一種提高酶基因在酵母中高效表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶基因的表達(dá)，具體是發(fā)明了一種提高酶基因在酵母中高效表達(dá)的方法，將目的酶基因A進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，分析酶基因密碼子在酵母中合適度，選用酵母高頻密碼子，減少基因中低頻密碼子，得到優(yōu)化基因B并合成，在合成基因上游5’端加入ZhI/Ndel/Kasl/SnaBl等酶切位點(diǎn)，下游3’端加入等酶切位點(diǎn)，以便基因轉(zhuǎn))\衰達(dá)散體pPIC9K/pPIC3.5F，獲得優(yōu)化基因重組表達(dá)載體B,電轉(zhuǎn)酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定后獲取轉(zhuǎn)化子。
【背景技術(shù)】
[0002]酶作為一種生物催化劑，隨著酶基因工程技術(shù)性問題的不斷突破，因其技術(shù)先進(jìn)性，投資小，耗能低，效率高等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于輕工業(yè)的各個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域近年來，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品加工、能源開發(fā)以及環(huán)境工程方面的應(yīng)用越來越廣泛。通過對酶基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，可拓寬酶的作用范圍及其穩(wěn)定性等特性，從而使基因工程菌在同等條件下工作效率更高，節(jié)約資源和成本。
[0003]酶工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用，主要作為催化劑或添加劑使用。在食品方面，主要起催化作用，用于農(nóng)副產(chǎn)品的深加工。如利用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等對以淀粉為原料進(jìn)行生產(chǎn)高果糖漿的工業(yè)。纖維素酶、木質(zhì)素酶等用于纖維素農(nóng)副產(chǎn)品等物質(zhì)的分解與利用，保護(hù)環(huán)境，節(jié)約資源。酶工程在飼料工業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)頗為廣泛。隨著生活水平的日益提高，人們對綠色食品消費(fèi)需求逐漸增加，對畜牧業(yè)生產(chǎn)與過程中的生態(tài)環(huán)境保護(hù)日益重視，飼用酶制劑以其高效、安全、低成本等特點(diǎn)，成為了世界新型飼料添加劑研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。
[0004]酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用。以前通過化學(xué)合成、微生物發(fā)酵及生物材料提取等傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)的藥品，均可以通過現(xiàn)代酶工程產(chǎn)生，還可以獲得傳統(tǒng)技術(shù)無法獲取的昂貴藥品。如應(yīng)用酶工程生產(chǎn)抗生素和維生素等藥物。
[0005]酶工程還廣泛用于食品添加劑生產(chǎn)，不斷開發(fā)新酶源，研制新產(chǎn)品，可以降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品易純化，收率提高。如酶工程在甜味劑、調(diào)味劑、抗氧化劑中的應(yīng)用。采用低濃度的乙醇、氨基酸和溶菌酶復(fù)酶添加入食品的殺菌防腐的方法越來越受到人們的重視，并在食品加工業(yè)中廣泛推廣。隨著近年來酒精需求量的上升，固定化細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于酒精工業(yè)生產(chǎn)方面的研究也變得非?；钴S。
[0006]隨著人類社會(huì)不斷發(fā)展，工業(yè)越來越發(fā)達(dá)，環(huán)境問題變得日益嚴(yán)峻，目前，三廢工業(yè)對人們?nèi)粘Ｉ畹挠绊懺絹碓酱?，環(huán)境問題不容忽視，傳統(tǒng)化學(xué)方法的治理效果并不顯著，但酶工程治理環(huán)境卻得到了人們的青睞。如辣根過氧化物酶處理廢水，當(dāng)過氧化氫存在時(shí)，能催化多種有毒芳香族化合物，其中包括苯酚、苯胺等。微生物脂酶能催化一些列反應(yīng)，如水解、醇解、酸解、酯化和氨解等，用于處理脂加工過程中產(chǎn)生的脂廢物等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的問題是優(yōu)化酶基因，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化酶基因在酵母中的高效表達(dá)，改變酶基因某些特性，提高酶基因的pH作用范圍、熱穩(wěn)定性及酶活性等問題。獲得高效表達(dá)酶基因工程菌，解決不同產(chǎn)業(yè)中的各種問題。
[0008]本發(fā)明主要通過以下方法步驟實(shí)現(xiàn):
(I)從Genbank中下載酶編碼基因序列，獲得目的酶基因A。
[0009](2)利用分子生物學(xué)軟件Lasergene分析酶基因的堿基含量、密碼子分布情況、AT組成及GC含量等，統(tǒng)計(jì)該基因中編碼成熟肽基因序列長度，編碼各種氨基酸的數(shù)量及編碼氨基酸的密碼子，判斷其密碼子偏愛性，計(jì)算第三位密碼子GC含量。
[0010](3)根據(jù)酵母相對同義密碼子數(shù)(RSCU)值，分析酶基因密碼子在酵母中的適合度；
(4)優(yōu)化設(shè)計(jì)酶基因，選用酵母高頻密碼子，減少基因中酵母低頻密碼子，換為高頻密碼子，將基因中RS⑶值〈0.5的密碼子替換為>1的密碼子，將RS⑶值在0.5-1之間的部分密碼子替換；
(5)利用Lasergene軟件分析優(yōu)化酶基因，并進(jìn)行調(diào)整，消除AT富含區(qū)(ATTA，TATA,TTAA等)避免轉(zhuǎn)錄提前終止；
(6)利用Lasergene分析優(yōu)化酶基因的mRNA5’及3’端非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)起始密碼子的旁側(cè)序列，以避免起始密碼子包裹于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中；
(7)利用生物信息學(xué)軟件RNAstructure5.4,在線軟件GeneBee service (www.genebee.mus.su)等分析優(yōu)化后酶基因mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，計(jì)算mRNA自由能Δ G值,保證優(yōu)化后酶基因mRNA自由能(AG值)較未優(yōu)化基因mRNA自由能升高；
(8)對優(yōu)化基因按上述方法不斷調(diào)整，最終獲得優(yōu)化酶基因，根據(jù)得出的優(yōu)化基因序列，加入酶切位點(diǎn)，送專業(yè)公司合成，獲得合成基因B。
[0011](9)對合成的優(yōu)化酶基因B進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在合成基因上游5’端加入油al/Ndel/Kasl/SnaBl等酶切位點(diǎn)，下游3’端加入等酶切位點(diǎn)，以便基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體分析優(yōu)化后的基因B與原酶基因A的同源率，使其同源率達(dá)到70%以上，(G+C) %上升3-5%，密碼子第三位GC堿基含量上升13-18%。優(yōu)化后，酶基因mRNA折疊最小自由能上升>2 kcal/moL.檢查其起始密碼子旁側(cè)序列，要求起始密碼子不包裹于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。
[0012](10)克隆測序后，構(gòu)建優(yōu)化酶基因酵母表達(dá)載體B。內(nèi)切酶線性化后，電轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，經(jīng)MD/MM平板篩選，PCR檢測后，獲得陽性重組酵母。實(shí)現(xiàn)優(yōu)化酶基因B在酵母中的分泌表達(dá)。后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵，測定酶活性。
[0013]具體應(yīng)用實(shí)例:
Genbank中獲取植酸酶基因，改造中性植酸酶基因序列，根據(jù)酵母密碼子偏愛性，去掉酶基因中酵母低頻密碼子，替換為酵母高頻密碼子，獲得能在酵母中高效表達(dá)的酶優(yōu)化基因。通過去掉序列中AT富含區(qū)，自由能AG由提高2 kcal/mol，優(yōu)化后，酶基因起始密碼子并未被包裹在mRNA折疊所形成的發(fā)夾環(huán)中，構(gòu)建酶基因表達(dá)載體。經(jīng)克隆測序后，通過電轉(zhuǎn)化，篩選菌株，獲得陽性重組酵母，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化基因在酵母中的分泌表達(dá)。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵120 h后，優(yōu)化后，酶活性為優(yōu)化前的9倍，可見通過利用本發(fā)明中的優(yōu)化方法，酶活性可大幅度提聞，該方法可應(yīng)用于其它酶基因的優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)各種酶基因的聞效表達(dá)，提聞酶活，降低生產(chǎn)成本。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高酶基因高效在酵母中高效表達(dá)的方法，該方法主要包括目的酶基因的篩選，酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)確定，克隆測序后在酵母細(xì)胞中成功分泌表達(dá)，酶活性檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高酶基因高效在酵母中高效表達(dá)的方法，其特征在于:該優(yōu)化基因能在酵母中分泌表達(dá)，其PH作用范圍明顯拓寬，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，酶活性增強(qiáng)。
【專利摘要】一種提高酶基因在酵母中高效表達(dá)的方法Genbank中獲得酶基因，用Lasergene軟件分析酶基因的堿基含量、密碼子、編碼氨基酸數(shù)量等生物學(xué)信息，判斷密碼子偏愛性。根據(jù)酵母相對同義密碼子數(shù)(RSCU)值，優(yōu)化設(shè)計(jì)酶基因，選用酵母高頻密碼子，減少基因中低頻密碼子。調(diào)整優(yōu)化基因，消除AT富含區(qū)。分析酶基因的mRNA5’及3’端非翻譯區(qū)，優(yōu)化設(shè)計(jì)起始密碼子的旁側(cè)序列，避免起始密碼子包裹于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。用RNAstructure5.4，GeneBeeservice(http://www.genebee.mus.su)軟件分析優(yōu)化基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，計(jì)算mRNA自由能ΔG值。合成最終優(yōu)化基因，用相同方法分析優(yōu)化基因，在合成基因上游5’端加入XbaI/NdeI/KasI/SnaBI等酶切位點(diǎn)，下游3’端加入NsiI/NspI/KpnI/NotI等酶切位點(diǎn)后連接入pPIC9K/pPIC3.5K，獲得重組表達(dá)載體pP-B，電轉(zhuǎn)酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定后獲取轉(zhuǎn)化子。
【IPC分類】C12N15-10, C12N15-81, C12N15-55
【公開號(hào)】CN104694565
【申請?zhí)枴緾N201310653776
【發(fā)明人】鄒立扣, 龍梅, 王紅寧, 陳惠 , 吳琦, 吳國艷, 郭莉娟, 李蓓
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年12月9日