專利名稱：應用畢赤酵母的pGAP調控表達葡聚糖外切酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種應用畢赤酵母的pGAP啟動 子調控生產(chǎn)生物蛋白的方法，具體是一種應用畢赤酵母的pGAP調控 表達葡聚糖外切酶的方法。
背景技術：
葡聚糖外切酶(1,4-P-D-glucancellobio-hydrolase 或 exo-l，4-卩-D-glucanase,EC3.2丄91)作用于纖維素線狀分子末端，水解 |3-1， 4-D-14糖苷鍵，依次切下一個纖維二糖分子，故又稱為纖維二 糖水解酶(cellobiohydrolase)(簡稱CBH)。當葡聚糖外切酶與葡聚糖 內切酶和p-葡萄糖苷酶的協(xié)同作用下能將植物纖維素分解為葡萄糖， 葡萄糖可作為食品也可作為生物能源乙醇的原料。
葡聚糖外切酶主要來自于某些細菌、放線菌和絲狀真菌。傳統(tǒng) 上生產(chǎn)葡聚糖外切酶主要是應用天然的菌株進行發(fā)酵。但是，由于細 菌產(chǎn)生的葡聚糖外切酶是以包涵體形式存在于胞內，產(chǎn)物難于純化； 而放線菌和絲狀真菌生長緩慢，營養(yǎng)要求較高，分泌大量自身的蛋白， 生產(chǎn)成本較高。
畢赤酵母(i^&a/7WtoWs )是最近迅速發(fā)展的一種真核表達宿 主，營養(yǎng)要求不高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于Ac/z^ /7Mton'S分泌自身的蛋白很少，有利于表達產(chǎn)物的純化。近來有應用戶/c/z/fl; ^ton's的pAOXl系統(tǒng)表達葡聚糖外切酶，但pAOXl在系統(tǒng) 表達葡聚糖外切酶時需要應用甲醇為碳源，而甲醇是易揮發(fā)的有毒物 質，在生產(chǎn)中使用，容易造成環(huán)境污染；當大規(guī)模發(fā)酵時，甲醇的大 量使用具有潛在火災危險；并且，外源蛋白的生產(chǎn)周期較長。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是解決應用天然產(chǎn)葡聚糖外切酶菌株生產(chǎn)葡聚糖 外切酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化以及應用尸/c/z/a/ "stoWs的pAOXl 表達系統(tǒng)生產(chǎn)葡聚糖外切酶時需要應用毒性的甲醇為碳源的問題，為 生產(chǎn)葡聚糖外切酶提供一種應用畢赤酵母的pGAP (三磷酸甘油醛脫氫 酶啟動子)調控表達葡聚糖外切酶的方法。
本發(fā)明所采用的技術方案
一種應用畢赤酵母的pGAP調控表達葡聚糖外切酶的方法，其步 驟是
1、 首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉 化畢赤酵母基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28 30'C在生 物反應器中發(fā)酵工程菌1 2d分泌表達葡聚糖外切酶，在發(fā)酵過程中 用氨水維持pH在4 6。所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85%磷 酸25~28 ml/L， CaS04 21120 0. 8~ 1. 2g/L， K2S04 17 19 g/L, MgS04 '7H20 13 ~16g/L，KOH 3. 5~4. 5 g/L，碳源15~45g/L，蛋白胨18-22 g/L， Yeast extract 8 ~12g/L， PTM4 3~5 ml/L。所述碳源是甘油或油酸。所 述PTM4是由以下組分組成CuS04 *5H20 1. 5 ~2. 5g/L， Nal *2H20 0. 1~0. 2g/L， MnS04 H20 2. 5 ~3. 5g/L， Na2Mo04 2H20 0.1~0. 3 g/L， H3BO30.01~0. 03g/L， CoCl2 *6 H20 1. 0 ~2. 0g/L， ZnCl2 6. 5 ~7. 5g/L， Fe2(S04)3 7H2O20~25g/L，生物素0. 1~0. 3 g/L，硫酸1 ~2ml/L。
本發(fā)明采用了畢赤酵母的pGAP調控表達的葡聚糖外切酶，具有
下列優(yōu)點
1、 生產(chǎn)成本低，只需使用普通的無機鹽、碳源和氮源作為發(fā)酵
培養(yǎng)基。
2、 可在生物反應器中發(fā)酵畢赤酵母，其細胞能生長至細胞密度 達200A以上，能以足夠多的細胞數(shù)量表達葡聚糖外切酶，有利于葡 聚糖外切酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
3、 發(fā)酵周期短，整個發(fā)酵周期只需l~2d。
4、 使用無毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源。
5、 由于pGAP是畢赤酵母的強啟動子，由pGAP調控表達的葡 聚糖外切酶約占總分泌蛋白的比例較高，并且由于在葡聚糖外切酶的 C端融合了 His標簽，有利于產(chǎn)物的純化。
具體實施方式
下面才用非限定性實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例一1、 首先從尸/c/zz'a/ ostoWs中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的尸z'c/2z'a postoWs表達載體，并將這一 載體轉化P/c/2/apoyto^基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A600&1.5)接種(接種量為1/12)于液體 培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85。/。磷酸26.7ml，CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH4.13g，甘油40 g, 蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方
(每升)CuS04 '5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'1120 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生 物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚糖外切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC， pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過程中 通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵2 d后離心收 獲上清進行純化葡聚糖外切酶。 實施例二
1 、首先從尸/c/z/a;mstor/s中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的尸/c/^ ; asto^表達載體，并將這一 載體轉化p/c/w'a paston's基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；4、將工程菌株菌液(A,"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培 養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH 4.13 g，油酸20 g， 蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方 (每升)CuS04 *5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'恥3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g, H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeSCU 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚糖外 切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30。C， pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min， 通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過程中通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制 溶氧20—30%。發(fā)酵l d (30 h)后離心收獲上清進行純化葡聚糖外 切酶。
實施例三
1、 首先從尸/c/h'apostoWs中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的P/cW" pwtor&表達載體，并將這一 載體轉化A'c/h'a/7aston;s基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A6oq^1.5)接種(接種量為1/12)于液體培 養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH 4.13 g，山梨醇 35 g，蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升):CuS04 *5H2O2.0g， NaI*2H2O0.1g， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04'2H2O0.2g， H3B03 0.02 g， CoCl2 '6H2O1.05g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeS04 7 H20 11. 6 g代替)， 生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚 糖外切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C， pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min， 通氣量20-30 L/min;發(fā)酵過程中通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制 溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進行純化葡聚糖外切酶。 實施例四
1、 首先從尸/c/^/ osto^中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的Ac/H'a pwton's表達載體，并將這一 載體轉化戶/c/H'apaWon's基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A60()"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng) 基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 '21120 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH4.13g，葡萄糖40g， 蛋白胨20g, Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方
(每升):CuS04 5H20 2.0 g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS04 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml),在50 L生物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚糖外 切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC， pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min通氣量20—30L/min;發(fā)酵過程中通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制 溶氧20—30%。發(fā)酵2d后離心收獲上清進行純化葡聚糖外切酶。 實施例五
1、 首先從P/c/w'a; astor/s中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由 pGAP調控葡聚糖外切酶基因的尸/c/^ ; asto^表達載體，并將這一 載體轉化p/cfe'a pastor基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液(A6。Q"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 *2H20 0.93 g， K2S0418.2g, MgS04 7 H20 14.9 g, KOH4.13g，乳酸30 g，蛋白 胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每 升)CuS04 *5H2O2.0g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS。4 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚糖外 切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC， pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min， 通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過程中通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制 溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進行純化葡聚糖外切酶。 實施例六
1、 首先從尸/c/^posto^中擴增pGAP啟動子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構建由pGAP調控葡聚糖外切酶基因的戶/c/H'" / "Wor^表達載體，并將這一 載體轉化尸/c/^postoWs基因組；
3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株菌液(A,&1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 '2H20 0.93 g， K2S04 18.2 g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH 4.13 g，甘露醇40 g，蛋 白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方(每 升)CuS04 5H20 2.0 g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeSCW H20 11.6 g代替)，生物 素0.2g，硫酸lml)，在50 L生物反應器中進行發(fā)酵表達葡聚糖外 切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC, pH5.0，攪拌轉速200-900 r/min, 通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過程中通過調節(jié)通氣量和攪拌轉速而控制 溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進行純化葡聚糖外切酶。
權利要求
1、一種應用畢赤酵母的pGAP調控表達葡聚糖外切酶的方法，其特征在于，其具體步驟如下1)、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；2)、在葡聚糖外切酶基因序列的3’末端融合His6標簽，構建由pGAP調控葡聚糖外切酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉化畢赤酵母基因組；3)、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；4)、將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28～30℃在生物反應器中發(fā)酵工程菌1～2d分泌表達葡聚糖外切酶，在發(fā)酵過程中用氨水維持pH在4～6；所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7 H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下組分組成CuSO4·5H2O 1.5～2.5g/L，NaI·2H2O0.1～0.2g/L，MnSO4·H2O 2.5～3.5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1～0.3g/L，H3BO3 0.01～0.03g/L，CoCl2·6 H2O 1.0～2.0g/L，ZnCl2 6.5～7.5g/L，F(xiàn)e2(SO4)3·7 H2O 20～25g/L，生物素0.1～0.3g/L，硫酸1～2ml/L。
2、 根據(jù)權利要求1所述的應用畢赤酵母的pGAP調控表達葡聚 糖外切酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡 萄糖、乳酸或甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應用畢赤酵母的pGAP調控表達葡聚糖外切酶的方法，屬生物技術領域，首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；構建由pGAP調控葡聚糖外切酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉化畢赤酵母基因組；根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌分泌表達葡聚糖外切酶。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調控表達的葡聚糖外切酶有利于產(chǎn)物的純化，解決應用天然產(chǎn)葡聚糖外切酶的菌株生產(chǎn)葡聚糖外切酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化等的問題，有利于葡聚糖外切酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/81GK101624601SQ20091015923
公開日2010年1月13日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權日2009年7月30日
發(fā)明者直 屈, 屠發(fā)志, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 易國輝, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所