因lyz與表達(dá)載體pPIC9K 相連，得到攜帶目的基因的重組表達(dá)載體pPIC9K-lyz，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證； (3) 基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株GS115中，得 到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株； (4) 高拷貝重組子的篩選和鑒定：利用氨基糖苷類抗生素G418濃度梯度進(jìn)行高拷貝重 組子的篩選，再用菌落PCR方法進(jìn)一步篩選及鑒定高拷貝抗性菌株； (5) 重組雞蛋清溶菌酶的高效表達(dá)：利用甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌 酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特 征在于：方法中所用的真核表達(dá)載體是畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K，表達(dá)宿主細(xì)胞是畢赤酵 母GS115菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特 征在于：基因工程菌株的構(gòu)建方法中所用的內(nèi)切酶為EcoRI和NotI，50yL酶切體系為：
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特 征在于：基因工程菌株的構(gòu)建方法中所10yL連接體系為：
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特 征在于，重組工程菌株GS115/pPIC9K-lyz的篩選步驟為： 將重組pPIC9k-lyz質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化后，用電穿孔法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞 內(nèi)，通過0-4. Omg/mL氨基糖苷類抗生素G418壓力篩選4mg/mLG418的轉(zhuǎn)化子被篩出，經(jīng) PCR檢測(cè)雞蛋清溶菌酶基因穩(wěn)定整合到畢赤酵母菌染色體上，挑取拷貝數(shù)高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 His+Mut+表型篩選，將最終篩選到的多拷貝轉(zhuǎn)化子命名為GS115/pPIC9k-lyz，簡(jiǎn)稱雞蛋清 溶菌酶基因工程菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其特 征在于重組雞蛋清溶菌酶的高效表達(dá)工藝為： 取GS115/pPIC9K-lyz單菌落，將酵母菌株GS115/pPIC9K、重組酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz單克隆分別接種至30mlYH)培養(yǎng)基（酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基），27-32°C， 180-220r/min培養(yǎng)18-24h，按質(zhì)量百分比10-12%的接種量分別接種至30mlBMGY培養(yǎng) 基中，其pH5. 0-6. 5,27-32°C，180-220r/min培養(yǎng)至 0D_= 2. 0-6. 0,室溫，2500-4000r/ min離心細(xì)胞5-10min;棄去上清液，用30ml初始pH值為3. 0-6. 5的BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 沉淀，以〇? 5-3. 0%甲醇，27-32°C，180-220r/min，誘導(dǎo)表達(dá)72-96h后，取誘導(dǎo)菌液1.OmL， 4°C，12000r/min離心2-5min，將菌液上清保存于-20°C待用，將誘導(dǎo)的上清進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳鑒定。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶的方法，其 特征在于，所用YH)培養(yǎng)基成分為10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，余量為蒸餾 水；BMGY培養(yǎng)基成分為10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH 5. 0-6. 5的100mm〇l/L PBS緩沖 液，13. 4g/L YNB (酵母氮源堿），4 X l(T4g/L生物素，5g/L甘油，余量為蒸餾水；BMMY培養(yǎng)基 成分為 l〇g/L 酵母粉，20g/L 蛋白胨，pH3. 0-6. 5 的 100mmol/L PBS 緩沖液，13. 4g/L YNB， 4X l(T4g/L生物素，5. 0-30mL/L甲醇，余量為蒸餾水。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，提供了一種利用重組畢赤酵母高效表達(dá)雞蛋清溶菌酶DNA片段及表達(dá)方法。本發(fā)明是利用基因合成手段直接獲得雞蛋清溶菌酶的基因，經(jīng)過酶切、連接等操作后將基因?qū)氲秸婧吮磉_(dá)載體pPIC9K中，并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中進(jìn)行高拷貝重組子的篩選，然后通過甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)重組雞蛋清溶菌酶在胞外的高效表達(dá)。本方法不受原材料來源的限制，不僅能增加該溶菌酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量和活性，還簡(jiǎn)化了后期分離純化工藝，實(shí)現(xiàn)了雞蛋清溶菌酶的大批量工業(yè)化生產(chǎn)。其產(chǎn)品具有穩(wěn)定、純凈、生物活性高的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于制藥、飼料等多個(gè)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N9-36, C12N15-81, C12R1-84, C12N15-56
【公開號(hào)】CN104694559
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510082558
【發(fā)明人】王連民, 劉珂飛, 荊瑋
【申請(qǐng)人】天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日